【目的】应用原核表达系统表达猪圆环病毒4型(Porcine circovirus type 4,PCV4)复制酶蛋白(Rep),纯化后免疫小鼠制备Rep蛋白多克隆抗体。【方法】以PCV4福建株(FJ2020001)为模板,采用PCR法扩增获得Rep基因片段,构建原核表达质粒pET-30a-...【目的】应用原核表达系统表达猪圆环病毒4型(Porcine circovirus type 4,PCV4)复制酶蛋白(Rep),纯化后免疫小鼠制备Rep蛋白多克隆抗体。【方法】以PCV4福建株(FJ2020001)为模板,采用PCR法扩增获得Rep基因片段,构建原核表达质粒pET-30a-Rep;将pET-30a-Rep转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞,用0.5 mmol/L IPTG诱导表达重组Rep蛋白,利用SDS-PAGE和Western blotting鉴定重组蛋白。表达产物经镍柱纯化后免疫BALB/c小鼠制备多克隆抗体,利用Western blotting和间接ELISA鉴定鼠源多克隆抗体的免疫原性和抗体效价。【结果】成功克隆PCV4 Re p基因,构建了可表达重组Rep蛋白的原核表达质粒;SDS-PAGE结果显示,表达的重组蛋白分子质量约为35 ku,主要以包涵体形式存在;Western blotting结果表明,该蛋白能被PCV4阳性血清和鼠源多克隆抗体特异性识别,制备的鼠源多克隆抗体效价可达1∶16000。【结论】本研究成功表达并纯化了具备抗原性的PCV4重组Rep蛋白,为开发PCV4血清学诊断试剂盒和开展猪场PCV4流行病学调查奠定基础。展开更多
猪圆环病毒2型(PCV2)可引起仔猪的断奶后多系统衰竭综合征(PMWS)、猪皮炎肾病综合征(PDNS)等疾病,PCV基因型多且常以混合感染为主,给养殖场造成严重经济损失。为建立一种能同时检测PCV2、PCV3、PCV4的荧光定量PCR(q PCR)方法,本研究根据...猪圆环病毒2型(PCV2)可引起仔猪的断奶后多系统衰竭综合征(PMWS)、猪皮炎肾病综合征(PDNS)等疾病,PCV基因型多且常以混合感染为主,给养殖场造成严重经济损失。为建立一种能同时检测PCV2、PCV3、PCV4的荧光定量PCR(q PCR)方法,本研究根据PCV2、PCV3和PCV4的rep基因序列,设计特异性引物和探针,利用三维响应面曲线优化扩增条件,建立了一种可同时检测3种PCV的三重Taq Man qPCR方法。通过将扩增的PCV2、PCV3、PCV4的rep基因片段克隆至pUC-57载体,构建重组质粒标准品,并经测序鉴定。特异性试验中,结果显示该方法仅对PCV2、PCV3、PCV4检测为阳性,对其他常见猪病毒及细菌检测结果均为阴性,特异性强;敏感性试验中,使用构建的3种重组质粒标准品等体积混合再10倍倍比稀后经该三重qPCR检测,结果显示该方法对PCV2、PCV3、PCV4重组质粒标准品的检测限分别为1×10^(1)拷贝/μL、1×10^(2)拷贝/μL、1×10^(0)拷贝/μL,敏感性较高;重复性试验中,采用本研究建立的三重qPCR方法分别对3种浓度PCV2、PCV3、PCV4重组质粒标准品进行组内和组间重复性检测,结果显示该方法组内和组间重复性试验的变异系数分别小于3.34%和2.77%,重复性较好。利用该方法检测浙江省送检的共120份仔猪组织病料及肛拭子样品,并利用已发表的检测PCV2、PCV3及PCV4的SYBR Green I qPCR方法同时检测,结果显示,本研究建立的方法对PCV2的检出率为60.8%(73/120),对PCV3的检出率为45.8%(55/120),对PCV4的检出率为25.8%(31/120);SYBR Green I qPCR法对PCV2的检出率为65%(78/120),对PCV3的检出率为45.8%(55/120),对PCV4的检出率为27.5%(33/120);两种检测方法的总符合率均为92.5%(111/120)。本研究首次建立了可用于鉴别检测临床样品中PCV2、PCV3、PCV4感染的q PCR鉴别检测方法,为猪场PCV感染的防控奠定基础。展开更多
为建立一种灵敏、可快速检测猪圆环病毒4型(PCV4)的SYBR Green Ⅰ实时荧光定量PCR方法,根据PCV4 Rep基因的保守区域设计引物,建立针对PCV4的SYBR Green Ⅰ实时荧光定量PCR检测方法,并对该方法的特异性、灵敏性和重复性进行评价。结果显...为建立一种灵敏、可快速检测猪圆环病毒4型(PCV4)的SYBR Green Ⅰ实时荧光定量PCR方法,根据PCV4 Rep基因的保守区域设计引物,建立针对PCV4的SYBR Green Ⅰ实时荧光定量PCR检测方法,并对该方法的特异性、灵敏性和重复性进行评价。结果显示,该检测方法的Ct值与标准品在5.64×10~2~5.64×10~9 copies/μL范围内呈良好的线性关系,R^2为0.999,斜率为-3.638,检测下限为5.64×10~2 copies/μL,且无非特异性扩增。利用该方法对56份临床样品进行检测,发现PCV4核酸阳性率为3.57%,比普通PCR更灵敏可靠。结果表明,本试验建立的SYBR Green Ⅰ实时荧光定量PCR方法可用于PCV4的快速诊断。展开更多
文摘猪圆环病毒2型(PCV2)可引起仔猪的断奶后多系统衰竭综合征(PMWS)、猪皮炎肾病综合征(PDNS)等疾病,PCV基因型多且常以混合感染为主,给养殖场造成严重经济损失。为建立一种能同时检测PCV2、PCV3、PCV4的荧光定量PCR(q PCR)方法,本研究根据PCV2、PCV3和PCV4的rep基因序列,设计特异性引物和探针,利用三维响应面曲线优化扩增条件,建立了一种可同时检测3种PCV的三重Taq Man qPCR方法。通过将扩增的PCV2、PCV3、PCV4的rep基因片段克隆至pUC-57载体,构建重组质粒标准品,并经测序鉴定。特异性试验中,结果显示该方法仅对PCV2、PCV3、PCV4检测为阳性,对其他常见猪病毒及细菌检测结果均为阴性,特异性强;敏感性试验中,使用构建的3种重组质粒标准品等体积混合再10倍倍比稀后经该三重qPCR检测,结果显示该方法对PCV2、PCV3、PCV4重组质粒标准品的检测限分别为1×10^(1)拷贝/μL、1×10^(2)拷贝/μL、1×10^(0)拷贝/μL,敏感性较高;重复性试验中,采用本研究建立的三重qPCR方法分别对3种浓度PCV2、PCV3、PCV4重组质粒标准品进行组内和组间重复性检测,结果显示该方法组内和组间重复性试验的变异系数分别小于3.34%和2.77%,重复性较好。利用该方法检测浙江省送检的共120份仔猪组织病料及肛拭子样品,并利用已发表的检测PCV2、PCV3及PCV4的SYBR Green I qPCR方法同时检测,结果显示,本研究建立的方法对PCV2的检出率为60.8%(73/120),对PCV3的检出率为45.8%(55/120),对PCV4的检出率为25.8%(31/120);SYBR Green I qPCR法对PCV2的检出率为65%(78/120),对PCV3的检出率为45.8%(55/120),对PCV4的检出率为27.5%(33/120);两种检测方法的总符合率均为92.5%(111/120)。本研究首次建立了可用于鉴别检测临床样品中PCV2、PCV3、PCV4感染的q PCR鉴别检测方法,为猪场PCV感染的防控奠定基础。
文摘为建立一种灵敏、可快速检测猪圆环病毒4型(PCV4)的SYBR Green Ⅰ实时荧光定量PCR方法,根据PCV4 Rep基因的保守区域设计引物,建立针对PCV4的SYBR Green Ⅰ实时荧光定量PCR检测方法,并对该方法的特异性、灵敏性和重复性进行评价。结果显示,该检测方法的Ct值与标准品在5.64×10~2~5.64×10~9 copies/μL范围内呈良好的线性关系,R^2为0.999,斜率为-3.638,检测下限为5.64×10~2 copies/μL,且无非特异性扩增。利用该方法对56份临床样品进行检测,发现PCV4核酸阳性率为3.57%,比普通PCR更灵敏可靠。结果表明,本试验建立的SYBR Green Ⅰ实时荧光定量PCR方法可用于PCV4的快速诊断。
