猪丁型冠状病毒(PDCoV)与猪流行性腹泻病毒(PEDV)均为致病性冠状病毒,可以引起猪呕吐、腹泻脱水和新生仔猪死亡。为了建立一种快速检测PDCoV和PEDV的双重SYBR Green I荧光定量RT-PCR方法,根据GenBank登录的2种病毒基因的保守序列,设计...猪丁型冠状病毒(PDCoV)与猪流行性腹泻病毒(PEDV)均为致病性冠状病毒,可以引起猪呕吐、腹泻脱水和新生仔猪死亡。为了建立一种快速检测PDCoV和PEDV的双重SYBR Green I荧光定量RT-PCR方法,根据GenBank登录的2种病毒基因的保守序列,设计了两对特异性引物,分别扩增其N、M基因保守区,并将其克隆至pMD19-T载体;将10倍梯度稀释的混合重组质粒作为标准品模板,建立了一种检测PDCoV和PEDV的双重的SYBR Green I荧光定量RT-PCR方法,并对其反应的敏感度、特异性和重复性进行了检测。结果表明,本试验所建立的双重荧光定量RT-PCR检测方法对PDCoV和PEDV的最低检测量分别为51和32拷贝·μL-1,且与PBoV、TGEV、PRV、PCV2无交叉反应,特异性较好;对2016年至2017年在河北省收集的130份仔猪腹泻样本检测,结果显示,PDCoV的检出率为16.9%,PEDV的检出率为66.2%,二者同时感染的检出率为2.3%,与普通RT-PCR检测方法相比,敏感性更高。本研究为PDCoV和PEDV的诊断及分子流行病学调查提供了一种快速、定量检测方法。展开更多
为建立可同时检测猪流行性腹泻病毒(PEDV)和猪丁型冠状病毒(PDCoV)的双重Taq Man qRT-PCR方法,本研究根据Gen Bank中的PEDV M基因及PDCo V N基因设计了两对特异性引物和探针,构建重组质粒作为标准品,绘制标准曲线,建立其检测方法,结果显...为建立可同时检测猪流行性腹泻病毒(PEDV)和猪丁型冠状病毒(PDCoV)的双重Taq Man qRT-PCR方法,本研究根据Gen Bank中的PEDV M基因及PDCo V N基因设计了两对特异性引物和探针,构建重组质粒作为标准品,绘制标准曲线,建立其检测方法,结果显示,根据两种病毒质粒标准品构建的标准曲线的相关系数(R2)均为1,线性关系良好。该方法特异性强,与猪圆环病毒2型(PCV2)、猪圆环病毒3型(PCV3)、伪狂犬病毒(PRV)、猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)、传染性胃肠炎病毒(TGEV)、猪博卡病毒(PBo V)及猪瘟病毒(CSFV)均无交叉反应;敏感性试验结果显示,建立的单一与双重荧光定量PCR对PEDV及PDCo V的质粒标准品检测下限均分别为4.7×10^(1)拷贝/μL和3.17×10^(1)拷贝/μL,敏感性高;对该检测方法的重复性进行验证,结果显示,该方法组内和组间的变异系数均小于3%,重复性好。利用建立的该双重Taq Man q RT-PCR检测方法分别对118份猪粪便样品进行检测,结果显示,PEDV阳性检出率为56.8%(67/118),PDCo V阳性检出率为33.1%(39/118),二者共感染率为16.1%(19/118)。本研究首次以PEDV M基因及PDCo V N基因为靶基因,建立了同时检测PEDV和PDCo V的双重Taq Man q RT-PCR,该方法具有快速、灵敏、准确、重复性高等优点,可用于这两种病毒的同时检测和快速排查。展开更多
文摘【目的】探讨猪δ冠状病毒(Porcine deltacoronavirus,PDCoV)对断奶仔猪肠道细胞外基质(extracellular matrix,ECM)及其动态调控因子的影响,以缓解猪病原体感染和改善仔猪肠道健康。【方法】试验选取16头健康的8日龄仔猪(杜×长×大),随机分为2组:对照组和PDCoV组,每组8头。对照组口腔灌服20 mL DMEM,PDCoV组口腔灌服20 mL PDCoV细胞培养液(10~8 TCID50/mL),间隔8 h再灌服1次。攻毒后第3天屠宰所有仔猪,采集中段空肠和远端回肠样品,进行肠道胶原蛋白(collagen)、纤维黏连蛋白1(fibronectin,FN1)、整合素(integrin,ITG)及其相关调控因子等ECM相关指标的检测。【结果】与对照组相比,PDCoV组仔猪空肠白细胞介素-1β(IL-1β)、IL-6、IL-8基因mRNA表达量均显著增加(P<0.05)。Masson染色显示,PDCoV攻毒增加了空肠胶原蛋白的沉积。与对照组相比,PDCoV组仔猪空肠FN1、回肠ITGA1基因mRNA表达量显著降低(P<0.05)。在空肠中,PDCoV组仔猪的ECM调控因子基质金属蛋白酶-2(MMP2)、MMP9、纤溶酶原激活物(PAs)、运输和高尔基体组织2(TANGO2)基因mRNA表达量均显著低于对照组(P<0.05),内质网通道蛋白(SEC6A1)、磷酸二酯酶4δ(PDE4D)基因mRNA表达量均显著高于对照组(P<0.05);与对照组相比,PDCoV组仔猪回肠中MMP2、PAs、SEC6A1基因mRNA表达量显著降低(P<0.05),MMP9基因mRNA表达量显著增加(P<0.05)。通过Spearman相关性分析可知,调控因子MMP2、TANGO2、PAs与促炎症因子IL-1β、IL-8基因mRNA表达量呈显著负相关(P<0.05),与转化生长因子-β(TGF-β)基因mRNA表达量呈显著正相关(P<0.05);SEC6A1、PDE4D与IL-1β、IL-6、IL-8基因mRNA表达量呈显著正相关(P<0.05),PDE4D与TGF-β基因mRNA表达量呈显著负相关(P<0.05)。【结论】灌服PDCoV会降低仔猪肠道中纤维黏连蛋白和整合素的表达,并通过调节ECM调控因子的表达量,引起断奶仔猪肠道中胶原蛋白沉积,影响肠道中ECM的动态变化,破坏肠道稳态健康。
文摘猪丁型冠状病毒(PDCoV)与猪流行性腹泻病毒(PEDV)均为致病性冠状病毒,可以引起猪呕吐、腹泻脱水和新生仔猪死亡。为了建立一种快速检测PDCoV和PEDV的双重SYBR Green I荧光定量RT-PCR方法,根据GenBank登录的2种病毒基因的保守序列,设计了两对特异性引物,分别扩增其N、M基因保守区,并将其克隆至pMD19-T载体;将10倍梯度稀释的混合重组质粒作为标准品模板,建立了一种检测PDCoV和PEDV的双重的SYBR Green I荧光定量RT-PCR方法,并对其反应的敏感度、特异性和重复性进行了检测。结果表明,本试验所建立的双重荧光定量RT-PCR检测方法对PDCoV和PEDV的最低检测量分别为51和32拷贝·μL-1,且与PBoV、TGEV、PRV、PCV2无交叉反应,特异性较好;对2016年至2017年在河北省收集的130份仔猪腹泻样本检测,结果显示,PDCoV的检出率为16.9%,PEDV的检出率为66.2%,二者同时感染的检出率为2.3%,与普通RT-PCR检测方法相比,敏感性更高。本研究为PDCoV和PEDV的诊断及分子流行病学调查提供了一种快速、定量检测方法。
文摘为建立可同时检测猪流行性腹泻病毒(PEDV)和猪丁型冠状病毒(PDCoV)的双重Taq Man qRT-PCR方法,本研究根据Gen Bank中的PEDV M基因及PDCo V N基因设计了两对特异性引物和探针,构建重组质粒作为标准品,绘制标准曲线,建立其检测方法,结果显示,根据两种病毒质粒标准品构建的标准曲线的相关系数(R2)均为1,线性关系良好。该方法特异性强,与猪圆环病毒2型(PCV2)、猪圆环病毒3型(PCV3)、伪狂犬病毒(PRV)、猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)、传染性胃肠炎病毒(TGEV)、猪博卡病毒(PBo V)及猪瘟病毒(CSFV)均无交叉反应;敏感性试验结果显示,建立的单一与双重荧光定量PCR对PEDV及PDCo V的质粒标准品检测下限均分别为4.7×10^(1)拷贝/μL和3.17×10^(1)拷贝/μL,敏感性高;对该检测方法的重复性进行验证,结果显示,该方法组内和组间的变异系数均小于3%,重复性好。利用建立的该双重Taq Man q RT-PCR检测方法分别对118份猪粪便样品进行检测,结果显示,PEDV阳性检出率为56.8%(67/118),PDCo V阳性检出率为33.1%(39/118),二者共感染率为16.1%(19/118)。本研究首次以PEDV M基因及PDCo V N基因为靶基因,建立了同时检测PEDV和PDCo V的双重Taq Man q RT-PCR,该方法具有快速、灵敏、准确、重复性高等优点,可用于这两种病毒的同时检测和快速排查。
