利用双抗原夹心ELISA对2009—2011年间采自广东省各地区的若干猪场的484份血清样品,进行血清流行病学调查;对69份病猪胆汁样品进行分子流行病学调查,分离得到猪源戊型肝炎病毒(swine hepatitis E virus,swHEV),并基于ORF2部分基因序列...利用双抗原夹心ELISA对2009—2011年间采自广东省各地区的若干猪场的484份血清样品,进行血清流行病学调查;对69份病猪胆汁样品进行分子流行病学调查,分离得到猪源戊型肝炎病毒(swine hepatitis E virus,swHEV),并基于ORF2部分基因序列进行核苷酸序列比对、相似性分析和遗传进化树分析,以期初步了解广东各地猪群戊型肝炎(hepatitis E,HE)的感染情况和流行特点。试验结果显示,全部被检查猪的swHEV抗体平均阳性率为71.9%(348/484),分离的猪源HEV毒株均属于基因Ⅳ型,阳性率为71.0%(49/69)。调查结果表明基因Ⅳ型swHEV在广东地区普遍流行。展开更多
建立猪戊型肝炎病毒(Swine Hepatitis E Virus,SHEV)RT-PCR检测方法,为SHEV的流行病学调查、临床诊断提供可靠的技术手段。根据SHEV的基因组序列,设计并合成2对引物,以SHEV江西分离株SHEV-JX-1为模板,对反应条件进行了优化,建立了诊断S...建立猪戊型肝炎病毒(Swine Hepatitis E Virus,SHEV)RT-PCR检测方法,为SHEV的流行病学调查、临床诊断提供可靠的技术手段。根据SHEV的基因组序列,设计并合成2对引物,以SHEV江西分离株SHEV-JX-1为模板,对反应条件进行了优化,建立了诊断SHEV的RT-PCR方法。该方法可从SHEV-JX-1中扩增出230 bp的片段,测序结果表明为SHEVⅣ型基因片段;对猪的其它病毒进行检测结果均为阴性;能检测出2.5×10-8μg的SHEV RNA;对江西部分猪场采集的胆汁及肠容物进行检测,结果胆汁中的阳性率为10%,肠容物的阳性率为4%。实验建立的RT-PCR方法具有敏感、特异、重复性好的特点,可用于SHEV的分子流行病学调查和临床快速诊断。展开更多
由于猪戊型肝炎病毒(hepatitis E virus,HEV)可跨种属感染人,因此,猪群中猪HEV感染的监测对于该病的防控和公共卫生都具有重要的意义。本试验旨在建立一种检测猪HEV抗体的间接ELISA方法,以原核表达纯化截短的猪HEV衣壳蛋白为包被抗原,...由于猪戊型肝炎病毒(hepatitis E virus,HEV)可跨种属感染人,因此,猪群中猪HEV感染的监测对于该病的防控和公共卫生都具有重要的意义。本试验旨在建立一种检测猪HEV抗体的间接ELISA方法,以原核表达纯化截短的猪HEV衣壳蛋白为包被抗原,优化条件,确定最佳试验条件,并分析该方法的敏感性、特异性、重复性,以及与商品化试剂盒的符合率,评价其临床应用价值。SDS-PAGE和Western blot结果证明抗原蛋白获得正确表达与纯化,并且具有良好的反应原性,可以作为后续建立ELISA方法的包被抗原。通过优化ELISA条件,最终确定抗原最佳包被量为200ng·孔-1,血清最佳稀释度为1∶200,包被缓冲液为碳酸盐缓冲液(pH 9.6),封闭液为2.5%的脱脂奶粉,阴阳性判定的临界值为OD450nm≥0.296。该间接ELISA方法的特异性和敏感性良好,板内和板间变异系数均小于10%,与北京万泰商品化试剂盒符合率为91.2%。临床应用表明,该方法可应用于猪HEV感染猪后抗体消长以及临床猪血清抗体的检测。因此,本研究建立的猪HEV抗体间接ELISA检测方法具有较好的敏感性和特异性,准确率较高,该方法适用于临床猪血清样品的检测和猪HEV感染血清流行病学的调查。展开更多
为获得猪戊型肝炎病毒(Hepatitis E virus,HEV)Ⅳ型衣壳蛋白单克隆抗体,将猪HEV衣壳蛋白的C端267(408—675)个氨基酸基因序列克隆入原核表达载体pET-28a(+),构建重组质粒pET-28a-ORF2-C,转化E.coli Rosetta(BL21)感受态细胞进行诱导表达...为获得猪戊型肝炎病毒(Hepatitis E virus,HEV)Ⅳ型衣壳蛋白单克隆抗体,将猪HEV衣壳蛋白的C端267(408—675)个氨基酸基因序列克隆入原核表达载体pET-28a(+),构建重组质粒pET-28a-ORF2-C,转化E.coli Rosetta(BL21)感受态细胞进行诱导表达,SDS-PAGE和Western blot鉴定,纯化后免疫小鼠。取免疫小鼠的脾脏与鼠骨髓瘤细胞SP2/0融合制备单克隆抗体。通过间接ELISA和竞争ELISA方法筛选并鉴定单抗。结果表明蛋白得到正确、高效表达,获得3株识别不同的抗原表位区的单克隆抗体,分别命名为Mab-1E4(IgG1)、Mab-2C7(IgG1)和Mab-2G9(IgG2b),其中1E4和2G9能阻断临床阳性猪血清,提示该2株单克隆抗体识别的抗原表位是猪HEVⅣ型衣壳蛋白上重要的抗原表位区,而单抗Mab-2C7不能阻断。本研究为猪HEVⅣ型的诊断及研究提供重要工具。展开更多
文摘利用双抗原夹心ELISA对2009—2011年间采自广东省各地区的若干猪场的484份血清样品,进行血清流行病学调查;对69份病猪胆汁样品进行分子流行病学调查,分离得到猪源戊型肝炎病毒(swine hepatitis E virus,swHEV),并基于ORF2部分基因序列进行核苷酸序列比对、相似性分析和遗传进化树分析,以期初步了解广东各地猪群戊型肝炎(hepatitis E,HE)的感染情况和流行特点。试验结果显示,全部被检查猪的swHEV抗体平均阳性率为71.9%(348/484),分离的猪源HEV毒株均属于基因Ⅳ型,阳性率为71.0%(49/69)。调查结果表明基因Ⅳ型swHEV在广东地区普遍流行。
文摘由于猪戊型肝炎病毒(hepatitis E virus,HEV)可跨种属感染人,因此,猪群中猪HEV感染的监测对于该病的防控和公共卫生都具有重要的意义。本试验旨在建立一种检测猪HEV抗体的间接ELISA方法,以原核表达纯化截短的猪HEV衣壳蛋白为包被抗原,优化条件,确定最佳试验条件,并分析该方法的敏感性、特异性、重复性,以及与商品化试剂盒的符合率,评价其临床应用价值。SDS-PAGE和Western blot结果证明抗原蛋白获得正确表达与纯化,并且具有良好的反应原性,可以作为后续建立ELISA方法的包被抗原。通过优化ELISA条件,最终确定抗原最佳包被量为200ng·孔-1,血清最佳稀释度为1∶200,包被缓冲液为碳酸盐缓冲液(pH 9.6),封闭液为2.5%的脱脂奶粉,阴阳性判定的临界值为OD450nm≥0.296。该间接ELISA方法的特异性和敏感性良好,板内和板间变异系数均小于10%,与北京万泰商品化试剂盒符合率为91.2%。临床应用表明,该方法可应用于猪HEV感染猪后抗体消长以及临床猪血清抗体的检测。因此,本研究建立的猪HEV抗体间接ELISA检测方法具有较好的敏感性和特异性,准确率较高,该方法适用于临床猪血清样品的检测和猪HEV感染血清流行病学的调查。
文摘为获得猪戊型肝炎病毒(Hepatitis E virus,HEV)Ⅳ型衣壳蛋白单克隆抗体,将猪HEV衣壳蛋白的C端267(408—675)个氨基酸基因序列克隆入原核表达载体pET-28a(+),构建重组质粒pET-28a-ORF2-C,转化E.coli Rosetta(BL21)感受态细胞进行诱导表达,SDS-PAGE和Western blot鉴定,纯化后免疫小鼠。取免疫小鼠的脾脏与鼠骨髓瘤细胞SP2/0融合制备单克隆抗体。通过间接ELISA和竞争ELISA方法筛选并鉴定单抗。结果表明蛋白得到正确、高效表达,获得3株识别不同的抗原表位区的单克隆抗体,分别命名为Mab-1E4(IgG1)、Mab-2C7(IgG1)和Mab-2G9(IgG2b),其中1E4和2G9能阻断临床阳性猪血清,提示该2株单克隆抗体识别的抗原表位是猪HEVⅣ型衣壳蛋白上重要的抗原表位区,而单抗Mab-2C7不能阻断。本研究为猪HEVⅣ型的诊断及研究提供重要工具。
