为建立猪急性腹泻综合征冠状病毒(SADS-CoV)基于反转录交叉引物扩增(RT-CPA)结合侧向流层析试纸条(LFS)的现地检测方法,本研究根据SADS-CoV N基因序列保守区设计3套引物,以构建的重组质粒标准品pMD18-T-N作为模板,利用CPA基础扩增体系,...为建立猪急性腹泻综合征冠状病毒(SADS-CoV)基于反转录交叉引物扩增(RT-CPA)结合侧向流层析试纸条(LFS)的现地检测方法,本研究根据SADS-CoV N基因序列保守区设计3套引物,以构建的重组质粒标准品pMD18-T-N作为模板,利用CPA基础扩增体系,分别将3套引物用于CPA,根据凝胶电泳结果筛选最佳引物。在此基础上根据凝胶电泳结果优化各反应条件。结果显示,第3套引物的CPA结果出现的梯形条带最亮最清晰,因此选择该套引物进行后续试验并且优化其他反应条件。以SADS-CoV RNA为模板,利用上述优化的各反应条件经CPA后分别加入不同浓度的反转录酶M-MLV与AMV,60℃反应60 min后加入LFS,15 min后通过可视化结果筛选最佳浓度的最适反转录酶,并建立RT-CPA-LFS的检测体系。结果显示,在反应体系中加入浓度为10 U的AMV时,LFS的C线和T线同时出现红色,且凝胶电泳结果出现的梯形条带最亮最清晰。表明建立了RT-CPA-LFS检测方法。利用该方法检测SADS-CoV、猪流行性腹泻病毒、猪传染性胃肠炎病毒、猪德尔塔冠状病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒、猪细小病毒和猪圆环病毒2型,结果显示,该方法仅对SADS-CoV的检测为阳性结果,而对其他病毒的检测结果均为阴性;利用该方法与本实验室建立的RT-PCR和SYBR Green qPCR方法检测10倍倍比稀释的SADS-CoV RNA,结果显示,RTCPA-LFS、RT-PCR和qPCR方法对SADS-CoV RNA的检测限分别为5×10^(-6)ng/μL、5×10^(-4)ng/μL和5×10^(-8)ng/μL。RTCPA-LFS方法比RT-PCR的敏感性高100倍,比qPCR的敏感性低1%;利用同一批次和三批次配置的RT-CPA-LFS体系分别检测不同代次SADS-CoV的RNA,结果显示,该方法批内和批间重复性检测结果均一致。利用该RT-CPA-LFS方法和上述SYBR Green qPCR同时检测50份出现SADS-CoV典型临床症状样品上清液的RNA(猪肠道样品30份,猪粪便样品20份),结果显示,该RT-CPA-LFS方法对猪肠道样品和猪粪便样品的阳性检出率分别为96.67%(29/30)和95%(19/20);SYBR Green qPCR方法对猪肠道样品和猪粪便样品的阳性检出率分别为100%(30/30)和95%(19/20),表明建立的RT-CPA-LFS方法的准确性较好,可用于SADS-CoV的现地检测。本研究首次建立检测SADS-CoV的RT-CPALFS方法特异性较强、敏感性较高、重复性较好,且简便,快速,不依赖昂贵仪器,为现地及基层实验室检测SADSCoV提供新的技术手段。展开更多
文摘为建立猪急性腹泻综合征冠状病毒(SADS-CoV)基于反转录交叉引物扩增(RT-CPA)结合侧向流层析试纸条(LFS)的现地检测方法,本研究根据SADS-CoV N基因序列保守区设计3套引物,以构建的重组质粒标准品pMD18-T-N作为模板,利用CPA基础扩增体系,分别将3套引物用于CPA,根据凝胶电泳结果筛选最佳引物。在此基础上根据凝胶电泳结果优化各反应条件。结果显示,第3套引物的CPA结果出现的梯形条带最亮最清晰,因此选择该套引物进行后续试验并且优化其他反应条件。以SADS-CoV RNA为模板,利用上述优化的各反应条件经CPA后分别加入不同浓度的反转录酶M-MLV与AMV,60℃反应60 min后加入LFS,15 min后通过可视化结果筛选最佳浓度的最适反转录酶,并建立RT-CPA-LFS的检测体系。结果显示,在反应体系中加入浓度为10 U的AMV时,LFS的C线和T线同时出现红色,且凝胶电泳结果出现的梯形条带最亮最清晰。表明建立了RT-CPA-LFS检测方法。利用该方法检测SADS-CoV、猪流行性腹泻病毒、猪传染性胃肠炎病毒、猪德尔塔冠状病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒、猪细小病毒和猪圆环病毒2型,结果显示,该方法仅对SADS-CoV的检测为阳性结果,而对其他病毒的检测结果均为阴性;利用该方法与本实验室建立的RT-PCR和SYBR Green qPCR方法检测10倍倍比稀释的SADS-CoV RNA,结果显示,RTCPA-LFS、RT-PCR和qPCR方法对SADS-CoV RNA的检测限分别为5×10^(-6)ng/μL、5×10^(-4)ng/μL和5×10^(-8)ng/μL。RTCPA-LFS方法比RT-PCR的敏感性高100倍,比qPCR的敏感性低1%;利用同一批次和三批次配置的RT-CPA-LFS体系分别检测不同代次SADS-CoV的RNA,结果显示,该方法批内和批间重复性检测结果均一致。利用该RT-CPA-LFS方法和上述SYBR Green qPCR同时检测50份出现SADS-CoV典型临床症状样品上清液的RNA(猪肠道样品30份,猪粪便样品20份),结果显示,该RT-CPA-LFS方法对猪肠道样品和猪粪便样品的阳性检出率分别为96.67%(29/30)和95%(19/20);SYBR Green qPCR方法对猪肠道样品和猪粪便样品的阳性检出率分别为100%(30/30)和95%(19/20),表明建立的RT-CPA-LFS方法的准确性较好,可用于SADS-CoV的现地检测。本研究首次建立检测SADS-CoV的RT-CPALFS方法特异性较强、敏感性较高、重复性较好,且简便,快速,不依赖昂贵仪器,为现地及基层实验室检测SADSCoV提供新的技术手段。
