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两步化学转化法构建猪圆环病毒2型ORF2基因重组腺病毒质粒 被引量:3
1
作者 郭全海 陈陆 +4 位作者 王川庆 吴德峰 李志娟 王永生 刘扬科 《江苏农业科学》 CSCD 北大核心 2010年第5期48-50,共3页
为了利用化学转化法快速构建携带猪圆环病毒2型ORF2基因的重组腺病毒质粒以便获得表达该基因的重组腺病毒,首先把骨架质粒pAdeasy-1通过化学法转化到氯化钙法制备的E.coliB J5183感受态菌中,通过含氨苄青霉素的LB平板筛选出含骨架质粒... 为了利用化学转化法快速构建携带猪圆环病毒2型ORF2基因的重组腺病毒质粒以便获得表达该基因的重组腺病毒,首先把骨架质粒pAdeasy-1通过化学法转化到氯化钙法制备的E.coliB J5183感受态菌中,通过含氨苄青霉素的LB平板筛选出含骨架质粒的阳性菌B J5183/p,再次用化学法把插入有猪圆环病毒2型ORF2基因的穿梭质粒rpShuttle-CMV-276经Pm eⅠ酶切线性化后转化到B J5183/p感受态细胞中进行同源重组,再在含卡那霉素的LB平板上培养,筛选出卡那霉素抗性菌进行质粒抽提纯化,酶切并电泳鉴定,获得重组阳性质粒rPAD-276。结果表明,运用2步化学转化法构建重组腺病毒质粒是一种简便、快捷且容易操作的方法。 展开更多
关键词 化学转化法 猪圆环病毒2型orf2基因 重组 病毒质粒 构建
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猪圆环病毒2型ORF2基因片段的克隆与原核表达 被引量:7
2
作者 祁艳华 王爱萍 +4 位作者 李学伍 游雷鸣 史平玲 胡峰 张改平 《河南农业科学》 CSCD 北大核心 2010年第3期112-115,共4页
为在原核表达系统中表达猪圆环病毒2型(PCV2)ORF2基因片段,提取感染PCV2的细胞基因组DNA,PCR扩增ORF2基因片段并克隆至pMD-18T载体上,经PCR、酶切及测序鉴定后,将该基因重组至pET-28a原核表达载体,构建了表达载体pET-28a-ORF2。该重组... 为在原核表达系统中表达猪圆环病毒2型(PCV2)ORF2基因片段,提取感染PCV2的细胞基因组DNA,PCR扩增ORF2基因片段并克隆至pMD-18T载体上,经PCR、酶切及测序鉴定后,将该基因重组至pET-28a原核表达载体,构建了表达载体pET-28a-ORF2。该重组质粒在大肠杆菌BL21中经1mmol/LIPTG于37℃诱导5h得到最佳表达。表达重组蛋白的分子量为26.0kD,以包涵体形式存在。Western-Blot分析表明,该重组蛋白与PCV2阳性血清发生特异性反应,表明该重组蛋白具有良好的反应原性。 展开更多
关键词 病毒2 orf2基因 克隆 原核表达
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猪圆环病毒2型ORF2基因的原核表达 被引量:9
3
作者 郭春艳 葛俊伟 李一经 《东北农业大学学报》 CAS CSCD 北大核心 2009年第6期79-84,共6页
猪圆环病毒是引起猪多系统衰竭综合征的重要病原,全病毒培养十分困难,避开培养病毒,得到大量的检测抗原,对诊断本病有着重要的意义。本研究对疑似猪圆环病毒2型感染猪脾脏提取病毒DNA,进行套式PCR扩增获得了猪圆环病毒2型(PCV2)ORF2基... 猪圆环病毒是引起猪多系统衰竭综合征的重要病原,全病毒培养十分困难,避开培养病毒,得到大量的检测抗原,对诊断本病有着重要的意义。本研究对疑似猪圆环病毒2型感染猪脾脏提取病毒DNA,进行套式PCR扩增获得了猪圆环病毒2型(PCV2)ORF2基因序列,并将扩增片段定向插入质粒载体pPRO-HTb,转化BL21大肠杆菌后,构建了表达猪圆环病毒2型ORF2蛋白的重组原核表达系统。经IPTG诱导,对表达产物经SDS-PAGE和Western-blot分析,表明ORF2基因在大肠杆菌中得到了表达,表达产物以包涵体形式存在于菌体中,通过提取包涵体,获得了初步纯化的ORF2蛋白,为进一步利用PCV2ORF2蛋白抗原进行PCV血清学检测提供了基础。 展开更多
关键词 病毒2 orf2基因 克隆 表达
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白介素2基因与猪圆环病毒2型ORF2基因真核双表达质粒的构建 被引量:3
4
作者 潘群兴 何孔旺 +2 位作者 温立斌 郭容利 黄克和 《南京农业大学学报》 CAS CSCD 北大核心 2009年第1期100-104,共5页
应用基因重组技术,构建猪圆环病毒2型ORF2基因与白介素2基因(IL-2)的真核双表达载体并将其转染CHO细胞,通过RT-PCR、间接ELISA、Western-blot、间接免疫荧光检测(IFA)等方法验证基因的表达情况。结果表明:成功构建了猪圆环病毒2型ORF2... 应用基因重组技术,构建猪圆环病毒2型ORF2基因与白介素2基因(IL-2)的真核双表达载体并将其转染CHO细胞,通过RT-PCR、间接ELISA、Western-blot、间接免疫荧光检测(IFA)等方法验证基因的表达情况。结果表明:成功构建了猪圆环病毒2型ORF2基因和IL-2基因的真核双表达质粒pIRES-ORF2-IL-2,该质粒可在体外同时表达ORF2和IL-2。 展开更多
关键词 病毒2 orf2基因 IL-2基因 DNA疫苗
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两株猪圆环病毒2型ORF2基因的克隆和序列分析 被引量:4
5
作者 何逸民 罗玉均 +5 位作者 潘全会 吴翠花 曹宗喜 孔留五 李少方 张桂红 《动物医学进展》 CSCD 2007年第11期4-7,共4页
根据GenBank中猪圆环病毒2型(PCV-2)ORF2基因序列,设计一对引物,从分离的PCV-2GZ株、HN株的细胞培养物中扩增出ORF2基因(702bp)。将此基因片段克隆入pMD18-T载体,筛选获得重组质粒pMD-ORF2,并对其测序。结果表明,所克隆的ORF2基因与其他... 根据GenBank中猪圆环病毒2型(PCV-2)ORF2基因序列,设计一对引物,从分离的PCV-2GZ株、HN株的细胞培养物中扩增出ORF2基因(702bp)。将此基因片段克隆入pMD18-T载体,筛选获得重组质粒pMD-ORF2,并对其测序。结果表明,所克隆的ORF2基因与其他PCV-2的ORF2基因核苷酸序列同源性在90.6%~99.6%之间,推导的氨基酸序列同源性在88.9%~98.7%之间。 展开更多
关键词 病毒2 orf2 序列分析
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猪圆环病毒2型ORF2基因的表达及活性研究 被引量:2
6
作者 陈涛 闫若潜 +4 位作者 谢彩华 吴志明 张志凌 张健 刘英 《动物医学进展》 CSCD 北大核心 2009年第2期35-38,共4页
根据猪圆环病毒2型(PCV-2)基因序列设计1对特异性引物,PCR扩增PCV-2去核定位信号(nuclear localization signal,NLS)的Cap蛋白基因(ORF2),经BamHⅠ/HindⅢ双酶切后将其克隆到表达载体pQE30中并转化大肠埃希菌JM109,采用IPTG进行诱导表达... 根据猪圆环病毒2型(PCV-2)基因序列设计1对特异性引物,PCR扩增PCV-2去核定位信号(nuclear localization signal,NLS)的Cap蛋白基因(ORF2),经BamHⅠ/HindⅢ双酶切后将其克隆到表达载体pQE30中并转化大肠埃希菌JM109,采用IPTG进行诱导表达,采用自行创新的纯化方法对表达的融合蛋白进行纯化,Western blot鉴定纯化后的重组Cap蛋白(rCap)活性。结果表明,成功克隆了无核定位信号的ORF2基因,其分子质量大小为579 bp;表达的rCap蛋白大小为24.1 ku左右,与预期大小相一致;经纯化后的rCap蛋白纯度在95%以上;Western blot鉴定结果表明,Cap蛋白可以和抗PCV-2抗体反应,具有很好的抗原性。本研究为进一步建立以Cap蛋白为包被抗原的PCV-2间接ELISA诊断方法以及PCV-2疫苗的研究奠定了基础。 展开更多
关键词 病毒2(PCV-2) 克隆 表达 纯化 活性
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猪圆环病毒2型ORF2基因的原核表达 被引量:2
7
作者 敬晓棋 吴发兴 +2 位作者 丛丽媛 张佩君 陈德坤 《西北农林科技大学学报(自然科学版)》 CSCD 北大核心 2010年第5期8-12,共5页
【目的】构建猪圆环病毒2型(PCV2)ORF2原核表达质粒载体,高效重组表达PCV2壳蛋白Cap,为进一步建立PCV2 ELISA的检测方法及Cap蛋白单克隆抗体的制备研究奠定基础。【方法】根据猪圆环病毒2型ORF2基因序列设计带有BamHⅠ、HindⅢ酶切位点... 【目的】构建猪圆环病毒2型(PCV2)ORF2原核表达质粒载体,高效重组表达PCV2壳蛋白Cap,为进一步建立PCV2 ELISA的检测方法及Cap蛋白单克隆抗体的制备研究奠定基础。【方法】根据猪圆环病毒2型ORF2基因序列设计带有BamHⅠ、HindⅢ酶切位点的引物,进行ORF2的PCR体外扩增。用扩增的ORF2基因构建pMD18-T-ORF2质粒,经测序检测正确后,与pET-32a(+)连接获得原核表达重组质粒pET-32a-ORF2。重组质粒pET-32a-ORF2转化BL21-ΔE3后用IPTG诱导表达,对获得的纯化表达产物进行了SDS-PAGE电泳、Western blot检测。【结果】PCR扩增得到了预期580 bp的目的基因,连接载体后经测序完全正确;pET-32a-ORF2在BL21-ΔE3得到高效表达,获得以包涵体形式存在的体外重组原核表达PCV2 Cap蛋白;Western blot检测结果表明,所得到的蛋白能够识别PCV2多克隆抗体。【结论】重组质粒pET-32a-ORF2在BL21-ΔE3高效表达重组PCV2 Cap蛋白,且具有免疫学生物活性。 展开更多
关键词 病毒2 orf2 原核表达
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猪圆环病毒2型ORF2基因的定点突变及其真核表达载体的构建 被引量:2
8
作者 张艳萍 苏丹萍 贺东生 《中国畜牧兽医》 CAS 北大核心 2011年第2期99-103,共5页
根据GenBank发表的猪圆环病毒2型(PCV2)ORF2基因序列设计并合成引物,采用重叠延伸PCR(splice overlap extension PCR,SOE-PCR)定点诱变技术对ORF2基因进行定点突变。DNA测序结果表明,ORF2基因片段的372—378 bp处的碱基由TCTAGAT突变为A... 根据GenBank发表的猪圆环病毒2型(PCV2)ORF2基因序列设计并合成引物,采用重叠延伸PCR(splice overlap extension PCR,SOE-PCR)定点诱变技术对ORF2基因进行定点突变。DNA测序结果表明,ORF2基因片段的372—378 bp处的碱基由TCTAGAT突变为ATTGGAT,从而破坏酶切位点XbaⅠ,成功获得ORF2的突变基因片段。进而将其连接到腺病毒真核表达载体pAD5-Blue中,成功构建真核表达载体,并获得PCV2的Cap蛋白表达产物,为PCV2新型疫苗研究奠定了重要基础。 展开更多
关键词 病毒2 orf2基因 重叠延伸PCR pAD5-Blue CAP蛋白
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猪圆环病毒2型ORF2基因在PcDNA3.1中的表达效果
9
作者 车勇良 石运通 +6 位作者 庄向生 陈少莺 王隆柏 魏宏 陈如敬 吴学敏 周伦江 《福建农业学报》 CAS 2011年第2期166-169,共4页
[目的]构建猪圆环病毒2型(Porcine circovirus 2,PCV2)ORF2 DNA核酸疫苗,并评价其免疫效果和安全性。[方法]设计一对特异性引物,扩增PCV2-ORF2,利用T载体对其进行克隆,与真核表达载体PcDNA3.1在同等条件下进行双酶切,并进行连接,转化感... [目的]构建猪圆环病毒2型(Porcine circovirus 2,PCV2)ORF2 DNA核酸疫苗,并评价其免疫效果和安全性。[方法]设计一对特异性引物,扩增PCV2-ORF2,利用T载体对其进行克隆,与真核表达载体PcDNA3.1在同等条件下进行双酶切,并进行连接,转化感受态细菌DH5α并克隆,经双酶切鉴定筛选阳性重组质粒,即DNA核酸疫苗,命名为PcDNA3.1-ORF2。将该核酸疫苗瞬时转染Vero细胞,通过RT-PCR鉴定其在细胞内的表达情况;并且将该核酸疫苗按100μg.只-1腿部肌肉注射免疫Balb/c小鼠,同时设PBS和PcDNA3.1空载体为对照,免疫2次,间隔2周。分别于首免后第14 d和第28 d采血,用ELISA方法检测其血清抗体。取首免后56 d小鼠的心、肝、脾、肺、肾和脑等实质器官,采用PCR方法检测该核酸疫苗的安全性。[结果]成功地构建了PcDNA3.1-ORF2核酸疫苗,在体外Vero细胞中得到了瞬时表达,并且能诱导小鼠产生较强的免疫应答。安全性试验表明该核酸疫苗未整合到小鼠染色体上。[结论]PcDNA3.1-ORF2核酸疫苗可以诱导小鼠产生较强的免疫应答,并且是安全的。 展开更多
关键词 病毒2 orf2 DNA疫苗 PCDNA3.1
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猪圆环病毒2型ORF2基因克隆及其在大肠杆菌中的融合表达
10
作者 王老七 陶海静 +1 位作者 郑宝亮 边传周 《中国兽医杂志》 CAS 北大核心 2007年第7期16-18,共3页
关键词 病毒2 断奶后多系统衰竭综合征 融合表达 大肠杆菌 基因克隆 orf2 PCV2 继发感染
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保定地区猪圆环病毒2型ORF2基因的克隆与序列分析
11
作者 张秀珊 刘刚 +1 位作者 李淑梅 孙继国 《中国兽医杂志》 CAS 北大核心 2009年第5期86-88,共3页
关键词 病毒2 orf2基因 序列分析 保定地区 克隆 PCV2 DNA病毒 粒子直径
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猪圆环病毒2型ORF2基因原核表达蛋白间接ELISA检测方法的建立
12
作者 高超 肖冲 +1 位作者 高瑞峰 胡桂学 《安徽农业科学》 CAS 北大核心 2010年第32期18224-18226,共3页
[目的]建立一种检测PCV2血清抗体的间接ELISA方法。[方法]从已构建的克隆质粒pMD-ORF2上酶切回收ORF2基因的羧基端部分ORFc片段,克隆到pGEX-6P-1表达载体上,构建原核表达质粒pGEX-ORFc,转化入大肠杆菌BL21进行原核表达,用Western-blot... [目的]建立一种检测PCV2血清抗体的间接ELISA方法。[方法]从已构建的克隆质粒pMD-ORF2上酶切回收ORF2基因的羧基端部分ORFc片段,克隆到pGEX-6P-1表达载体上,构建原核表达质粒pGEX-ORFc,转化入大肠杆菌BL21进行原核表达,用Western-blot法检测纯化蛋白,将其作为抗原包被酶标板,优化间接ELISA试验条件,从而建立检测PCV2血清抗体的间接ELISA方法。[结果]重组表达质粒的酶切鉴定证明已成功构建重组表达质粒pGEX-ORFc,其在E.coliBL21中诱导5、6 h时表达效果最好。纯化后的蛋白条带与原重组菌位置一致均在40.0 kD处,证明重组蛋白得到良好纯化。试验确定抗原最佳包被浓度为12.85μg/m l,血清稀释度为1∶40。3次重复检测表明,变异系数最大为7.12%。[结论]建立的ELISA方法对检测PCV2感染具有良好的特异性及重复性。 展开更多
关键词 病毒2 原核表达 ELISA
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猪圆环病毒2型ORF2基因的原核表达及反应原性分析 被引量:6
13
作者 欧云文 马小元 +3 位作者 王俊 丁耀忠 张永光 张杰 《动物医学进展》 北大核心 2017年第4期1-6,共6页
研究猪圆环病毒2型(PCV2)Cap蛋白的抗原性,为开发PCV2的检测方法奠定基础。以PCV2CAU0673毒株的DNA为模板,扩增获得702bp的目的片段,扩增产物克隆入pET30a(+)原核表达载体,构建pET30a-PCV2-ORF2重组质粒,转入大肠埃希菌BL21(DE3);在37℃... 研究猪圆环病毒2型(PCV2)Cap蛋白的抗原性,为开发PCV2的检测方法奠定基础。以PCV2CAU0673毒株的DNA为模板,扩增获得702bp的目的片段,扩增产物克隆入pET30a(+)原核表达载体,构建pET30a-PCV2-ORF2重组质粒,转入大肠埃希菌BL21(DE3);在37℃以1mmol/L IPTG诱导表达6h;采用Ni-NTA树脂亲和层析纯化重组蛋白,并用不同浓度的尿素对纯化蛋白进行复性。SDSPAGE分析表明,该ORF2编码基因在大肠埃希菌中得到表达,蛋白大小约为34ku;Western blot检测结果表明,该重组Cap蛋白与PCV2阳性血清发生特异性反应,与NA-PRRSV和PPV1血清不发生交叉反应。成功构建了PCV2-ORF2原核表达载体,实现了在大肠埃希菌中的表达,纯化后的复性蛋白具有较好的反应原性,为猪圆环病毒2型检测方法建立或试剂盒的开发奠定了基础。 展开更多
关键词 病毒2 orf2基因 原核表达 反应原性
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猪圆环病毒2型ORF2基因重组植物乳杆菌的构建及其免疫原性分析 被引量:5
14
作者 倪能能 王新珂 +2 位作者 赖强 焦茂兴 黄毓茂 《中国畜牧兽医》 CAS 北大核心 2017年第8期2408-2416,共9页
为研制一种能有效控制猪圆环病毒2型(porcine circovirus type 2,PCV2)的新型疫苗,本试验将PCV2的ORF2基因克隆至植物乳杆菌表达载体pSCPSP超强启动子SCP的下游,构建重组表达质粒pSCPSP-Cap,用电击转化法转化克隆至表达宿主菌植物乳杆菌... 为研制一种能有效控制猪圆环病毒2型(porcine circovirus type 2,PCV2)的新型疫苗,本试验将PCV2的ORF2基因克隆至植物乳杆菌表达载体pSCPSP超强启动子SCP的下游,构建重组表达质粒pSCPSP-Cap,用电击转化法转化克隆至表达宿主菌植物乳杆菌,获得一株重组植物乳杆菌。以SDS-PAGE和Western blotting法检测24h上清液中表达的蛋白;将8周龄的SPF级BALB/c小鼠随机分组,每组8只,分别设置对照组、空载体组、灌胃组、饮水组、灭活疫苗组,试验14、28、42和56d后对小鼠采血,分离血清,利用PCV2ELISA抗体检测试剂盒检测小鼠血清中PCV2的抗体水平。SDS-PAGE、Western blotting结果显示,PCV2衣壳蛋白在植物乳杆菌中成功分泌表达,表达的蛋白分子质量为28ku,且具有良好的反应原性,重组植物乳杆菌免疫小鼠诱导机体产生PCV2特异性抗体显著高于其他组(P<0.05)。结果表明,PCV2的ORF2基因在植物乳杆菌中成功表达,且具有良好的生物活性,可为PCV2口服疫苗的开发研究提供理论参考。 展开更多
关键词 病毒2 CAP蛋白 植物乳杆菌 表达 口服疫苗
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7株猪圆环病毒2型ORF2基因的克隆及序列分析 被引量:3
15
作者 程伟 张志 +3 位作者 吴发兴 张燕霞 李晓成 陈德坤 《西北农业学报》 CAS CSCD 北大核心 2011年第5期25-30,共6页
根据GenBank中猪圆环病毒2型的ORF2序列,设计1对引物,运用PCR方法,对中国动物卫生与流行病学中心监测室从福建、湖南和辽宁3省分离的7个毒株进行ORF2基因扩增。将其克隆到pGEM-Teasy载体,筛选阳性重组质粒进行测序。应用DNAstar软件将... 根据GenBank中猪圆环病毒2型的ORF2序列,设计1对引物,运用PCR方法,对中国动物卫生与流行病学中心监测室从福建、湖南和辽宁3省分离的7个毒株进行ORF2基因扩增。将其克隆到pGEM-Teasy载体,筛选阳性重组质粒进行测序。应用DNAstar软件将测序结果与国内外参考毒株进行比对,并对Cap蛋白的细胞表位、糖基化位点等进行分析。结果表明,HUN、HUN-2和LN-19分离株ORF2基因大小为702bp,编码233个氨基酸;FJ-3、FJ-4、HUN-11和LN-3的ORF2基因大小为705bp,编码234个氨基酸。Cap蛋白5个表位区A(47~63)、B(65~87)、C(113~139)、D(165~200)和E(C端最后4个氨基酸)均发生一定变异。同源性分析表明,24株序列同源性为90.5%~99.9%,FJ-3与美国株同源性最低(90.5%),HUN和AF055393、DQ180392同源性最高(99.9%);FJ-3和FJ-4为94.5%,HUN-11和HUN-2为94.3%,HUN和HUN-2为99.3%,HUN和HUN-11为95%,LN-3和LN-19为94.7%,表明各地区ORF2基因比较稳定,但也存在一定差异。 展开更多
关键词 病毒2 克隆 序列分析
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猪圆环病毒2型ORF2基因的原核表达及其免疫原性检测
16
作者 梁晓艳 李玉林 +4 位作者 李兆学 王继美 贾丽锋 周贺娟 王云龙 《动物医学进展》 CSCD 北大核心 2010年第9期63-67,共5页
以病猪脾脏组织为材料,提取总RNA,通过RT-PCR得到579 bp的猪圆环病毒2型(PCV-2)/ORF2片段,与原核表达载体pET32a重组,通过菌落PCR鉴定、双酶切鉴定及测序鉴定后,证实重组质粒pET32a/ORF2构建成功,将其转化入表达菌Balgold,通过IPTG诱导... 以病猪脾脏组织为材料,提取总RNA,通过RT-PCR得到579 bp的猪圆环病毒2型(PCV-2)/ORF2片段,与原核表达载体pET32a重组,通过菌落PCR鉴定、双酶切鉴定及测序鉴定后,证实重组质粒pET32a/ORF2构建成功,将其转化入表达菌Balgold,通过IPTG诱导表达,利用Ni-NTA亲和层析纯化目的产物,Western blot验证其免疫原性,重组蛋白免疫Balb/c小鼠,检测小鼠体内中和抗体滴度。获得的重组蛋白包涵体的形式出现,表达量占菌体总蛋白的30%,变性纯化后纯度达90%以上,Western blot证实重组蛋白能与PCV-2阳性血清发生反应,免疫Balb/c小鼠45 d后中和抗体滴度达到1∶22。 展开更多
关键词 病毒 orf2 原核表达 免疫原性
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猪圆环病毒2型ORF2基因及其编码蛋白的研究概况 被引量:1
17
作者 陈燕凌 王颖旺 +3 位作者 黄恒 金仕强 赵玲 徐凯 《湖北畜牧兽医》 2013年第1期78-81,共4页
结合国内外对猪圆环病毒2型(porcine circovirus2,PCV2)的研究,重点对猪圆环病毒2型ORF2基因及其编码蛋白的抗原表位和功能应用研究进行简要综述,为猪圆环病毒2型新型疫苗研究和建立诊断检测方法研究方面提供参考。
关键词 病毒 orf2基因 抗原表位
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猪圆环病毒2型ORF2基因在巴斯德毕赤酵母中的表达
18
作者 刘娜 吴锋 黄毓茂 《广东畜牧兽医科技》 2015年第1期40-43,共4页
为探索猪圆环病毒2型ORF2基因(PCV2 ORF2)的高效表达,本实验将ORF2基因整合到酵母表达载体p GAPZαA中,构建重组质粒p GAPZαA-ORF2。通过AvrⅡ酶切线性化,经电穿孔法转到毕赤酵母菌X33中。经ZeocinTM抗性筛选得到转化子,在GAP强启动子... 为探索猪圆环病毒2型ORF2基因(PCV2 ORF2)的高效表达,本实验将ORF2基因整合到酵母表达载体p GAPZαA中,构建重组质粒p GAPZαA-ORF2。通过AvrⅡ酶切线性化,经电穿孔法转到毕赤酵母菌X33中。经ZeocinTM抗性筛选得到转化子,在GAP强启动子调控下,通过SDS-PAGE分析和Western blotting鉴定,结果证实Cap蛋白在酵母载体p GAPZαA中得到成功分泌表达。 展开更多
关键词 病毒 巴斯德毕赤酵母 orf2 分泌表达
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表达猪圆环病毒2d型Cap蛋白的重组猪伪狂犬病病毒的构建
19
作者 焦显芹 马晓 +3 位作者 田润博 刘颖 马世杰 陈红英 《中国畜牧兽医》 北大核心 2025年第5期2278-2286,共9页
【目的】利用同源重组技术和CRISPR/Cas9基因编辑技术,获得表达猪圆环病毒2d型(PCV2d)Cap蛋白的重组猪伪狂犬病病毒(PRV),为开发预防和控制PCV2d和PRV感染的疫苗提供技术支持。【方法】基于PCV2d KF1株ORF 2基因序列设计1对特异引物,以P... 【目的】利用同源重组技术和CRISPR/Cas9基因编辑技术,获得表达猪圆环病毒2d型(PCV2d)Cap蛋白的重组猪伪狂犬病病毒(PRV),为开发预防和控制PCV2d和PRV感染的疫苗提供技术支持。【方法】基于PCV2d KF1株ORF 2基因序列设计1对特异引物,以PCV2d KF1株DNA为模板扩增ORF 2基因。经限制性内切酶Bam HⅠ酶切后将ORF 2基因引入到含有绿色荧光蛋白(EGFP)基因的PRV转移载体pG中,获得重组质粒pG-PCV2d-EGFP。运用转染试剂ZLip2000将质粒pG-PCV2d-EGFP和PRV三基因缺失毒株gE^(-)/gI^(-)/TK^(-)PRV NY DNA共转染至ST单层细胞中拯救重组病毒,并利用CRISPR/Cas9 EGFP基因双敲除质粒敲除重组病毒中EGFP基因。经EGFP基因测序、PCR和Western blotting对获得的重组病毒进行鉴定。【结果】经8轮绿色荧光蚀斑筛选,纯化得到重组病毒rPRV-PCV2d-EGFP。CRISPR/Cas9 EGFP基因双敲除质粒敲除EGFP基因后,经3轮筛选没有绿色荧光的蚀斑,获得重组病毒rPRV-PCV2d。EGFP基因测序结果表明,rPRV-PCV2d中EGFP基因被剪截了1251 bp,PCR和Western blotting结果显示,rPRV-PCV2d携带的ORF 2基因能在ST细胞中转录与表达。【结论】本研究成功构建表达PCV2d Cap蛋白的重组病毒rPRV-PCV2d,为进一步研制重组活载体疫苗奠定了基础。 展开更多
关键词 病毒2 伪狂犬病病毒 重组病毒活载体疫苗
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猪圆环病毒2型病毒样颗粒三倍轴区域嵌合猪细小病毒抗原表位的展示策略及免疫原性
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作者 蔡云凤 李宏 +8 位作者 黄小铭 何庆 丁振宇 余婉婷 罗施乐 陈方志 王乃东 杨毅 湛洋 《畜牧兽医学报》 北大核心 2025年第1期307-318,共12页
为了探索猪圆环病毒2型(porcine circovirus type 2, PCV2)病毒样颗粒三倍轴区域展示外源抗原表位的潜力,本研究借助结构模拟和蛋白质的三维结构展示,分析了PCV2核衣壳表面氨基酸残基突变后的结构差异。通过分析不同cap基因突变质粒在... 为了探索猪圆环病毒2型(porcine circovirus type 2, PCV2)病毒样颗粒三倍轴区域展示外源抗原表位的潜力,本研究借助结构模拟和蛋白质的三维结构展示,分析了PCV2核衣壳表面氨基酸残基突变后的结构差异。通过分析不同cap基因突变质粒在大肠杆菌表达系统中所表达的突变体蛋白的可溶性和纯化难易程度,确定合适的外源表位嵌合区。将嵌合PPV抗原表位的Cap蛋白经体外组装获得重组的病毒样颗粒,将此病毒样颗粒免疫小鼠,通过抗体检测来评价其免疫原性。结果显示,PCV2核衣壳表面三倍轴区域存在两个适合用于展示外源表位的氨基酸区域(分别命名为Motif A和Motif B),相同表达条件下,Motif A区域的突变蛋白均以可溶性表达为主,且能一步纯化获得目的蛋白,而Motif B区域的突变蛋白多以包涵体形式存在;Motif A区域嵌合PPV表位后,纯化的重组蛋白能在体外组装成cVLPs,并通过间接免疫荧光试验证明其保留有野生型VLPs内化PK15细胞的能力;形成的cVLPs能刺激小鼠机体产生分别针对PCV2 VLPs、B5-E1表位和PPV VP2蛋白的抗体。综上表明,PCV2 Cap蛋白Loop GH区域Motif A能够将外源表位展示在病毒样颗粒外表面,并且能够被机体免疫细胞识别产生特异性抗体。 展开更多
关键词 病毒2 病毒样颗粒 三倍轴区域 外源表位
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