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猪Ⅱ型圆环病毒ORF2与猪GM-CSF基因重组腺病毒共表达及免疫效果分析
1
作者 陈降华 刘忠华 李文平 《生物技术通报》 CAS CSCD 北大核心 2009年第12期124-128,共5页
旨在构建含融合基因pGMCSF-ORF2的重组腺病毒,并对其表达水平和免疫效果进行分析。运用PCR方法扩增PCV2ORF2和pGM-CSF基因,拼接后克隆入pMD18-T载体,然后再亚克隆入腺病毒穿梭质粒pShuttle-CMV中,阳性穿梭质粒经PmeⅠ酶线性化后电转化... 旨在构建含融合基因pGMCSF-ORF2的重组腺病毒,并对其表达水平和免疫效果进行分析。运用PCR方法扩增PCV2ORF2和pGM-CSF基因,拼接后克隆入pMD18-T载体,然后再亚克隆入腺病毒穿梭质粒pShuttle-CMV中,阳性穿梭质粒经PmeⅠ酶线性化后电转化含腺病毒基因组(AdEasy-1)的大肠杆菌细胞BJ5183-Ad-1,成功获得了重组腺病毒DNA。将纯化后的重组腺病毒DNA转染AD293细胞,经过病毒基因组的PCR和转录水平的RT-PCR及Westernblot等方面对融合蛋白的表达进行了鉴定。以该病毒免疫Babl/c小白鼠,对免疫小鼠血清中PCV2抗体进行检测。结果显示,获得了pGMCSF-ORF2重组基因,重组腺病毒载体构建成功,获得了表达pGMCSF-ORF2融合蛋白的重组腺病毒。该病毒免疫小鼠后,在小鼠血清中检测到了PCV2的特异性抗体。获得的重组腺病毒能有效表达pGMCSF-ORF2融合蛋白,且可诱导小鼠产生针对PCV2的特异性抗体。 展开更多
关键词 猪ⅱ型圆环病毒orf2 pGM—CSF 重组腺病毒共表达免疫效果
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猪Ⅱ型圆环病毒ORF2基因的克隆及其序列分析 被引量：1
2
作者 蒋智勇 宋长绪 +2 位作者 王贵平 高向阳 赵亚华 《动物医学进展》 CSCD 2005年第3期63-66,共4页
根据GenBank中猪圆环病毒Ⅱ型(PCV-2)ORF2基因序列,设计一对引物,应用PCR从疑似断奶仔猪多系统消耗综合征(PMWS)的死亡仔猪组织病料中扩增出ORF2基因(702 bp).将此基因片段克隆入pMD 18-T载体,筛选获得重组质粒pMD-ORF2并对其测序,结果... 根据GenBank中猪圆环病毒Ⅱ型(PCV-2)ORF2基因序列,设计一对引物,应用PCR从疑似断奶仔猪多系统消耗综合征(PMWS)的死亡仔猪组织病料中扩增出ORF2基因(702 bp).将此基因片段克隆入pMD 18-T载体,筛选获得重组质粒pMD-ORF2并对其测序,结果表明所克隆的ORF2基因与德国分离株AF201897核苷酸序列同源性为99.5%.与其它PCV-2的ORF2核苷酸序列同源性在92.1%～99.9%之间,推导的氨基酸序列同源性在90.2%～99.5%之间. 展开更多
关键词 orf2 猪ⅱ型圆环病毒 同源性 PCV 病料 多系统消耗综合征 猪圆环病毒 基因 克隆 核苷酸序列
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猪Ⅱ型圆环病毒ORF1、ORF2基因串联重组腺病毒的构建及其免疫效果 被引量：2
3
作者 祝卫国 王旭荣 +4 位作者 宋长绪 杨增岐 王建华 张春红 黄忠 《西北农林科技大学学报（自然科学版）》 CSCD 北大核心 2008年第3期75-79,84,共6页
【目的】构建含PCV2ORF1和ORF2基因的串联重组腺病毒,并对其免疫效果进行评价。【方法】扩增PCV2的ORF1和ORF2基因,串联克隆入pMD18-T载体后亚克隆入腺病毒穿梭质粒pAdTrack-CMV中,阳性穿梭质粒经PmeⅠ酶线性化后与骨架载体pAdeasy-1在... 【目的】构建含PCV2ORF1和ORF2基因的串联重组腺病毒,并对其免疫效果进行评价。【方法】扩增PCV2的ORF1和ORF2基因,串联克隆入pMD18-T载体后亚克隆入腺病毒穿梭质粒pAdTrack-CMV中,阳性穿梭质粒经PmeⅠ酶线性化后与骨架载体pAdeasy-1在细菌BJ5183内完成重组,获得重组腺病毒质粒。将重组腺病毒质粒用PacⅠ酶线性化后转染293细胞,包装成重组腺病毒,然后从致细胞病变、荧光检测及PCR检测等方面对该重组腺病毒进行了鉴定。以该重组腺病毒免疫小鼠,对免疫鼠血清中PCV2的特异性抗体进行检测。【结果】得到了PCV2的ORF1和ORF2基因,pMD18-ORF1-ORF2和pAdCMV-ORF1-ORF2载体构建成功,获得了含有PCV2ORF1和ORF2基因的重组腺病毒。该重组腺病毒免疫小鼠后,在小鼠血清中可检测到PCV2的特异性抗体。【结论】成功构建了含PCV2ORF1和ORF2基因的重组腺病毒,此腺病毒可诱导机体产生针对PCV2的特异性抗体。 展开更多
关键词 猪ⅱ型圆环病毒 orf1 orf2基因 重组腺病毒 免疫效果
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近年湖南省猪圆环病毒2型感染状况的调查及遗传演化分析
4
作者 范杰 邰易润 +7 位作者 朱艳丽 陈志雄 胡巧云 陈智 刘甜甜 李欣 范仲鑫 葛猛 《畜牧兽医学报》 北大核心 2025年第3期1376-1385,共10页
本研究旨在掌握近期湖南省各地区猪圆环病毒2型(PCV2)最新的感染和遗传演化情况。本研究运用qPCR方法对2021-2023年采集自湖南省长沙市、岳阳市、怀化市、常德市、株洲市等14个地级市的1244份肥猪的淋巴结、拭子、脑组织及血样通过qPCR... 本研究旨在掌握近期湖南省各地区猪圆环病毒2型(PCV2)最新的感染和遗传演化情况。本研究运用qPCR方法对2021-2023年采集自湖南省长沙市、岳阳市、怀化市、常德市、株洲市等14个地级市的1244份肥猪的淋巴结、拭子、脑组织及血样通过qPCR进行了病毒核酸检测,筛选出PCV2阳性样品,再通过PCR扩增及测序对PCV2的ORF2基因序列进行分析。结果显示,1244份样品中有778份为PCV2阳性,总阳性率达62.54%,其中邵阳市的PCV2阳性率最高,达92.55%(87/94),郴州市最低,为18.28%(17/93);57株PCV2 ORF2基因测序结果表明,PCV2a、PCV2b和PCV2d占比分别为12.28%、7.02%和80.70%;测序毒株间的ORF2基因核苷酸、氨基酸序列相似性分别为88.5%~100.0%和86.3%~100.0%,存在45个氨基酸差异位点,PCV2d间存在15个差异氨基酸位点,选择压力分析表明,PCV2存在3个阳性选择位点。研究表明:目前,PCV2的突变速率较快,各毒株之间存在较多的氨基酸位点差异,与既往报道相同,本研究中PCV2d已成为绝对优势的流行毒株,PCV2的这些变异可能使现有疫苗保护效果减弱,应予以重视。 展开更多
关键词 猪圆环病毒2型 分子流行病学调查 遗传变异 orf2基因 选择压力
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密码子优化和信号肽对猪圆环病毒ORF2基因在毕赤酵母表达中的影响
5
作者 张春玲 王瑞阳 +5 位作者 钱忠辉 赵本进 张俊平 葛宇燕 张子悦 丁卫星 《上海农业学报》 2024年第4期81-85,共5页
为了在毕赤酵母中高效表达PCV2ORF2基因,对PCV2ORF2基因编码的187个氨基酸密码子进行毕赤酵母偏爱性优化,利用两步PCR全化学合成优化后的ORF2基因。将优化前后的PCV2ORF2基因片段插入毕赤酵母表达载体pPICZα-C,构建重组质粒pPICZα-C-O... 为了在毕赤酵母中高效表达PCV2ORF2基因,对PCV2ORF2基因编码的187个氨基酸密码子进行毕赤酵母偏爱性优化,利用两步PCR全化学合成优化后的ORF2基因。将优化前后的PCV2ORF2基因片段插入毕赤酵母表达载体pPICZα-C,构建重组质粒pPICZα-C-ORF2和p PICZα-C-ORF2op。将线性化的重组质粒电转化毕赤酵母GS115,并筛选Zeocin抗性重组子。同时,也研究了信号肽对PCV2ORF2表达效率的影响。SDS-PAGE和Western-blot分析结果表明,只有经密码子优化且去除ORF2基因自身信号肽的重组子能够分泌表达PCV2 ORF2蛋白,目的蛋白分子质量约为30 ku,表达的重组ORF2蛋白可被PCV2阳性血清识别,具有生物学活性。 展开更多
关键词 猪圆环病毒orf2基因 密码子优化 稀有密码子 自身信号肽 毕赤酵母
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猪Ⅱ型圆环病毒河南株分离鉴定及其ORF2基因序列分析
6
作者 王江辉 陈陆 +7 位作者 吴青 刘红英 杨霞 彭志峰 孙彦婷 邝爱丽 王宏魁 王川庆 《中国兽医杂志》 CAS 北大核心 2008年第5期24-26,共3页
关键词 猪ⅱ型圆环病毒 orf2基因 基因序列分析 河南地区 分离鉴定 断奶猪多系统衰竭综合征 猪皮炎肾病综合征 PCV2
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猪II型圆环病毒全基因组序列分析及其ORF1和ORF2基因的克隆与表达 被引量：16
7
作者 韩凌霞 陈艳 +3 位作者 崔尚金 王云峰 仇华吉 童光志 《中国预防兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2004年第1期10-13,共4页
猪II型圆环病毒(PCV＿2)的2个主要开放阅读框ORF1和ORF2分别编码病毒的复制酶Rep和结构蛋白Cap。本试验将分离株L株病毒感染PK15细胞系,提取总DNA并以其为模板,通过PCR分别扩增了全病毒基因组、完整的Rep和Cap基因,并克隆到pMD18T载体中... 猪II型圆环病毒(PCV＿2)的2个主要开放阅读框ORF1和ORF2分别编码病毒的复制酶Rep和结构蛋白Cap。本试验将分离株L株病毒感染PK15细胞系,提取总DNA并以其为模板,通过PCR分别扩增了全病毒基因组、完整的Rep和Cap基因,并克隆到pMD18T载体中,进行了序列测定。将Rep和Cap基因亚克隆到大肠杆菌表达载体pPROEXTMHT中,以融合蛋白的形式表达了这两种蛋白。根据文献报道,致病性的PCV＿2与无致病性的PCV1的型特异性抗原决定簇主要位于Cap基因的羧基端部分,本实验利用原核表达载体pGEX＿6p＿1融合表达了Cap基因羧基端423bp的片段。通过薄层扫描各重组菌诱导表达产物的SDS＿PAGE结果,重组质粒pPRO＿Cap和pPRO＿Rep以及pGEX＿ΔCap的外源基因表达量分别占总菌体总蛋白的15.1%、30.4%和19.6%。将表达的三种蛋白作为抗原,通过酶联免疫吸附试验分别与PCV＿2阳性猪血清和SPF猪血清进行了反应,pGEX＿ΔCap表达的蛋白(Cap蛋白的羧基端部分)抗原反应性最强,这表明截短的Cap蛋白羧基端部分将是一个良好的诊断PCV＿2感染用候选抗原。 展开更多
关键词 PCV-2 诊断抗原 猪II型圆环病毒 全基因组序列分析 orfl基因 orf2基因 基因克隆 基因表达
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猪Ⅱ型圆环病毒-伪狂犬重组病毒活疫苗SA215(C)株的构建(初报) 被引量：2
8
作者 王印 郭万柱 +3 位作者 王新 徐志文 朱玲 王小玉 《四川农业大学学报》 CSCD 2006年第2期125-129,共5页
根据GenBank发表的PCV2序列设计一对特异性引物,采用PCR方法,扩增PCV2 ORF2基因,将ORF2基因插入到含有EGFP报告基因的转移载体质粒pPI-2.EGFP,获得重组中间转移质粒pPI-2.EGFP-ORF2。采用脂质体介导法,将重组中间转移载体pPI-2.EGFP-ORF... 根据GenBank发表的PCV2序列设计一对特异性引物,采用PCR方法,扩增PCV2 ORF2基因,将ORF2基因插入到含有EGFP报告基因的转移载体质粒pPI-2.EGFP,获得重组中间转移质粒pPI-2.EGFP-ORF2。采用脂质体介导法,将重组中间转移载体pPI-2.EGFP-ORF2与伪狂犬病毒SA215株基因组共转染真核ST细胞,通过空斑纯化得到了表达猪Ⅱ型圆环病毒ORF2基因和绿色荧光蛋白基因的重组伪狂犬病毒SA215(C)。经检测,重组病毒能表达具有生物活性的ORF2基因蛋白和绿色荧光蛋白。并且重组病毒及亲本株在同一细胞上的增殖滴度基本相同,表明EGFP和PCV2 ORF2基因的插入不影响PRV SA215的增殖。该重组病毒可作为猪Ⅱ型圆环病毒和伪狂犬病毒候选疫苗毒株。 展开更多
关键词 猪ⅱ型圆环病毒 orf2基因 伪狂犬病毒 重组病毒
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猪圆环病毒Ⅱ型感染3D4/2细胞的转录组学分析
9
作者 陈虹伶 赵怡 +5 位作者 陈家骥 韦秋旭 李禧梦 冯国越 胡焜翔 胡庭俊 《中国畜牧兽医》 CSCD 北大核心 2024年第1期42-51,共10页
【目的】通过转录组测序筛选猪圆环病毒Ⅱ型(Porcine circovirus typeⅡ,PCV2)感染猪肺泡巨噬细胞系(3D4/2)差异表达基因,为了解PCV2感染宿主免疫细胞机制和抗PCV2感染药物研发奠定基础。【方法】用感染复数(multiplicity of infection,... 【目的】通过转录组测序筛选猪圆环病毒Ⅱ型(Porcine circovirus typeⅡ,PCV2)感染猪肺泡巨噬细胞系(3D4/2)差异表达基因,为了解PCV2感染宿主免疫细胞机制和抗PCV2感染药物研发奠定基础。【方法】用感染复数(multiplicity of infection, MOI)为1的PCV2 NJ2002株处理3D4/2细胞,利用Illumina NovaSeq 6000测序平台进行转录组测序。使用DeSeq 2.0软件进行差异表达基因分析,并对差异表达基因进行基因本体论(GO)、京都基因与基因组百科全书(KEGG)功能分析及转录因子靶向分析,选取免疫及凋亡相关基因进行实时荧光定量PCR验证,用Western blotting技术检测细胞内磷脂酰肌醇激酶(PI3K)及磷酸化胞内磷脂酰肌醇激酶(p-PI3K)、蛋白激酶B(Akt)和磷酸化蛋白激酶B(p-Akt)蛋白表达水平。【结果】转录组测序结果显示,与对照组相比,PCV2感染组共获得713个差异表达基因,其中313个上调,400个下调。GO功能和KEGG通路富集分析显示,差异表达基因与免疫应答等相关,主要富集在细胞外基质受体互作通路、新陈代谢通路、HIF-1信号通路、病毒致癌作用、PI3K-Akt等信号通路。实时荧光定量PCR结果与转录组测序的基因表达水平保持一致。Western blotting检测结果显示,PCV2感染3D4/2细胞24 h后PI3K和Akt蛋白磷酸化水平显著升高(P<0.05)。转录因子靶向分析表明,差异表达基因与核转录因子Y亚基β(NFYB)和ETS转录因子(ELK4)联系紧密。【结论】PCV2可能通过PI3K-Akt信号通路影响下游炎症信号通路和凋亡信号通路增强自身复制能力。NFYB和ELK4转录因子在PCV2感染过程中可能发挥重要作用,可考虑作为抗PCV2药物靶点。研究结果为深入了解PCV2感染宿主免疫细胞机制和相关药物开发提供了理论基础。 展开更多
关键词 猪圆环病毒ⅱ型 3D4/2细胞 转录组测序 差异表达基因 转录因子
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猪Ⅱ型圆环病毒ORF1基因的克隆及其在大肠杆菌中的表达 被引量：1
10
作者 蒋智勇 宋长绪 +2 位作者 王贵平 高向阳 赵亚华 《动物医学进展》 CSCD 2004年第5期59-62,共4页
根据GenBank中猪圆环病毒Ⅱ型(PCV2)0RF1基因序列,设计合成了一对引物,对PCV2广东株(GD)ORF1基因进行PCR扩增,将扩增出的ORF1基因(942 bp)克隆入pMD18-T载体,筛选获得重组质粒,命名为pMD-ORF1。将ORF1的KpnⅠ和XbaⅠ双酶切产物插入原核... 根据GenBank中猪圆环病毒Ⅱ型(PCV2)0RF1基因序列,设计合成了一对引物,对PCV2广东株(GD)ORF1基因进行PCR扩增,将扩增出的ORF1基因(942 bp)克隆入pMD18-T载体,筛选获得重组质粒,命名为pMD-ORF1。将ORF1的KpnⅠ和XbaⅠ双酶切产物插入原核表达载体pBAD／gⅢC,得到重组子,命名为pBAD／gⅢ-ORF1。测序分析表明克隆的ORF1与德国分离株AF201897核苷酸序列同源性高达99.5％。与其它PCV2核苷酸序列同源性为92.1％-99.9％,推导的氨基酸序列同源性为90.2％-99.5％。同时,测序结果表明所克隆的ORF1准确插入pBAD／gⅢC的多克隆位点,未改变读码框架。用L-Arabi-nose进行诱导表达,收集茵液进行SDS-PAGE和Western blotting分析,显示PCV2 ORF1在pBAD／gⅢC中获得了高效融合表达,其表达蛋白分子量约为4.1万。 展开更多
关键词 猪ⅱ型圆环病毒 orf1基因 基因克隆 大肠杆菌 基因表达
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猪圆环病毒Ⅱ型ORF2重组蛋白抗体诊断试剂IgG的研制 被引量：1
11
作者 陆英杰 林涛 +3 位作者 欧阳峰 谭铁兵 马春全 邓桦 《西北农业学报》 CAS CSCD 北大核心 2009年第5期64-66,共3页
应用猪圆环病毒Ⅱ型(Porcine circovirus 2,PCV2)ORF2重组蛋白,研制诊断PCV2的抗体试剂。利用原核表达系统表达PCV2 ORF2蛋白,经12%浓度的SDS-PAGE凝胶电泳分析后免疫家兔制备抗PCV2ORF2重组蛋白抗体,并用间接酶联免疫吸附试验(indirect... 应用猪圆环病毒Ⅱ型(Porcine circovirus 2,PCV2)ORF2重组蛋白,研制诊断PCV2的抗体试剂。利用原核表达系统表达PCV2 ORF2蛋白,经12%浓度的SDS-PAGE凝胶电泳分析后免疫家兔制备抗PCV2ORF2重组蛋白抗体,并用间接酶联免疫吸附试验(indirect-ELISA)确定其效价,然后以Western blotting法分析该抗体特异性。结果表明:PCV2 ORF2重组蛋白被表达,且在免疫家兔后获得效价高、特异性好的抗体。兔抗PCV2-ORF2重组蛋白抗体以其特异性好的特点可以作为免疫诊断试剂。 展开更多
关键词 猪圆环病毒ⅱ型 orf2 抗体诊断试剂IgG
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猪2型圆环病毒ORF2基因的克隆及原核表达 被引量：1
12
作者 栾爽艳 张志 +3 位作者 张燕霞 单虎 黄保续 李晓成 《中国动物检疫》 CAS 北大核心 2007年第6期24-25,共2页
采用PCR方法从已构建好的猪圆环病毒2型(PCV2)全基因重组质粒(pMD18-T-PCV2)中扩增出大小为579bp的ORF2基因,克隆到表达载体pET-32a,经IPTG诱导,成功表达了ORF2基因编码的结构蛋白。表达的重组蛋白为融合蛋白,分子量40Ku,表达量20%左右... 采用PCR方法从已构建好的猪圆环病毒2型(PCV2)全基因重组质粒(pMD18-T-PCV2)中扩增出大小为579bp的ORF2基因,克隆到表达载体pET-32a,经IPTG诱导,成功表达了ORF2基因编码的结构蛋白。表达的重组蛋白为融合蛋白,分子量40Ku,表达量20%左右。经Western-blot检测,重组蛋白可被PCV2阳性血清识别。 展开更多
关键词 猪圆环病毒2型 orf2基因 表达
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猪圆环病毒Ⅱ型ZZ株ORF2基因的扩增、测序与序列分析
13
作者 王岩 王新卫 +2 位作者 侯春彬 张春霞 李文刚 《安徽农业科学》 CAS 北大核心 2007年第27期8444-8446,共3页
扩增PCV-2 ZZ毒株ORF2基因,并进行序列分析和同源比较。根据GenBank中PCV-2毒株基因序列设计1对特异性引物,对郑州分离株（ZZ）猪圆环病毒PCV-2型的ORF2基因进行了扩增。测序后,将所测序列与已公布的PCV-2 ORF2序列进行同源性比较,并绘... 扩增PCV-2 ZZ毒株ORF2基因,并进行序列分析和同源比较。根据GenBank中PCV-2毒株基因序列设计1对特异性引物,对郑州分离株（ZZ）猪圆环病毒PCV-2型的ORF2基因进行了扩增。测序后,将所测序列与已公布的PCV-2 ORF2序列进行同源性比较,并绘制系统发育进化树。通过扩增可获得702 bp的PCV-2 ORF2全基因,编码234个氨基酸,分子量27 995.93 D。所有毒株间的ORF2基因核苷酸同源性与氨基酸同源性均为89.2%-100%;ZZ株与HZ0201分离株的ORF2基因的核苷酸序列同源性较近（98.3%）,而与hk102同源性较远（92.0%）。进化树分析表明,各分离毒株在进化上地理位置的相关性不明显。该研究对圆环病毒的流行病学和疫苗研究及其抗原的变异都具有重要参考价值。 展开更多
关键词 猪ⅱ型圆环病毒 orf2基因 序列分析
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猪圆环病毒Ⅱ型贵州分离株ORF2基因表达的试验
14
作者 韦冠东 甘振磊 +6 位作者 马萍 汤德元 王洪光 唐宇 张元鑫 曾智勇 李达 《中国兽医杂志》 CAS 北大核心 2015年第9期43-46,共4页
通过采集疑似猪圆环病毒感染的病料,分离到1株猪圆环病毒2型贵州株,并对其进行了鉴定。原核表达试验结果表明,PCV-2贵州株的ORF2基因可在大肠杆菌BL21(DE3)中表达,表达的目的蛋白约为40.0 k Da,且复性蛋白具有一定免疫原性。将真核表达... 通过采集疑似猪圆环病毒感染的病料,分离到1株猪圆环病毒2型贵州株,并对其进行了鉴定。原核表达试验结果表明,PCV-2贵州株的ORF2基因可在大肠杆菌BL21(DE3)中表达,表达的目的蛋白约为40.0 k Da,且复性蛋白具有一定免疫原性。将真核表达质粒分别转染PK-15细胞,以掌握ORF2基因和白细胞介素-2(IL-2)基因体外表达情况;将重组质粒、空载体及生理盐水分别免疫BALB/c小鼠,以监测血清中特异性抗体及T淋巴细胞亚群含量,从而探讨猪圆环病毒Ⅱ型贵州分离株ORF2基因真核表达效果及长白猪细胞因子IL-2对PCV2 ORF2免疫原性的影响,结果表明,pc DNA3.1-ORF2和pc DNA3.1-ORF2-IL-2在PK-15细胞中获得了较高的表达,IL-2可明显增强PCV-2 DNA免疫效果。 展开更多
关键词 猪圆环病毒2型 orf2基因 IL-2 表达 重组质粒
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猪2型圆环病毒ORF2基因片段的克隆与序列分析
15
作者 曹三杰 肖驰 +1 位作者 文心田 马晓平 《四川农业大学学报》 CSCD 2006年第4期435-438,共4页
利用ArrayDesigner2.0软件设计PCV2引物直接从PDNS病料肺组织中PCR扩增获得PCVCQB7基因片段,用pMD18-T载体连接、克隆获得PCVCQB7重组质粒。序列测定和与标准毒株对位比对分析PCVCQB7核苷酸序列全长624bp,系PCV2ORF2基因片段,与PCV2分... 利用ArrayDesigner2.0软件设计PCV2引物直接从PDNS病料肺组织中PCR扩增获得PCVCQB7基因片段,用pMD18-T载体连接、克隆获得PCVCQB7重组质粒。序列测定和与标准毒株对位比对分析PCVCQB7核苷酸序列全长624bp,系PCV2ORF2基因片段,与PCV2分离株的核苷酸序列相似性在80%以上,与PCV1在66%以下,采用最大似然法构建的系统发生树分析发现PCVCQB7位于PCV2主枝上,并与国内和欧洲分离株Imp.1147、304、375、QD、GD-TS、SH、24657_NL毒株亲缘关系较近形成一小分枝,表明PCVCQB7为引起PDNS的PCV2扩增产物。 展开更多
关键词 猪2型圆环病毒 基因克隆 序列分析
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猪圆环病毒Ⅱ型ORF2基因在酵母中的表达 被引量：3
16
作者 刘娜 吴锋 +3 位作者 徐义兵 王强 郭春和 黄毓茂 《中国畜牧兽医》 CAS 北大核心 2011年第9期80-83,共4页
为探索猪圆环病毒Ⅱ型(PCVⅡ)ORF2基因的高效表达,将ORF2基因整合到酵母表达载体pPICZαC中,构建重组质粒pPICZαC-ORF2,通过SacⅠ酶切线性化,经电穿孔法转到毕赤酵母菌SMD1168。经ZeocinTM抗性筛选得到转化子,通过SDS-PAGE分析和Wester... 为探索猪圆环病毒Ⅱ型(PCVⅡ)ORF2基因的高效表达,将ORF2基因整合到酵母表达载体pPICZαC中,构建重组质粒pPICZαC-ORF2,通过SacⅠ酶切线性化,经电穿孔法转到毕赤酵母菌SMD1168。经ZeocinTM抗性筛选得到转化子,通过SDS-PAGE分析和Western blotting鉴定,结果表明衣壳蛋白在酵母菌中成功分泌表达。 展开更多
关键词 猪圆环病毒 巴斯德毕赤酵母 orf2 分泌表达
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猪2型圆环病毒辽宁分离株ORF2基因真核表达载体的构建及鉴定
17
作者 关淼 《吉林畜牧兽医》 2013年第4期16-18,共3页
PCV2基因片段ORF2编码病毒衣壳蛋白,是主要的免疫原蛋白,并且基因序列比较保守,是构建核酸疫苗的首选基因片段。本试验构建真核表达载体pIRES-ORF2,并转染Hela细胞,进行了间接免疫荧光试验。结果表明,在荧光显微镜下可以看到转有pIRES-O... PCV2基因片段ORF2编码病毒衣壳蛋白,是主要的免疫原蛋白,并且基因序列比较保守,是构建核酸疫苗的首选基因片段。本试验构建真核表达载体pIRES-ORF2,并转染Hela细胞,进行了间接免疫荧光试验。结果表明,在荧光显微镜下可以看到转有pIRES-ORF2质粒的细胞玻片上有明显的黄绿色荧光。 展开更多
关键词 猪2型圆环病毒 辽宁分离株 orf2 真核表达载体
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猪2型圆环病毒核酸疫苗免疫效应研究 被引量：13
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作者 宋云峰 肖少波 +2 位作者 金梅林 张松林 陈焕春 《畜牧兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2005年第10期1049-1054,共6页
PCR扩增PCV2 ORF2和BVP22基因。将ORF2基因克隆入真核表达载体pCDNA3.1(+),构建了pCORF2作为核酸疫苗免疫小白鼠。同时将具有蛋白转导功能的BVP22基因分别克隆到ORF2基因的上游和下游,使二者融合表达,命名为pCORF2BVP22和pCBVP22ORF2。... PCR扩增PCV2 ORF2和BVP22基因。将ORF2基因克隆入真核表达载体pCDNA3.1(+),构建了pCORF2作为核酸疫苗免疫小白鼠。同时将具有蛋白转导功能的BVP22基因分别克隆到ORF2基因的上游和下游,使二者融合表达,命名为pCORF2BVP22和pCBVP22ORF2。分4组肌肉免疫BALB/c小白鼠,分别注射pCD-NA3.1(+)、pCORF2、pCORF2BVP22和pCBVP22ORF2,共免疫2次,间隔2周,分别于首免后2周和二免后4周采血,ELISA法检测体液抗体。同时为在体外验证ORF2和BVP22基因的真核表达,将ORF2和BVP22基因分别克隆入pEGFP-N1载体,构建了pNORF2和pNBVP22,转染Hela细胞后在荧光显微镜下观察到了ORF2和BVP22在体外的瞬时高效表达。结果显示,通过两次免疫后,各疫苗组均产生了针对ORF2的体液抗体,同时证明BVP22可增强核酸疫苗的免疫效果,其中以BVP22在ORF2上游效果更好。本研究为防制猪2型圆环病毒感染提供了较为理想的侯选疫苗。 展开更多
关键词 猪2型圆环病毒orf2 BVP22 蛋白转导 核酸疫苗
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猪圆环病毒Ⅱ型ORF3基因缺失突变毒株对仔猪的致病性及免疫原性研究 被引量：7
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作者 杨晓农 郭万柱 +4 位作者 徐志文 朱玲 王新 曾秀 王小玉 《畜牧兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2008年第8期1094-1099,共6页
15头28～30日龄健康仔猪分成A、B、C3组（5头／组），分别肌注接种PCV2ORF3基因缺失突变毒株mPCV2-C、亲本毒株PCV2-CD以及生理盐水。用PCR-RFLP和PCR方法，分别从A组和B组屠宰仔猪的腹股沟淋巴结中特异性检测到mPCV2-C和PCV2-CDDNA，发... 15头28～30日龄健康仔猪分成A、B、C3组（5头／组），分别肌注接种PCV2ORF3基因缺失突变毒株mPCV2-C、亲本毒株PCV2-CD以及生理盐水。用PCR-RFLP和PCR方法，分别从A组和B组屠宰仔猪的腹股沟淋巴结中特异性检测到mPCV2-C和PCV2-CDDNA，发现mPCV2-C能够在仔猪体内复制增殖。组织病理学结果表明；A组和B组腹股沟淋巴结、肝细胞及肺泡壁上皮细胞呈现病变，其中B组病变较严重，证实ORF3基因缺失未改变PCV2的组织嗜性。外周血T淋巴细胞亚群含量动态检测结果表明：与C组相比，A组、B组外周血CD3^＋、CD4^＋细胞百分含量降低，而A组CD8^＋细胞于免疫后第14天回升，高于B组和C组，表明ORF3基因缺失使病毒对T淋巴细胞亚群的影响有所减弱，并有诱导仔猪细胞免疫应答的趋势。上述结果提示ORF3缺失致使病毒的致病力有降低的趋势。PCV2抗体动态检测发现：mPCV2-C明显诱导了仔猪的体液免疫，具有良好的免疫原性。mPCV2-C可作为PCV2基因缺失疫苗候选毒株。 展开更多
关键词 猪圆环病毒ⅱ型(PCV2) orf3基因 基因缺失 致病性 免疫原性
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猪圆环病毒2型ORF2基因片段的克隆与原核表达 被引量：7
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作者 祁艳华 王爱萍 +4 位作者 李学伍 游雷鸣 史平玲 胡峰 张改平 《河南农业科学》 CSCD 北大核心 2010年第3期112-115,共4页
为在原核表达系统中表达猪圆环病毒2型(PCV2)ORF2基因片段,提取感染PCV2的细胞基因组DNA,PCR扩增ORF2基因片段并克隆至pMD-18T载体上,经PCR、酶切及测序鉴定后,将该基因重组至pET-28a原核表达载体,构建了表达载体pET-28a-ORF2。该重组... 为在原核表达系统中表达猪圆环病毒2型(PCV2)ORF2基因片段,提取感染PCV2的细胞基因组DNA,PCR扩增ORF2基因片段并克隆至pMD-18T载体上,经PCR、酶切及测序鉴定后,将该基因重组至pET-28a原核表达载体,构建了表达载体pET-28a-ORF2。该重组质粒在大肠杆菌BL21中经1mmol/LIPTG于37℃诱导5h得到最佳表达。表达重组蛋白的分子量为26.0kD,以包涵体形式存在。Western-Blot分析表明,该重组蛋白与PCV2阳性血清发生特异性反应,表明该重组蛋白具有良好的反应原性。 展开更多
关键词 猪圆环病毒2型 orf2基因 克隆 原核表达
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