猪德尔塔冠状病毒N蛋白原核表达及多克隆抗体制备

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作者 叶晨倩 李智丽 +11 位作者 叶曼青 秦文珍 杨心雨 翟雪滢 郑浩 童武 李国新 于海 童光志 单同领 娄华 孔宁 《中国动物传染病学报》 北大核心 2025年第1期164-170,共7页

猪德尔塔冠状病毒(PDCoV)是一种新发的病原体,引起仔猪腹泻、脱水和呕吐等症状。本研究以PDCoV的RNA为模板,扩增PDCoV N基因,将其插入原核表达载体pColdⅠ中,构建PDCoV N-pColdⅠ质粒;通过BL21(DE3)原核表达和纯化获得高纯度的PDCoV N蛋... 猪德尔塔冠状病毒(PDCoV)是一种新发的病原体,引起仔猪腹泻、脱水和呕吐等症状。本研究以PDCoV的RNA为模板,扩增PDCoV N基因,将其插入原核表达载体pColdⅠ中,构建PDCoV N-pColdⅠ质粒;通过BL21(DE3)原核表达和纯化获得高纯度的PDCoV N蛋白;免疫BALB/c小鼠,制备PDCoV N蛋白多克隆抗体。结果显示:原核表达的PDCoV N蛋白为可溶性蛋白,分子量约为40 kDa;通过ELISA、Western blot和IFA鉴定可知,本研究制备的PDCoV N多克隆抗体均具有良好的效价,可为深入开展PDCoV相关的基础和应用研究提供工具。 展开更多

关键词 猪德尔塔冠状病毒 N蛋白 原核表达 多克隆抗体

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猪德尔塔冠状病毒感染与抗感染研究进展

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作者 毛福超 翟崇凯 +4 位作者 田文静 王聪慧 宋敏杰 王迎鲜 张贺伟 《中国畜牧兽医》 北大核心 2025年第3期1281-1291,共11页

猪德尔塔冠状病毒(Porcine deltacoronavirus,PDCoV)是一种新型肠道冠状病毒,主要感染哺乳仔猪,临床表现为腹泻、呕吐、脱水等症状,发病率可达100%。PDCoV严重危害新生仔猪健康,现已成为引起猪群腹泻的主要病原体之一。PDCoV通过膜融合... 猪德尔塔冠状病毒(Porcine deltacoronavirus,PDCoV)是一种新型肠道冠状病毒,主要感染哺乳仔猪,临床表现为腹泻、呕吐、脱水等症状,发病率可达100%。PDCoV严重危害新生仔猪健康,现已成为引起猪群腹泻的主要病原体之一。PDCoV通过膜融合及受体介导的内吞作用侵入宿主细胞,S蛋白是病毒侵入细胞的主要结构,表面氨基肽酶N、小窝蛋白是病毒侵入细胞的关键位点。此外,表面氨基肽酶N目前被认为是PDCoV跨物种传播的重要位点。细胞通过干扰素(IFN)基因表达、胆固醇代谢及N蛋白泛素化等途径引发抗感染。PDCoV通过自身结构蛋白、辅助蛋白及非结构蛋白等通过干扰IFN的表达及诱导侵染细胞凋亡等途径产生免疫逃避,进而持续侵染宿主细胞。目前用于预防和控制PDCoV感染的商业疫苗或抗病毒药物多在试验研发阶段或初上市阶段,其对PDCoV的预防和控制的临床效果亟需市场验证。尤其是针对病毒复制、免疫逃逸、抗PDCoV宿主因子等靶点开发的抗病毒药物或疫苗,为未来开发新型疫苗或抗病毒药物研发提供了新的研究方向和坚实的基础。笔者通过阐述PDCoV与宿主之间的感染和抗感染机制,探究多种抗病毒药物抑制PDCoV感染的潜在作用机制,为研究PDCoV致病机制、抗PDCoV感染治疗以及新药物的开发提供参考。 展开更多

关键词 猪德尔塔冠状病毒(PDCoV) 致病性 免疫逃逸 抗病毒机制

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2023年湖南省东部地区屠宰场猪德尔塔冠状病毒感染状况调查

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作者 邓国强 黄建龙 +4 位作者 张朝阳 郑辉 毛仕勇 李世强 张智勇 《湖南畜牧兽医》 2024年第6期17-18,28,共3页

为了解湖南省猪德尔塔冠状病毒(PDCoV)的感染情况和流行态势,2023年在湖南省东部的郴州、长沙、益阳、株洲、岳阳进行了采样调查,共采集180份猪脾脏组织,用PDCoV荧光RT-PCR检测方法进行核酸检测,并对结果进行分析。结果显示:检出PDCoV... 为了解湖南省猪德尔塔冠状病毒(PDCoV)的感染情况和流行态势,2023年在湖南省东部的郴州、长沙、益阳、株洲、岳阳进行了采样调查,共采集180份猪脾脏组织,用PDCoV荧光RT-PCR检测方法进行核酸检测,并对结果进行分析。结果显示:检出PDCoV阳性样品41份,阳性率为22.78%;郴州、长沙、益阳、株洲、岳阳PDCoV的阳性率分别为75.00%、0、2.50%、0、50.00%;9个屠宰场中4个检出PDCoV,占比为44.44%。结果表明:湖南省猪群PDCoV感染率较高,湘东南地区的感染率显著高于湘东北地区。 展开更多

关键词 生猪屠宰场 核酸检测 流行病学调查 猪德尔塔冠状病毒 感染率 卡方检验

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猪德尔塔冠状病毒病流行现状与防控策略

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作者 孙涛 《浙江畜牧兽医》 2024年第5期26-27,共2页

猪德尔塔冠状病毒病属于我国二类传染病,是由猪德尔塔冠状病毒(PDCoV)引起的,2007年,科研人员在亚洲豹猫和一些鸟类样本中检测到了该病毒,这表明该病毒可以感染哺乳动物及鸟类,尤其是规模化养猪场最易造成该病毒的广泛传播,一旦感染,仔... 猪德尔塔冠状病毒病属于我国二类传染病,是由猪德尔塔冠状病毒(PDCoV)引起的,2007年,科研人员在亚洲豹猫和一些鸟类样本中检测到了该病毒,这表明该病毒可以感染哺乳动物及鸟类,尤其是规模化养猪场最易造成该病毒的广泛传播,一旦感染,仔猪成活率和生长速度都会受到直接影响,可引起5-15日龄哺乳仔猪腹泻、呕吐、脱水、食欲不振等临床症状,导致机体迅速脱水后脏器衰竭而亡,给猪场带来一定的经济损失。 展开更多

关键词 仔猪成活率 二类传染病 猪德尔塔冠状病毒 规模化养猪场 防控策略 科研人员 流行现状 临床症状

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稳定表达猪德尔塔冠状病毒N蛋白的Vero细胞系的建立及鉴定 被引量：1

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作者 钱炳旭 薄宗义 +7 位作者 白雪雁 张成成 郭梦娇 李梦娇 廖凯 薛峰 吴艳涛 张小荣 《中国动物传染病学报》 CAS 北大核心 2024年第1期56-61,共6页

为获得稳定表达猪德尔塔冠状病毒(PDCoV)核衣壳(N)蛋白的非洲绿猴肾(Vero)细胞系,本研究将PDCoV-N基因克隆入慢病毒载体中,获得重组质粒pLVX-PDCoV-N,利用慢病毒包装系统转染293T细胞,包装成表达N蛋白的慢病毒颗粒,慢病毒感染Vero细胞,... 为获得稳定表达猪德尔塔冠状病毒(PDCoV)核衣壳(N)蛋白的非洲绿猴肾(Vero)细胞系,本研究将PDCoV-N基因克隆入慢病毒载体中,获得重组质粒pLVX-PDCoV-N,利用慢病毒包装系统转染293T细胞,包装成表达N蛋白的慢病毒颗粒,慢病毒感染Vero细胞,嘌呤霉素加压筛选目的细胞。RT-PCR扩增N基因和测序表明细胞系基因组中存在N蛋白编码序列,Western blot和IFA试验表明N蛋白可在细胞系中稳定表达。应用制备的细胞系对临床PDCoV阳性血清样品进行检测,与ELISA检测结果符合率达到100%。本研究成功建立了稳定表达PDCoV N蛋白的Vero细胞系,为PDCoV N蛋白生物学特性研究和PDCoV的临床检测、流行病学调查奠定了基础。 展开更多

关键词 猪德尔塔冠状病毒 核衣壳(N)蛋白 慢病毒 稳转细胞系

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猪德尔塔冠状病毒N蛋白单克隆抗体2D7的制备与生物学特性鉴定 被引量：1

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作者 张宁 赵平 +12 位作者 刘思雨 赵硕 陈忠伟 何颖 欧阳康 卢冰霞 蒋家霞 郭旋 林昌华 赵武 黄伟坚 秦毅斌 赵凌 《中国动物传染病学报》 CAS 北大核心 2024年第5期115-125,共11页

为获得猪德尔塔冠状病毒(Porcine deltacoronavirus,PDCoV)N蛋白的特异性单克隆抗体(Monoclonal antibody,mAb),并鉴定其生物学特性,本研究利用RT-PCR方法扩增PDCoV-N基因,构建表达质粒,转化BL21感受态细胞获得重组大肠杆菌,诱导表达后... 为获得猪德尔塔冠状病毒(Porcine deltacoronavirus,PDCoV)N蛋白的特异性单克隆抗体(Monoclonal antibody,mAb),并鉴定其生物学特性,本研究利用RT-PCR方法扩增PDCoV-N基因,构建表达质粒,转化BL21感受态细胞获得重组大肠杆菌,诱导表达后获得PDCoV-N重组蛋白,将其进行纯化后再免疫小鼠,制备针对PDCoV-N蛋白的mAb,并进行了抗体的效价测定、免疫荧光(IFA)、Western blot、亚类的鉴定、mAb特异性的鉴定。结果,成功构建pColdⅡ-PDCoV-N重组原核表达质粒,SDS-PAGE显示重组N蛋白成功表达,分子质量约为38 kDa;经小鼠免疫、细胞融合、亚克隆筛选获得1株分泌PDCoV-N蛋白抗体的阳性杂交瘤细胞株;制备的腹水经间接ELISA方法测定抗体的效价为2.048×10^(6)。IFA、Western blot试验表明该mAb可以与PDCoV-N蛋白及全病毒特异性结合,亚类鉴定其亚型为IgG1,轻链为κ链。该mAb只与PDCoV反应,而与其他猪肠道病毒无交叉反应,表明本研究制备的mAb具有良好的特异性。本研究成功制备了PDCoV-N蛋白的mAb,为进一步研究PDCoV的生物学特性和诊断试剂的开发提供技术支持。 展开更多

关键词 猪德尔塔冠状病毒 N蛋白 单克隆抗体

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基于转录组测序技术分析猪德尔塔冠状病毒感染ST细胞机制的初步研究 被引量：2

7

作者 谢永生 张昆丽 +1 位作者 张建峰 贺东生 《中国预防兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2024年第3期236-244,共9页

猪德尔塔冠状病毒(PDCoV)感染可导致仔猪出现水样腹泻和死亡,严重危害猪的健康。为研究PDCo V感染引起宿主细胞基因转录水平的变化及初步研究其感染机制,本研究提取PDCo V感染组和不感染该病毒的阴性对照组ST细胞样品总RNA,构建二者的c... 猪德尔塔冠状病毒(PDCoV)感染可导致仔猪出现水样腹泻和死亡,严重危害猪的健康。为研究PDCo V感染引起宿主细胞基因转录水平的变化及初步研究其感染机制,本研究提取PDCo V感染组和不感染该病毒的阴性对照组ST细胞样品总RNA,构建二者的cDNA文库后采用Illumina HiSeq 6000高通量测序平台进行转录组测序(RNA-Seq)。结果显示,所有样品的测序错误率均≤0.03%;Q20/%和Q30/%分别达98%和94%以上;GC含量在51.09%~55.15%;相关性分析结果显示,阴性对照组及感染组细胞样品各组内的R值均>0.9,上述结果表明测序数据可靠,可用于后续转录组学数据分析。采用ggplot2软件分析两组细胞组内测序结果的相关性,并以相关系数R>0.9判定各组内测序数据的准确性;采用DESeq2软件并以P<0.05和log2(Fold change)>1为条件筛选两组细胞中转录显著差异基因;采用ClusterProfiler R软件对转录显著差异基因进行GO功能和KEGG信号通路的富集分析;采用Pheatmap软件对各组ST细胞中与免疫反应相关的转录显著差异基因进行聚类分析;随机选择9个转录显著差异基因经RT-q PCR验证RNA-Seq的结果。筛选结果显示,与阴性对照组细胞相比,共筛选出5719个转录显著差异基因,其中3573个转录显著上调基因,2146个转录显著下调基因。GO功能和KEGG信号通路富集分析结果显示,转录显著上调的基因与ST细胞的免疫应答、防御反应等功能有关;转录显著下调的基因与细胞的氧化还原和新陈代谢等功能有关;转录显著上调的基因参与细胞因子受体互作、天然免疫反应相关、肿瘤坏死因子等的信号通路;转录显著下调的基因与细胞物质代谢信号通路有关,包括氨基酸代谢、脂代谢、乙醛酸和二羧酸代谢等信号通路。与免疫反应相关的转录显著差异基因的聚类分析结果显示,与阴性对照组细胞相比,PDCo V感染的ST细胞中白细胞介素基因(IL-1R1、1L-6、IL-10RB、IL-15和IL-12A等)、抗病毒基因(MX1、OAS)和干扰素基因(INFAR1、IFN-ALPHAOMEGA)的转录水平均显著上调。上述结果表明PDCo V感染后,ST细胞的天然免疫反应被激活,但细胞的代谢反应降低,这更有利于减弱病毒在ST细胞中的复制,起到一定的抗病毒效果。9个转录显著差异基因的RT-q PCR结果与RNA-seq结果基本一致,表明转录组测序数据可靠。本研究为进一步解析PDCo V的感染机制提供参考依据。 展开更多

关键词 猪德尔塔冠状病毒 转录组测序 转录显著差异基因

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猪德尔塔冠状病毒N蛋白原核表达及其多克隆抗体制备 被引量：1

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作者 赵梓桥 张昆丽 +4 位作者 张春红 翟少伦 康欣桐 黄淑坚 张建峰 《南方农业学报》 CAS CSCD 北大核心 2024年第6期1798-1806,共9页

【目的】构建猪德尔塔冠状病毒(Porcine deltacoronavirus,PDCoV)核衣壳(N)蛋白原核表达系统并制备多克隆抗体,为新型疫苗、诊断试剂研发及PDCoV致病机制的深入研究提供基础。【方法】提取PDCoV HeN17株RNA,经RT-PCR扩增,将N基因克隆至p... 【目的】构建猪德尔塔冠状病毒(Porcine deltacoronavirus,PDCoV)核衣壳(N)蛋白原核表达系统并制备多克隆抗体,为新型疫苗、诊断试剂研发及PDCoV致病机制的深入研究提供基础。【方法】提取PDCoV HeN17株RNA,经RT-PCR扩增,将N基因克隆至pGEX-6P-1载体构建重组原核表达质粒,转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞并进行IPTG诱导表达。利用Glutathione Sepharose 4B亲和层析纯化重组蛋白,采用3C蛋白酶去除标签。以纯化后的N蛋白为免疫原免疫3月龄新西兰大白兔制备多克隆抗体,采用间接酶联免疫吸附测定(ELISA)法测定抗体效价,并通过Western blotting、间接免疫荧光试验(IFA)和免疫沉淀(IP)试验对其进行鉴定。【结果】成功构建原核表达载体pGEX-6p-1-PDCoV-N,获得的PDCoV-N-GST重组蛋白主要以可溶性形式表达,大小约69 kD,经去除GST标签可获得单一目的蛋白条带,经测定蛋白浓度为12.6 mg/mL,获得的PDCoV-N蛋白能与PDCoV阳性血清反应产生单一特异性条带。制备的兔源抗PDCoV-N多克隆抗体效价达1∶4096000,可特异性识别pCAGGS-Flag-N转染HEK-293T细胞中表达的Flag-N蛋白和PDCoV感染LLC-PK1细胞中表达的PDCoV-N蛋白,且能检测到PDCoV-N真核表达载体pCAGGS-Flag-N转染HEK-293T细胞中表达的PDCoV-N蛋白。【结论】成功构建高效PDCoV-N原核表达系统,获得纯度好、浓度高且免疫原性佳的PDCoV-N蛋白,制备的兔源抗PDCoV-N多克隆抗体效价高,具有较强亲和力和特异性,可用于Western blotting、IFA和IP检测。 展开更多

关键词 猪德尔塔冠状病毒(PDCoV) N蛋白 原核表达 多克隆抗体

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猪德尔塔冠状病毒病的诊断与防治

9

作者 朱家春 《今日畜牧兽医》 2024年第3期104-106,共3页

猪德尔塔冠状病毒属于较为严重的猪类传染病,可感染不同生长阶段的猪群,其中以5~15日龄哺乳仔猪最易感,主要症状包括高热、咳嗽、打喷嚏、流涕、呼吸困难、腹泻等,且哺乳仔猪感染后死亡率高达30%~40%,而成年猪、生长猪及生产母猪症状表... 猪德尔塔冠状病毒属于较为严重的猪类传染病,可感染不同生长阶段的猪群,其中以5~15日龄哺乳仔猪最易感,主要症状包括高热、咳嗽、打喷嚏、流涕、呼吸困难、腹泻等,且哺乳仔猪感染后死亡率高达30%~40%,而成年猪、生长猪及生产母猪症状表现轻微,一般可不治而愈,猪德尔塔冠状病毒的出现给世界养猪业造成了巨大的经济损失。研究显示,猪德尔塔冠状病毒与α-冠状病毒具有相似的临床症状和病理变化,感染后可引起猪只的水样腹泻、脱水和死亡。据此,本文结合猪德尔塔冠状病毒病诊断进行探讨,并结合实际提出相应的防治措施,旨在为生猪养殖产业安全发展提供参考。 展开更多

关键词 猪德尔塔冠状病毒 流行特点 防治措施

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国内首株猪德尔塔冠状病毒(Porcine deltacoronavirus)的分离鉴定 被引量：52

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作者 陈建飞 王潇博 +5 位作者 焦贺勋 时洪艳 张鑫 刘建波 石达 冯力 《中国预防兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2016年第3期171-174,共4页

猪德尔塔冠状病毒(Porcine deltacoronavirus,PDCoV)是一种新出现的猪冠状病毒,于2012年首次在香港的猪群中发现。2014年2月美国在腹泻仔猪和母猪的粪便中首次检测到PDCoV,随后,韩国和我国大陆也从腹泻猪的临床样品中检测到PDCoV。目前... 猪德尔塔冠状病毒(Porcine deltacoronavirus,PDCoV)是一种新出现的猪冠状病毒,于2012年首次在香港的猪群中发现。2014年2月美国在腹泻仔猪和母猪的粪便中首次检测到PDCoV,随后,韩国和我国大陆也从腹泻猪的临床样品中检测到PDCoV。目前,只有美国成功分离到2株PDCoV。为分离鉴定PDCoV,本研究将PDCoV阳性样品无菌处理后接种猪肾细胞(LLC-PK)并连续传代培养。通过细胞病变、RT-PCR、间接免疫荧光和基因序列测定对细胞培养物进行鉴定。结果表明我们成功分离到国内首株PDCoV并将其命名为NH株。M基因的系统发育分析表明NH株与中国、美国及韩国的PDCoV亲源关系较近。本研究为进一步研究PDCoV的致病性和致病机制奠定了基础。 展开更多

关键词 猪德尔塔冠状病毒 细胞培养 分离 鉴定

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猪德尔塔冠状病毒TJ_1株的分离鉴定及生物学特性分析 被引量：9

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作者 郑丽 李秀丽 +5 位作者 鄢明华 任卫科 张蕾 路超 田向学 韩伟 《中国畜牧兽医》 CAS 北大核心 2018年第1期219-224,共6页

本研究旨在获得猪德尔塔冠状病毒(porcine deltacoronavirus,PDCoV)分离株,并对其生物学特性进行探讨。将RT-PCR检测PDCoV阳性样品无菌处理后接种猪肾(PK-15)细胞并连续传代培养,通过细胞病变、M基因序列分析及耐热、耐酸等试验对细胞... 本研究旨在获得猪德尔塔冠状病毒(porcine deltacoronavirus,PDCoV)分离株,并对其生物学特性进行探讨。将RT-PCR检测PDCoV阳性样品无菌处理后接种猪肾(PK-15)细胞并连续传代培养,通过细胞病变、M基因序列分析及耐热、耐酸等试验对细胞培养物进行鉴定,采用Reed-Muench法测定PDCoV的TCID50,应用5×104.0TCID50/mL的病毒悬液接种11日龄仔猪并观察临床症状。结果显示,试验成功分离到1株PDCoV,将其命名为TJ1株,该病毒的第5代病毒效价为104.5 TCID50/mL;TJ1株对脂溶剂氯仿和乙醚不敏感,耐酸,在pH 3.0的环境下稳定,对热较敏感,在50℃条件下1h便可将其灭活;其M基因和GenBank中已发表的PDCoV M基因核苷酸序列同源性为94%~99%;致病力试验结果显示,该病毒可引起仔猪发生腹泻,发病率100%。本研究成功分离了1株PDCoV毒株TJ1株,对该分离株生物学特性进行初步研究,为进一步开展PDCoV相关研究奠定了基础。 展开更多

关键词 猪德尔塔冠状病毒(PDCoV) 分离 鉴定 生物学特性

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猪德尔塔冠状病毒RT-nPCR检测方法的建立与N基因变异分析 被引量：1

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作者 朱小甫 吴旭锦 《中国动物传染病学报》 CAS 北大核心 2023年第6期72-77,共6页

建立一种基于猪德尔塔冠状病毒(PDCo V)N基因的RT-n PCR检测方法,对陕西省猪群PDCo V感染情况进行流行病学调查,分析PDCo V流行毒株N基因变异情况。通过病毒分离、检测引物设计、反应体系与条件优化、灵敏性试验和特异性试验,建立了PDCo... 建立一种基于猪德尔塔冠状病毒(PDCo V)N基因的RT-n PCR检测方法,对陕西省猪群PDCo V感染情况进行流行病学调查,分析PDCo V流行毒株N基因变异情况。通过病毒分离、检测引物设计、反应体系与条件优化、灵敏性试验和特异性试验,建立了PDCo V RT-nPCR检测方法,并对N基因片段进行序列分析。结果表明:建立的RT-n PCR方法能够扩增出303 bp的N基因目的片段,检测单链c DNA的极限为2.0194×10^(-3)ng·μL^(-1),该方法检测PEDV、TGEV、PRo V、CSFV与PRRSV均无交叉反应,特异性良好;陕西省猪场184份样品检测结果显示,PDCo V阳性率为6.52%(12/184);N基因序列分析发现,获得的HY2019、QLS2020的N基因片段同源性为99.0%,提示可能为同一来源;进化树分析发现,HY2019、QLS2020与我国四川株SCNC201705、Sichuan2017、Sichuan2019同处于一个小的进化分支上,且均存在168~179位“TGTCTGTCTCTA”共12个核苷酸缺失,推测陕西株与四川株高度同源,可能起源于早期四川毒株。 展开更多

关键词 猪德尔塔冠状病毒 仔猪腹泻 检测 反转录-聚合酶链式反应

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猪氨基肽酶N不是猪德尔塔冠状病毒入侵宿主细胞的受体 被引量：8

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作者 卢曼曼 张家林 +7 位作者 王洪峰 时洪艳 张鑫 袁婧 石达 刘建波 陈建飞 冯力 《中国预防兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2017年第9期701-706,共6页

猪德尔塔冠状病毒(PDCoV)是一种新出现的冠状病毒,能够引起猪只发生呕吐和水样腹泻,临床症状与猪流行性腹泻(PED)和猪传染性胃肠炎(TGE)相似。相关研究表明猪氨基肽酶N(pAPN)是PED病毒(PEDV)和TGE病毒(TGEV)入侵宿主细胞的功能性受体。... 猪德尔塔冠状病毒(PDCoV)是一种新出现的冠状病毒,能够引起猪只发生呕吐和水样腹泻,临床症状与猪流行性腹泻(PED)和猪传染性胃肠炎(TGE)相似。相关研究表明猪氨基肽酶N(pAPN)是PED病毒(PEDV)和TGE病毒(TGEV)入侵宿主细胞的功能性受体。为研究pAPN是否是PDCoV入侵宿主细胞的受体,本研究以TGEV为指示病毒,通过BHK-pAPN细胞感染试验、pAPNRNA干扰试验、ST细胞过表达pAPN试验、可溶性pAPN阻断试验,发现BHK-pAPN细胞是PDCoV非易感细胞,在易感细胞ST上沉默和过表达pAPN对PDCoV的增殖并无影响,可溶性pAPN不能阻止PDCoV感染ST细胞。这些研究结果表明pAPN不是PDCoV入侵宿主细胞的受体,而且对PDCoV的增殖无影响。 展开更多

关键词 猪德尔塔冠状病毒 猪氨基肽酶N 受体

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猪德尔塔冠状病毒S蛋白单克隆抗体的制备与鉴定 被引量：8

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作者 范前进 刘秋歌 +5 位作者 石达 王潇博 张家林 汤荣锋 陈建飞 冯力 《中国动物传染病学报》 CAS 北大核心 2021年第3期64-70,共7页

为制备猪德尔塔冠状病毒(PDCoV)S蛋白的单克隆抗体,本研究首先优化、合成了PDCoV NH株的S基因,利用PCR方法从中扩增S基因片段,克隆至pAAV-IRES-hrGFP真核表达载体,构建真核表达质粒pAAV-NH-S-Flag,转染至HEK293T细胞中进行表达。采用EZv... 为制备猪德尔塔冠状病毒(PDCoV)S蛋白的单克隆抗体,本研究首先优化、合成了PDCoV NH株的S基因,利用PCR方法从中扩增S基因片段,克隆至pAAV-IRES-hrGFP真核表达载体,构建真核表达质粒pAAV-NH-S-Flag,转染至HEK293T细胞中进行表达。采用EZview Red ANTI-FLAG M2亲和凝胶蛋白纯化试剂盒进行纯化重组蛋白。将纯化后的重组蛋白免疫BALB/c小鼠,取小鼠脾脏B淋巴细胞与SP2/0骨髓瘤细胞融合,采用间接ELISA方法筛选阳性杂交瘤细胞株,利用Western blot和IFA鉴定单克隆抗体的特异性。结果显示:筛选获得两株稳定分泌单克隆抗体的杂交瘤细胞株17C7和23F3,单克隆抗体的亚型均为IgM,腹水效价均为1∶6400;两株单克隆抗体都与S蛋白有良好的反应性,且能够与PDCoV发生特异性反应,而与其他常见的猪腹泻冠状病毒不发生反应。本研究为PDCoV诊断及病毒入侵、感染机制的研究奠定了基础。 展开更多

关键词 猪德尔塔冠状病毒 S蛋白 真核表达 单克隆抗体

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猪德尔塔冠状病毒TaqMan荧光定量PCR检测方法的建立及应用 被引量：7

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作者 江珊 李富强 +5 位作者 李秀丽 王利丽 郑丽 张莉 路超 鄢明华 《动物医学进展》 北大核心 2019年第10期10-17,共8页

为建立一种快速、灵敏、准确的猪德尔塔冠状病毒(PDCoV)分子检测方法,根据PDCoV M基因的保守序列设计并合成引物和探针,建立了PDCoV M基因Taq Man荧光定量PCR检测方法。结果表明,该方法标准曲线具有良好的线性关系,相关系数为0.998;敏... 为建立一种快速、灵敏、准确的猪德尔塔冠状病毒(PDCoV)分子检测方法,根据PDCoV M基因的保守序列设计并合成引物和探针,建立了PDCoV M基因Taq Man荧光定量PCR检测方法。结果表明,该方法标准曲线具有良好的线性关系,相关系数为0.998;敏感性好,最低可检测到10 copies/μL的PDCoV M基因标准品;特异性试验结果显示,该方法与猪流行性腹泻病毒(PEDV)、猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)、猪轮状病毒(PoRV)、猪瘟病毒(CSFV)、猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)、猪伪狂犬病病毒(PRV)、猪圆环病毒2型(PCV2)、猪细小病毒(PPV)及大肠埃希菌K88菌株均无交叉反应;重复性试验变异系数低于2%,表明重复性良好。对121份临床样本进行检测,阳性检出率为53.7%(65/121),随机选择10份阳性样品的扩增产物进行测序分析,进一步证实扩增产物中含有PDCoV。该方法具有敏感性高、特异性强、用时短和高通量等特点,适用于PDCoV的定量检测与分子流行病学调查,为PDCoV的准确定量及进一步研究奠定了基础。 展开更多

关键词 猪德尔塔冠状病毒 M基因 TAQ Man探针 荧光定量PCR

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猪德尔塔冠状病毒重组聚合酶扩增检测方法的建立与应用 被引量：10

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作者 肖帅 刘新生 +4 位作者 方玉珍 周鹏 张永光 王永录 魏彦明 《动物医学进展》 北大核心 2019年第3期9-14,共6页

为了快速检测猪德尔塔冠状病毒(PDCoV),针对PDCoV N基因设计特异的引物,建立了猪德尔塔冠状病毒重组聚合酶扩增(RPA)方法。特异性试验中以PPRSV、PEDV、PKV、TGEV和FMDV为模板时均未产生任何条带,特异性较好。该检测方法的灵敏度为103 c... 为了快速检测猪德尔塔冠状病毒(PDCoV),针对PDCoV N基因设计特异的引物,建立了猪德尔塔冠状病毒重组聚合酶扩增(RPA)方法。特异性试验中以PPRSV、PEDV、PKV、TGEV和FMDV为模板时均未产生任何条带,特异性较好。该检测方法的灵敏度为103 copies/μL,敏感性较好。用该方法检测194份仔猪腹泻样品,PDCoV阳性率为14.4%,较常规RT-PCR阳性率为11.9%更高。研究所建立的猪德尔塔冠状病毒RPA检测方法具有反应快速、操作简单、结果可靠、设备要求低等优点,可为基层简易实验室提供一种方便适用的快速检测方法。 展开更多

关键词 猪德尔塔冠状病毒 重组聚合酶扩增 快速检测

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猪德尔塔冠状病毒M蛋白参与病毒诱导IL-8产生的研究 被引量：5

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作者 石照蓉 陈建飞 +3 位作者 张洪玲 时洪艳 郭龙军 冯力 《中国预防兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2022年第4期435-438,共4页

为研究猪德尔塔冠状病毒(PDCoV)感染能否诱导宿主细胞产生IL-8,本研究将PDCoV分别感染猪小肠上皮细胞(IPEC)和ST细胞,感染后6 h、12 h和24 h收集细胞,通过荧光定量PCR方法检测IL-8 mRNA转录水平。构建表达PDCoV M蛋白的真核表达质粒pCAG... 为研究猪德尔塔冠状病毒(PDCoV)感染能否诱导宿主细胞产生IL-8,本研究将PDCoV分别感染猪小肠上皮细胞(IPEC)和ST细胞,感染后6 h、12 h和24 h收集细胞,通过荧光定量PCR方法检测IL-8 mRNA转录水平。构建表达PDCoV M蛋白的真核表达质粒pCAGGS-M,经测序鉴定无误后转染HEK 293T细胞,采用间接免疫荧光试验(IFA)和western blot方法检测PDCoV M蛋白的表达。将pCAGGS-M质粒转染IPEC细胞,采用荧光定量PCR方法检测PDCoV M蛋白对IL-8转录的影响。为进一步评价PDCoV M蛋白对IL-8转录水平的影响,将不同浓度pCAGGS-M质粒(10 ng、100 ng和200 ng)、IL-8启动子质粒和pRL-TK质粒共转染HEK 293T细胞,采用双荧光素酶活性分析试验评价PDCoV M蛋白对IL-8转录活性的影响。荧光定量PCR结果显示,与未感染组相比,PDCoV感染能够显著上调细胞中IL-8 mRNA转录水平,其中PDCoV感染IPEC细胞6 h、12 h和24 h后IL-8 mRNA分别上调3倍、37倍和173倍;PDCoV感染ST细胞6 h、12 h和24 h后IL-8 mRNA分别上调20倍、19000倍和48000倍。IFA和western blot结果显示PDCoV M蛋白正确表达,与空载体质粒转染组相比,转染表达PDCoV M蛋白的质粒能够上调IPEC细胞IL-8转录水平约4.3倍。双荧光素酶活性分析试验结果显示,与对照组相比,转染10 ng、100 ng和200 ng pCAGGS-M质粒能够分别诱导细胞中IL-8转录活性上调1.9倍、3.8倍和5.7倍;表明PDCoV M蛋白能够上调宿主细胞IL-8的转录活性。综上所述,PDCoV感染能够显著上调IPEC和ST细胞中IL-8的转录水平,其中PDCoV M蛋白参与诱导细胞IL-8的产生,本研究为深入了解PDCoV致病机制提供参考依据。 展开更多

关键词 猪德尔塔冠状病毒 IL-8 转录 M蛋白

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猪德尔塔冠状病毒SYBR Green Ⅰ实时荧光定量PCR方法的建立及应用 被引量：9

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作者 杜倩 汪伟 +7 位作者 韩知晓 孔子荣 辛佳亮 闭璟珊 曹亮 孙文超 胡传活 郑敏 《中国动物传染病学报》 CAS 北大核心 2021年第2期15-21,共7页

为建立一种猪德尔塔病毒(PDCoV)的快速检测方法,本研究根据NCBI公布的PDCoV序列设计了1对特异性引物,利用RT-PCR方法扩增PDCoV的S基因,将其连接至pMD19-T载体上,以构建正确的重组质粒作为标准品,建立SYBR Green Ⅰ实时荧光定量PCR检测方... 为建立一种猪德尔塔病毒(PDCoV)的快速检测方法,本研究根据NCBI公布的PDCoV序列设计了1对特异性引物,利用RT-PCR方法扩增PDCoV的S基因,将其连接至pMD19-T载体上,以构建正确的重组质粒作为标准品,建立SYBR Green Ⅰ实时荧光定量PCR检测方法,并对该方法的敏感性、特异性及重复性进行了验证分析。结果显示:该检测方法在标准品浓度为6.26×10^(1)~6.26×10^(8)copies/μL范围内呈良好线性关系,其相关性为0.999,斜率为-4.312;灵敏度良好,检测下限可达6.26×10^(1)copies/μL;特异性良好,对PEDV和TGEV两种猪常见病原均无特异性扩增;重复性好,组内和组间变异系数均小于2.0%;利用该方法对43份临床样品进行检测,PDCoV阳性率为4.6%。结果表明,本研究成功建立了PDCoV的SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR检测方法,为PDCoV快速灵敏的诊断奠定了坚实基础。 展开更多

关键词 猪德尔塔冠状病毒 S基因 SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR

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猪德尔塔冠状病毒CHN/20GXNN-1/2020分离鉴定及遗传进化分析 被引量：6

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作者 速雪丽 秦毅斌 +7 位作者 陆颖 杜琛 赵武 何颖 陈樱 韦祖樟 黄伟坚 欧阳康 《动物医学进展》 北大核心 2023年第1期12-18,共7页

为了解广西地区猪德尔塔冠状病毒(PDCoV)的流行特点,对该地区PDCoV进行分离鉴定及遗传进化分析。将20份检测为PDCoV阳性的样品接种于LLC-PK细胞,经RT-PCR及IFA鉴定,获得1株PDCoV,命名为CHN/20GXNN-1/2020。通过TCID50和RT-qPCR测定,该... 为了解广西地区猪德尔塔冠状病毒(PDCoV)的流行特点,对该地区PDCoV进行分离鉴定及遗传进化分析。将20份检测为PDCoV阳性的样品接种于LLC-PK细胞,经RT-PCR及IFA鉴定,获得1株PDCoV,命名为CHN/20GXNN-1/2020。通过TCID50和RT-qPCR测定,该毒株的病毒滴度及病毒载量在连续传代过程中逐步增高。其S基因核苷酸在153 bp-155 bp位置存在3 bp的缺失,氨基酸有23个位点发生突变。S基因同源性分析结果表明,PDCoV毒株CHN/20GXNN-1/2020与中国多数流行毒株的亲缘关系更近。结果表明,分离鉴定出1株新的PDCoV毒株,为冠状病毒生物学特性研究提供了材料,也为进一步开展病毒致病性研究及疫苗研制奠定了基础。 展开更多

关键词 猪德尔塔冠状病毒 分离鉴定 S基因 遗传进化分析

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猪德尔塔冠状病毒感染对初生仔猪小肠杯状细胞数量及Hes1和MUC2表达的影响 被引量：2

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作者 梁继翔 焦哲 +7 位作者 严治山 李旸 李栋祺 刘晓丽 谷长勤 胡薛英 程国富 张万坡 《畜牧兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2021年第3期772-781,共10页

旨在探讨猪德尔塔冠状病毒(PDCoV)感染仔猪对小肠杯状细胞(goblet cell,GC)的影响,将6头未吃初乳的初生仔猪静养2 d后随机分为感染组(n=3)和对照组(n=3),感染组仔猪口服接种5 mL 1×10^(5) TCID_(50)·mL^(-1) PDCoV-CHN-HG-201... 旨在探讨猪德尔塔冠状病毒(PDCoV)感染仔猪对小肠杯状细胞(goblet cell,GC)的影响,将6头未吃初乳的初生仔猪静养2 d后随机分为感染组(n=3)和对照组(n=3),感染组仔猪口服接种5 mL 1×10^(5) TCID_(50)·mL^(-1) PDCoV-CHN-HG-2017毒株,对照组仔猪口服5 mL DMEM培养基。感染组仔猪分别在口服接种后22、39和70 h出现明显腹泻、脱水和嗜睡等临床症状,及时实施安乐死并采集小肠组织样品;对应时间点分别选取对照组1头仔猪实施安乐死并采集小肠组织样品。采用HE染色、PAS染色和AB染色观察小肠组织病理学变化和GC数量变化。采用荧光定量PCR和ELISA分别检测初生仔猪小肠组织中发状分裂相关增强子1(Hes1)和黏蛋白2(MUC2)的转录和含量的变化。结果显示,感染组仔猪与对照组仔猪相比小肠各段黏膜结构均有不同程度损伤,绒毛长度降低且差异显著(P<0.05),VH:CD的比值降低且差异显著(P<0.05)。PAS染色与AB染色结果一致,小肠各段GC数量均有不同程度减少且差异显著(P<0.05、P<0.01或P<0.001)。感染组仔猪与对照组仔猪相比小肠各段Hes1 mRNA的转录量和含量均升高,在空肠和回肠中Hes 1 mRNA转录量差异显著(P<0.01或P<0.05),在十二指肠和回肠中Hes1含量差异显著(P<0.01)。感染组仔猪与对照组仔猪相比小肠各段MUC2 mRNA的转录量和含量均降低,在十二指肠和回肠中差异显著(P<0.05、P<0.01或P<0.001)。结果表明,PDCoV感染初生仔猪后引起小肠GC数量明显减少。PDCoV感染仔猪可能通过激活肠道Notch信号通路下游靶基因Hes1表达来阻碍小肠中GC形成和分泌,导致GC数量减少和MUC2表达降低。 展开更多

关键词 猪德尔塔冠状病毒 仔猪 杯状细胞 小肠 发状分裂相关增强子1 黏蛋白2

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