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猪传染性胃肠炎病毒S、N基因DNA疫苗载体构建及其免疫原性 被引量:1
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作者 成伟伟 容维中 +5 位作者 杨明 李元新 赵子惠 陈伯祥 王佳 周瑶 《福建农业学报》 CAS CSCD 北大核心 2024年第9期1035-1043,共9页
【目的】构建猪传染性胃肠炎病毒(transmissible gastroenteritis virus,TGEV)S、N基因的DNA疫苗载体,并进行免疫原性试验,为猪传染性胃肠炎(transmissible gastroenteritis,TGE)的防控和DNA疫苗研究提供技术支撑和基础数据。【方法】扩... 【目的】构建猪传染性胃肠炎病毒(transmissible gastroenteritis virus,TGEV)S、N基因的DNA疫苗载体,并进行免疫原性试验,为猪传染性胃肠炎(transmissible gastroenteritis,TGE)的防控和DNA疫苗研究提供技术支撑和基础数据。【方法】扩增S基因的A位点、D位点和N基因,并将N基因(单独)、A位点和D位点(融合)克隆至pCDNA3.1-His-C构建重组疫苗载体,运用生物信息学软件预测分析S(A-D)蛋白、N蛋白二级结构组成、三级构像、亚细胞定位和优势B细胞抗原表位。将构建成功的重组载体分别转染至PK-15细胞进行间接免疫荧光试验,运用共聚焦检测重组蛋白的表达分布情况。将重组疫苗载体单独或联合免疫小鼠,运用间接ELISA检测IgG抗体水平。【结果】扩增出S基因的A位点、D位点和N基因,大小分别为498、606、1149 bp。构建了A位点与D位点(融合)、N基因(单独)的DNA疫苗重组载体p-S(A-D)-His和p-N-His。生物信息学软件预测分析发现TGEV感染宿主细胞时N蛋白主要定位于细胞核和线粒体,S(A-D)蛋白主要定位于细胞质和线粒体,S(A-D)蛋白具有7个优势B细胞抗原表位,N蛋白具有8个优势B细胞抗原表位。重组载体p-S(A-D)-His和p-N-His均在PK-15细胞内成功表达,且S(A-D)-His和N-His在PK-15细胞核和细胞质中均有分布。重组疫苗载体免疫小鼠后,免疫效果由高至低依次为p-N-His>p-S(A-D)-His+p-N-His>p-S(A-D)-His。【结论】本研究构建了TGEV的S、N基因的DNA疫苗载体,免疫小鼠后均产生了较强的特异性抗体,为TGEV的核酸疫苗的研制提供了基础材料和依据。 展开更多
关键词 猪传染性胃肠炎病毒 S基因 N基因 载体构建 免疫原性
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猪传染性胃肠炎病毒RT-CPA检测方法构建及初步应用 被引量:1
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作者 赵子惠 陈伯祥 +3 位作者 王佳 成伟伟 杨明 李元新 《中国动物传染病学报》 CAS 北大核心 2024年第5期65-71,共7页
为开发一种猪传染性胃肠炎病毒(Transmissible gastroenteritis virus,TGEV)RT-CPA快速且准确的检测方法。本试验根据TGEV S基因的D序列,设计了3对引物,使用构建的重组质粒作为标准阳性对照,通过优化筛选条件并应用可视化核酸试纸条,成... 为开发一种猪传染性胃肠炎病毒(Transmissible gastroenteritis virus,TGEV)RT-CPA快速且准确的检测方法。本试验根据TGEV S基因的D序列,设计了3对引物,使用构建的重组质粒作为标准阳性对照,通过优化筛选条件并应用可视化核酸试纸条,成功建立了一种一步法TGEV RT-CPA检测方法。本实验筛选最优条件为:Mg^(2+)浓度1.0 mmol/L,dNTP浓度0.8 mmol/L,Betaine浓度1.0 mol/L,BstDNA聚合酶浓度8.0 U,反应温度63℃,反应时间60 min,AMV逆转录酶5 U。本研究的扩增产物通过凝胶电泳显示出梯形条带,证明了其对TGEV的特异性检测和重复性良好,灵敏度高达10拷贝/μL。初步应用显示,该方法与TGEV抗原快速检测试剂盒的符合率超过90%,显示了高灵敏度。TGEV RT-CPA方法免去了RNA提取和cDNA合成的步骤,能够完成一步检测,且该方法不需要特殊仪器,适用于现场快速检测TGEV,为快速诊断和防控猪传染性胃肠炎提供了新的技术选择。 展开更多
关键词 猪传染性胃肠炎病毒 RT-CPA S基因 检测方法
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复方中药制剂对猪传染性胃肠炎病毒的体外作用研究 被引量:1
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作者 李元新 容维中 +4 位作者 成伟伟 杨明 赵子惠 周瑶 王佳 《畜牧兽医杂志》 2024年第6期58-62,共5页
为了探讨中药复方制剂对猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)在PK-15细胞上增殖的体外抑制作用。试验选择由白头翁、黄柏、青皮、炒白术、焦三仙、仙鹤草、木香7味中药提取物组成4个配方的复方中药制剂,采用同时给药、预防给药、治疗给药三种作用... 为了探讨中药复方制剂对猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)在PK-15细胞上增殖的体外抑制作用。试验选择由白头翁、黄柏、青皮、炒白术、焦三仙、仙鹤草、木香7味中药提取物组成4个配方的复方中药制剂,采用同时给药、预防给药、治疗给药三种作用方式,观察药物对病毒的抑制吸附穿入、直接杀灭和抑制复制作用。结果显示:以1mg/mL剂量的复方中药制剂在体外对TGEV在PK-15细胞上增殖影响,配方2优于其他3个配方,对TGEV有较好抑制作用,且直接杀灭作用对细胞的保护效果最好,细胞存活率达75%(P<0.01),并筛选出了同时具有3种方式抗病毒的有效复方中药制剂。该研究结果可为后续抗TGEV药物的筛选提供科学依据。 展开更多
关键词 复方中药制剂 猪传染性胃肠炎病毒 体外作用
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猪传染性胃肠炎病毒S基因RAA检测方法的建立与初步应用 被引量:1
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作者 吕林丹 牟豪 +5 位作者 胡霞 刘明妮 李绍梅 李星 宋振辉 杨柳 《畜牧兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2024年第8期3590-3599,共10页
本研究旨在建立一种基于猪传染性胃肠炎病毒(porcine transmissible gastroenteritis virus,TGEV)S基因便捷、高效和特异的由重组酶介导的核酸等温扩增(recombinase-aid amplification,RAA)检测方法。通过基因组序列比对,选择TGEV S基... 本研究旨在建立一种基于猪传染性胃肠炎病毒(porcine transmissible gastroenteritis virus,TGEV)S基因便捷、高效和特异的由重组酶介导的核酸等温扩增(recombinase-aid amplification,RAA)检测方法。通过基因组序列比对,选择TGEV S基因中特定片段为检测靶标,构建重组质粒pUC57-S,设计并筛选RAA引物和探针;建立RAA检测方法;评价该方法灵敏度、特异性和重复性;运用该方法检测腹泻临床样品,与荧光定量PCR方法比较检测结果的符合率。结果确定最佳引物对F2/R1和探针PF2;该方法在40℃恒温条件下,30 min即可完成反应;荧光型RAA法最低检出限可达1.34×10^(1)copies·μL^(-1);与猪流行性腹泻病毒、猪丁型冠状病毒、猪呼吸道冠状病毒等常见猪源病毒核酸无交叉反应;采用该方法检测107份临床样本,阳性率为5.61%(6/107),与荧光定量PCR法相比较,检测结果一致。本研究成功建立了一种灵敏、特异、可视化的RAA检测方法,可摆脱对昂贵设备、专业人员和检测技术的依赖,为临床检测TGEV提供良好的技术基础。 展开更多
关键词 猪传染性胃肠炎病毒 基础型RAA 荧光型RAA 可视化检测
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DEAD-box解旋酶21对猪传染性胃肠炎病毒复制的调控作用 被引量:1
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作者 谢立兰 尹杰 +1 位作者 黄冬蛾 李么明 《华北农学报》 CSCD 北大核心 2024年第4期215-222,共8页
旨在探究DEAD-box解旋酶21(DDX21)对猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)复制的调控作用。首先通过蛋白免疫印迹(Western Blot)分析了TGEV感染对DDX21表达的影响;进一步构建了猪DDX21真核表达质粒以及建立稳定敲低DDX21的PK-15细胞系,运用荧光定量... 旨在探究DEAD-box解旋酶21(DDX21)对猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)复制的调控作用。首先通过蛋白免疫印迹(Western Blot)分析了TGEV感染对DDX21表达的影响;进一步构建了猪DDX21真核表达质粒以及建立稳定敲低DDX21的PK-15细胞系,运用荧光定量PCR(RT-qPCR)、蛋白免疫印迹、间接免疫荧光(IFA)和半数细胞培养物感染量(TCID 50)探究外源过表达DDX21及敲低DDX21对TGEV体外复制的调控作用;构建一系列DDX21截短突变体真核表达质粒,鉴定了DDX21调控TGEV增殖的关键功能域。Western Blot分析显示,在TGEV WH-1株感染早期,PK-15细胞内源性DDX21蛋白的表达水平显著上调;RT-qPCR、Western Blot、IFA和TCID 50试验显示,超表达DDX21可以显著提高TGEV N基因的mRNA水平、N蛋白的表达及病毒滴度,且呈剂量依赖性,其601-784 aa区域是其影响TGEV复制的关键;与阴性对照相比,在相应DDX21敲低细胞系中TGEV的增殖显著被抑制,而回补试验逆转了DDX21敲低细胞系中TGEV的滴度。该研究首次揭示了猪DDX21对TGEV增殖的促进作用并鉴定了其调控TGEV复制的关键结构域,为今后研究DDX21蛋白的功能及TGEV的致病机理提供了理论依据。 展开更多
关键词 猪传染性胃肠炎病毒 DEAD-box解旋酶21 宿主蛋白 病毒复制
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微载体生物反应器培养猪传染性胃肠炎病毒最佳收获时间的研究
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作者 叶晓慧 《福建畜牧兽医》 2024年第5期32-34,共3页
本试验旨在探讨使用微载体生物反应器培养猪传染性胃肠炎病毒(Transmissible gastroenteritis virus,TGEV)的效果,对比不同时间段培养出的抗原效价,从而确定TGEV培养的最佳收获时间,提升抗原效价,为最终生产出高质量、品质稳定的TGEV活... 本试验旨在探讨使用微载体生物反应器培养猪传染性胃肠炎病毒(Transmissible gastroenteritis virus,TGEV)的效果,对比不同时间段培养出的抗原效价,从而确定TGEV培养的最佳收获时间,提升抗原效价,为最终生产出高质量、品质稳定的TGEV活疫苗奠定基础。在生物反应器细胞上罐时每次接入细胞量达到1.2×10~9个,按相同的条件进行培养。当微载体上的细胞长至单层致密时,进行细胞接毒,接毒后4 h开始取样,接着每隔2 h留样,18 h后每隔1 h取样1次,直到载体上细胞总脱落面积达80%~85%结束取样,检测抗原效价。结果表明:在接毒后20~21 h病毒效价达到峰值,故确定在接毒后20~21 h为病毒最佳收获时间。 展开更多
关键词 微载体生物反应器 猪传染性胃肠炎病毒 最佳收获时间 抗原效价
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猪传染性胃肠炎病毒、猪流行性腹泻病毒和猪轮状病毒A多重荧光定量RT-PCR检测方法的建立 被引量:15
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作者 李军 蔡良语 +9 位作者 陈兵 刘建利 孙洁 陈书琨 林庆燕 陶虹 吴绍强 卢体康 陈金顶 秦智锋 《中国预防兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2018年第9期801-805,共5页
为对引起腹泻症状的猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)、猪流行性腹泻病毒(PEDV)和猪轮状病毒A(PRoVA) 3种病毒同时快速地鉴别检测,本研究对GenBank中登录的TGEV的S基因、PEDV的S基因、PRo VA的NSP基因进行序列分析,分别设计了针对3种病毒的特... 为对引起腹泻症状的猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)、猪流行性腹泻病毒(PEDV)和猪轮状病毒A(PRoVA) 3种病毒同时快速地鉴别检测,本研究对GenBank中登录的TGEV的S基因、PEDV的S基因、PRo VA的NSP基因进行序列分析,分别设计了针对3种病毒的特异性引物和用3种荧光基团标记的核酸探针,通过条件优化建立了针对这3种病毒的多重荧光定量RT-PCR方法。结果显示,该方法能够特异性检测PEDV、TGEV和PRo VA,而与其它病原无交叉反应;对TGEV、PEDV和PRo VA的最低检测量分别为1.12拷贝/μL、39拷贝/μL和25拷贝/μL;组内和组间变异系数均小于5%;该方法与商品化的试剂盒检测结果符合率达100%。该方法快速、敏感,检测结果准确可靠,为猪病毒性腹泻疾病的流行病学调查和分子生物学快速诊断奠定了基础。 展开更多
关键词 猪传染性胃肠炎病毒 流行性腹泻病毒 轮状病毒A 荧光定量RT-PCR检测 多重检测
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紫甘薯花色苷制备及其抗猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)活性的研究 被引量:14
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作者 雷用东 陈姗姗 +3 位作者 赵晓燕 张莉 马越 童军茂 《食品工业科技》 CAS CSCD 北大核心 2012年第21期349-352,共4页
为研究紫甘薯花色苷对猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)的抑制作用,实验纯化了紫甘薯花色苷提取物,并采用液质联机的方法鉴定其结构组成;将制备的花色苷提取物作用于侵染TGEV的猪睾丸(ST)细胞,研究对TGEV诱导ST细胞的形态学变化和凋亡情况的影... 为研究紫甘薯花色苷对猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)的抑制作用,实验纯化了紫甘薯花色苷提取物,并采用液质联机的方法鉴定其结构组成;将制备的花色苷提取物作用于侵染TGEV的猪睾丸(ST)细胞,研究对TGEV诱导ST细胞的形态学变化和凋亡情况的影响,揭示花色苷对TGEV的预防和治疗效果。结果表明:紫甘薯花色苷提取物中主要含8种花色苷。花色苷质量浓度低于60μg/mL时,ST细胞生长良好且无细胞毒性;接种TGEV后,20μg/mL的花色苷就能抑制TGEV的增殖,且在安全浓度范围内抑制程度成剂量关系。在此体外实验中,花色苷对TGEV的预防效果比治疗效果更明显。结论:紫甘薯花色苷在20~60μg/mL质量浓度范围内对TGEV有很好的抗病毒功效。 展开更多
关键词 紫甘薯 花色苷 睾丸细胞 猪传染性胃肠炎病毒 MTT法
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猪传染性胃肠炎病毒、猪流行性腹泻病毒和猪博卡病毒多重PCR检测方法的建立 被引量:19
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作者 焦洋 姜焱 +3 位作者 王凯民 张常印 雷治海 唐泰山 《动物医学进展》 CSCD 北大核心 2013年第8期71-75,共5页
根据GenBank登录的猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)S基因序列、猪流行性腹泻病毒(PEDV)M基因和猪博卡病毒(PBoV)NP1基因序列,设计合成3对引物。通过优化反应条件,对TGEV、PEDV RNA反转录获得的cDNA模板和PBoV的DNA模板进行多重PCR扩增,同时得... 根据GenBank登录的猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)S基因序列、猪流行性腹泻病毒(PEDV)M基因和猪博卡病毒(PBoV)NP1基因序列,设计合成3对引物。通过优化反应条件,对TGEV、PEDV RNA反转录获得的cDNA模板和PBoV的DNA模板进行多重PCR扩增,同时得到3条与试验设计相符的1 060bp(TGEV)、462bp(PEDV)及258bp(PBoV)特异性条带,建立了同时检测TGEV、PEDV和PBoV的多重PCR方法。结果表明,在同一PCR反应体系中,可以同时检测这3种病毒核酸片段,而对其他病毒的检测均为阴性;敏感性分析表明,该方法的最低检测限分别为35、20、10pg的核酸。采用该方法对60份临床样品进行检测,TEGV阳性率为1.6%,PEDV阳性率为6.7%,PBoV阳性率为21.7%,表明建立的方法可以应用于临床检测。 展开更多
关键词 猪传染性胃肠炎病毒 流行性腹泻病毒 博卡病毒 多重PCR 检测
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木犀草素对猪传染性胃肠炎病毒的抑制作用 被引量:12
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作者 龚国清 龚国华 +1 位作者 钱之玉 周曙 《中国药科大学学报》 CAS CSCD 北大核心 2005年第5期453-456,共4页
目的:建立猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)的体外培养方法,观察木犀草素对TGEV的抑制作用.方法:采用细胞培养法,通过结晶紫摄入量测定结合细胞病变作用(CPE),观察木犀草素在不同的加药方式下,对感染TGEV的猪睾丸(ST)细胞的保护作用.结果:TGEV... 目的:建立猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)的体外培养方法,观察木犀草素对TGEV的抑制作用.方法:采用细胞培养法,通过结晶紫摄入量测定结合细胞病变作用(CPE),观察木犀草素在不同的加药方式下,对感染TGEV的猪睾丸(ST)细胞的保护作用.结果:TGEV病毒先吸附ST细胞再加入药液,先与TGEV病毒孵育再接种于ST细胞,或药液先与细胞孵育再用病毒感染等不同方式下,木犀草素在0.84~54.50 μmol/L浓度范围内,均能明显地提高细胞的存活数.另外发现TGEV感染ST细胞后随着给药时间的推迟,木犀草素抑制病毒增殖作用越弱.结论:木犀草素对体外培养系统中TGEV有较好的增殖抑制作用. 展开更多
关键词 木犀草素 猪传染性胃肠炎病毒 细胞病变 体外抗病毒试验
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猪传染性胃肠炎病毒Taq Man荧光定量RT-PCR检测方法的建立 被引量:11
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作者 白兴华 冯力 +4 位作者 陈建飞 时洪艳 孙东波 吴波平 高秀春 《畜牧兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2007年第5期476-481,共6页
根据猪传染性胃肠炎病毒和猪肌动蛋白的基因序列设计合成了引物和探针,通过对荧光定量RT-PCR反应条件的优化,建立了TaqMan荧光定量RT-PCR检测TGEV的方法。同时对37份现地病料进行检测并与常规RT-PCR方法、TGEV抗原快速检测试剂盒比较。... 根据猪传染性胃肠炎病毒和猪肌动蛋白的基因序列设计合成了引物和探针,通过对荧光定量RT-PCR反应条件的优化,建立了TaqMan荧光定量RT-PCR检测TGEV的方法。同时对37份现地病料进行检测并与常规RT-PCR方法、TGEV抗原快速检测试剂盒比较。结果,该方法的检测敏感性达到15.3拷贝/μL,且具有很好的特异性和重复性,而常规RT-PCR方法只能检测到1.53×103拷贝/μL。对37份现地病料的检测结果也表明该法(检出17份)比常规RT-PCR方法(检出12份)和TGEV抗原快速检测试剂盒(免疫层析法,检出10份)的敏感性高。 展开更多
关键词 猪传染性胃肠炎病毒 TAQMAN探针 荧光定量RT-PCR
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猪传染性胃肠炎病毒S蛋白抗原位点分子特征分析 被引量:14
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作者 于天飞 朱红标 +4 位作者 孙天国 张健 蔡雅璐 庞后琴 史小飞 《生物技术通报》 CAS CSCD 北大核心 2010年第3期135-138,共4页
为了进一步研究猪传染性胃肠炎病毒S蛋白抗原位点的分子特征,选取GenBank中22株TGEV分离株,采用生物信息学方法对抗原位点氨基酸序列进行同源性比对分析。结果表明,不同分离株的A和C位点高度保守,B和D位点则有一些变化。
关键词 猪传染性胃肠炎病毒 纤突蛋白 抗原表位分子特征分析
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猪传染性胃肠炎病毒双抗体夹心ELISA检测方法的建立 被引量:9
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作者 屈月 葛俊伟 +4 位作者 唐丽杰 乔薪瑗 姜艳平 尹光昕 李一经 《中国预防兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2013年第5期364-368,共5页
为建立猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)的快速检测方法,本研究以抗TGEV N蛋白单克隆抗体(MAb)为包被抗体,纯化的抗TGEV N蛋白多克隆抗体(PcAb)为检测抗体建立了TGEV双抗体夹心ELISA方法,优化其反应条件为:抗TGEV N蛋白MAb包被浓度为0.4μg/mL,... 为建立猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)的快速检测方法,本研究以抗TGEV N蛋白单克隆抗体(MAb)为包被抗体,纯化的抗TGEV N蛋白多克隆抗体(PcAb)为检测抗体建立了TGEV双抗体夹心ELISA方法,优化其反应条件为:抗TGEV N蛋白MAb包被浓度为0.4μg/mL,抗TGEV N蛋白PcAb和酶标二抗的工作浓度分别为3.5μg/mL和1∶5 000,以P/N>2,同时OD490nm≥0.316作为阳性判定标准。该ELISA的重复性变异系数小于10%,与猪流行性腹泻病毒、猪细小病毒、猪瘟病毒、猪轮状病毒等无交叉反应。对22份临床猪粪便样品RT-PCR的阳性检出率为31.8%;ELISA的阳性检出率为22.7%,二者符合率达81.8%,结果表明本研究建立的双抗体夹心ELISA方法检测TGEV具有较高的特异性和敏感性,可以用于TGEV的病原学检测。 展开更多
关键词 猪传染性胃肠炎病毒 单克隆抗体 高免血清 双抗体夹心ELISA方法
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表达猪传染性胃肠炎病毒S蛋白的重组乳酸菌口服免疫小鼠特异性免疫应答分析 被引量:7
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作者 唐丽杰 魏颖 +4 位作者 葛俊伟 任晓峰 汪淼 徐义刚 李一经 《中国预防兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2007年第7期523-527,共5页
将表达猪传染性胃肠炎病毒S蛋白的重组乳酸乳球菌pNZ8112-Sa/NZ9000经口服免疫BALB/c小鼠,在免疫后的不同时间收集免疫鼠粪便样品,断尾采血收集血液样品并分离血清,用间接ELISA技术检测血清中的IgG抗体及血清和粪便中的IgA抗体的动态产... 将表达猪传染性胃肠炎病毒S蛋白的重组乳酸乳球菌pNZ8112-Sa/NZ9000经口服免疫BALB/c小鼠,在免疫后的不同时间收集免疫鼠粪便样品,断尾采血收集血液样品并分离血清,用间接ELISA技术检测血清中的IgG抗体及血清和粪便中的IgA抗体的动态产生规律;在加强免疫后流式细胞仪检测分析外周血T细胞的变化情况及无菌收集免疫鼠的肠黏液,经中和试验检测其抗体的中和能力。结果表明重组菌株口服免疫小鼠后血清中的IgG和IgA抗体产生能力由于非特异性干扰不能确定,外周血中T细胞百分数在实验组和对照组间变化不显著;粪便中的IgA抗体水平产生效果明显;黏液的抗体具有一定的中和能力,其效价检测结果为1:36。 展开更多
关键词 猪传染性胃肠炎病毒S蛋白 重组乳酸菌 小鼠口服免疫 特异性免疫应答
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猪传染性胃肠炎病毒荧光定量RT-PCR检测方法的建立 被引量:11
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作者 董玲娟 张彦明 +3 位作者 何雷 程敏 刘伟 林鸷 《西北农林科技大学学报(自然科学版)》 CSCD 北大核心 2012年第2期13-19,共7页
【目的】建立一种能检测猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)含量的荧光定量RT-PCR方法,为猪传染性胃肠炎(TGE)的诊断和防治提供技术支持。【方法】根据TGEV TH98株的N基因序列设计1对特异性引物,扩增出目的片段,连接克隆载体后构建质粒标准品;对... 【目的】建立一种能检测猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)含量的荧光定量RT-PCR方法,为猪传染性胃肠炎(TGE)的诊断和防治提供技术支持。【方法】根据TGEV TH98株的N基因序列设计1对特异性引物,扩增出目的片段,连接克隆载体后构建质粒标准品;对荧光定量的循环条件进行优化,建立猪传染性胃肠炎病毒荧光定量RT-PCR检测方法,对其重复性、特异性进行检测,并与普通PCR检测方法进行比较,最后应用该方法对采自陕西杨凌周边的30份临床样品进行检测。【结果】成功构建了质粒标准品,建立了检测猪传染性胃肠炎病毒的荧光定量RT-PCR方法,该方法特异性高、重复性好、敏感性比普通PCR检测方法高2个数量级,对质粒标准品的线性检测范围为1.0×107~1.0×101拷贝/μL。用建立的检测方法对从陕西杨凌周边猪场采集的30份样品进行检测,检出4份阳性,与普通PCR检测方法符合率为100%。【结论】建立的TGEV荧光定量RT-PCR方法敏感性高、特异性好、省时省力,可以对猪传染性胃肠炎病毒进行快速检测。 展开更多
关键词 猪传染性胃肠炎病毒 荧光定量RT-PCR 质粒标准品
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应用RT-nested PCR检测猪传染性胃肠炎病毒 被引量:8
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作者 王玉洁 刘金龙 +2 位作者 彭树英 杨瑞锋 张涌 《西北农林科技大学学报(自然科学版)》 CSCD 北大核心 2005年第2期23-26,共4页
 根据GenBank中已发表的猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)基因序列,利用Primer5.0程序软件,设计并合成了M基因的2对引物,以mRNA为模板,通过RT-PCR,RT-nestedPCR方法,成功扩增出长度为1328bp和1037bp的TGEV目的片段,但未扩增出猪传染性腹泻病毒...  根据GenBank中已发表的猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)基因序列,利用Primer5.0程序软件,设计并合成了M基因的2对引物,以mRNA为模板,通过RT-PCR,RT-nestedPCR方法,成功扩增出长度为1328bp和1037bp的TGEV目的片段,但未扩增出猪传染性腹泻病毒(PEDV)片段。在优化RT-PCR反应条件的基础上,建立了快速检测TGEV的诊断方法。结果表明,RT-nestedPCR方法可用于检测猪传染性胃肠炎病毒,而且此方法简单省时、灵敏性高,可以作为检测RNA病毒的一种分子生物学方法。 展开更多
关键词 猪传染性胃肠炎病毒 RT-PCR RT-nested PCR M基因
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猪流行性腹泻病毒和猪传染性胃肠炎病毒双重RT-PCR鉴别方法的建立 被引量:11
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作者 刘邓 袁秀芳 +3 位作者 徐丽华 牛登元 王朝文 王一成 《动物医学进展》 CSCD 北大核心 2009年第10期1-5,共5页
根据GenBank发表的猪流行性腹泻病毒(PEDV)CV777株和猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)Purdue P115株的基因序列,针对其基因保守区,设计1条共用的下游引物和2条各自病毒的上游引物,可特异扩增出大小分别为213 bp和546 bp目的条带。经过对TaqDNA... 根据GenBank发表的猪流行性腹泻病毒(PEDV)CV777株和猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)Purdue P115株的基因序列,针对其基因保守区,设计1条共用的下游引物和2条各自病毒的上游引物,可特异扩增出大小分别为213 bp和546 bp目的条带。经过对TaqDNA聚合酶和Mg2+浓度、退火温度(Tm)等PCR反应条件的优化,最终确定该双重RT-PCR的最佳条件为TaqDNA聚合酶浓度为0.03 U/μL,Mg2+浓度为0.05 mmol/L,dNTP浓度为200μmol/L,Tm为51℃。特异性和敏感性检测结果显示,所建立的检测方法具有很好的特异性以及较高的敏感性。 展开更多
关键词 流行性腹泻病毒 猪传染性胃肠炎病毒 双重RT—PCR
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猪传染性胃肠炎病毒ORF7蛋白在ST细胞中定位及其对病毒复制影响的研究 被引量:5
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作者 何雷 董玲娟 +6 位作者 张彦明 宋嘉兴 郁川 余祖华 张春杰 丁轲 赵战勤 《中国预防兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2020年第6期543-548,共6页
为研究猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)ORF7蛋白的亚细胞定位及其在TGEV复制中的作用。本研究通过RT-PCR扩增TGEV ORF7基因,将其与真核表达载体pEGFP-C1和pEGFP-N1相连接,构建表达载体pGFP-ORF7(GFP融合在TGEV ORF7的-NH2端)和pORF7-GFP(GFP... 为研究猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)ORF7蛋白的亚细胞定位及其在TGEV复制中的作用。本研究通过RT-PCR扩增TGEV ORF7基因,将其与真核表达载体pEGFP-C1和pEGFP-N1相连接,构建表达载体pGFP-ORF7(GFP融合在TGEV ORF7的-NH2端)和pORF7-GFP(GFP融合在ORF7的-COOH端)。分别将这两个质粒转染至ST细胞,western blot检测融合蛋白GFP-ORF7和ORF7-GFP的表达。通过生物信息学分析和激光共聚焦确定TGEV ORF7蛋白的亚细胞定位。在此基础上,通过细胞病变观察和荧光定量PCR检测TGEV ORF7蛋白对TGEV复制的影响。结果显示,本研究正确构建了真核表达载体pGFP-ORF7和pORF7-GFP,western blot检测结果表明融合蛋白GFP-ORF7和ORF7-GFP均正确表达,TGEV ORF7蛋白大小约为9 ku;结合生物信息学分析和激光共聚焦共定位结果显示TGEV ORF7特异性的定位于ST细胞的内质网中,其定位和其N端的信号肽序列有关;荧光定量PCR检测结果显示,过表达ORF7蛋白后TGEV mRNA转录水平降低99%,表明ORF7蛋白参与调控TGEV的复制。本研究为TGEV ORF7蛋白功能的研究提供了参考依据。 展开更多
关键词 猪传染性胃肠炎病毒 ORF7蛋白 亚细胞定位 过表达 病毒复制
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猪传染性胃肠炎病毒纤突蛋白基因的修饰及原核表达的研究 被引量:8
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作者 钱刚 冯力 +3 位作者 刘胜旺 佟有恩 童光志 黄永芬 《东北农业大学学报》 CAS CSCD 2005年第5期611-614,共4页
猪传染性胃肠炎病毒纤突蛋白是诱导猪产生特异性中和抗体的主要结构蛋白,包括A,B,C,D4个抗原决定位。为进一步生产TGEV植物转基因疫苗提供可操作性强、具免疫活性的外源基因,以猪传染性胃肠炎华毒弱株(TGEVH)的S基因为基础,扩增并连接4... 猪传染性胃肠炎病毒纤突蛋白是诱导猪产生特异性中和抗体的主要结构蛋白,包括A,B,C,D4个抗原决定位。为进一步生产TGEV植物转基因疫苗提供可操作性强、具免疫活性的外源基因,以猪传染性胃肠炎华毒弱株(TGEVH)的S基因为基础,扩增并连接4个抗原决定位相应的碱基序列,构建pPROEX-HTa原核表达载体,转化大肠杆菌诱导表达。结果表明,修饰后的S蛋白的表达量为19.8%,仍能和相应的血清发生抗原抗体反应。 展开更多
关键词 猪传染性胃肠炎病毒 S基因 修饰 原核表达
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紫甘蓝花色苷组成及抗猪传染性胃肠炎病毒活性分析 被引量:6
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作者 雷用东 魏向利 +2 位作者 罗小玲 童军茂 赵晓燕 《食品工业科技》 CAS CSCD 北大核心 2015年第3期95-98,共4页
为在体外探寻紫甘蓝花色苷(Anthocyanins from Purple Cabbage,APC)抗猪传染性胃肠炎病毒(Transmissible gastroenteritis virus of swine,TGEV)的活性效果。本研究以APC粉为原料,采用高效液相色谱仪与质谱仪联机的方法鉴定其花色苷成分... 为在体外探寻紫甘蓝花色苷(Anthocyanins from Purple Cabbage,APC)抗猪传染性胃肠炎病毒(Transmissible gastroenteritis virus of swine,TGEV)的活性效果。本研究以APC粉为原料,采用高效液相色谱仪与质谱仪联机的方法鉴定其花色苷成分后,在体外将APC作用于感染TGEV的猪睾丸细胞系(swine testicle,ST)单层表面,通过研究APC对TGEV诱导ST细胞的形态学变化和细胞存活情况,评价APC是否具有抗TGEV的活性作用。结果表明:紫甘蓝花色苷粉中至少含13种花色苷成分,其中主要为矢车菊色素的糖苷;APC对细胞无毒性的最大安全质量浓度为100μg/m L;APC在安全浓度范围内能够显著抑制TGEV诱导的ST细胞形态变化,降低凋亡。因此,紫甘蓝花色苷具有抗TGEV的生物活性作用。 展开更多
关键词 紫甘蓝花色苷 睾丸细胞系 猪传染性胃肠炎病毒 生物活性
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