奶牛气管抗菌肽(TAP)基因乳腺特异性表达载体的构建与鉴定

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作者 曹随忠 姚学萍 +4 位作者 崔亚飞 杨德英 雍康 余树民 刘宗平 《西北农林科技大学学报（自然科学版）》 CSCD 北大核心 2013年第6期1-7,18,共8页

【目的】构建奶牛气管抗菌肽(TAP)基因乳腺特异性表达载体。【方法】根据GenBank中牛TAP基因cDNA序列(GenBank号:NM_174776)设计引物,从奶牛乳腺组织中RT-PCR扩增TAP基因编码序列,将其克隆到pMD19-T(simple)载体中测序。重组质粒pMD-TAP... 【目的】构建奶牛气管抗菌肽(TAP)基因乳腺特异性表达载体。【方法】根据GenBank中牛TAP基因cDNA序列(GenBank号:NM_174776)设计引物,从奶牛乳腺组织中RT-PCR扩增TAP基因编码序列,将其克隆到pMD19-T(simple)载体中测序。重组质粒pMD-TAP经EcoRⅠ+KpnⅠ双酶切回收目的基因片段,亚克隆到携带增强型绿色荧光蛋白的通用型乳腺特异性表达载体pBLG-EGFP中,采用脂质体法转染奶牛乳腺上皮细胞(bMEC)、COS-7细胞,并注射泌乳家兔乳腺组织,荧光显微镜检测转染细胞中绿色荧光蛋白的表达,半定量RT-PCR检测家兔乳腺组织中TAP mRNA的表达。【结果】成功构建了乳腺特异性表达载体pBLG-EGFP-TAP,该载体可在bMEC中特异性地表达绿色荧光蛋白;半定量RT-PCR检测发现,转染pBLG-EGFP-TAP可显著提高家兔乳腺组织中TAPmRNA的表达水平。【结论】成功构建了乳腺特异性表达载体pBLG-EGFP-TAP,为进一步研究奶牛TAP基因的表达特性及利用基因工程技术防治奶牛乳房炎提供了重要材料。 展开更多

关键词 奶牛 乳房炎 Β-防御素 气管抗菌肽基因 乳腺特异性表达载体

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甘蓝型油菜WRI1基因cDNA克隆与种子特异性表达载体的构建

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作者 施春霖 刘聪 +3 位作者 肖旦望 邬克彬 陈社员 熊兴华 《西北农业学报》 CAS CSCD 北大核心 2014年第1期120-125,共6页

WRI1基因所编码的转录因子参与糖酵解和脂肪酸合成,在种子油的积累过程中起着关键作用。在种子中超表达WRI1基因,对提高油菜种子含油量具有重要意义。本研究利用RT-PCR技术,从甘蓝型油菜湘油15号cDNA中分离克隆了5个WRI1基因全长cDNA序... WRI1基因所编码的转录因子参与糖酵解和脂肪酸合成,在种子油的积累过程中起着关键作用。在种子中超表达WRI1基因,对提高油菜种子含油量具有重要意义。本研究利用RT-PCR技术,从甘蓝型油菜湘油15号cDNA中分离克隆了5个WRI1基因全长cDNA序列,选取2种存在明显差异(碱基缺失)的cDNA序列构建植物种子特异性表达载体。为后续转基因研究这种差异是否会造成WRI1基因在提高含油量作用上的差异作准备。通过双酶切和连接反应,分别将WRI1基因和napin启动子基因插入到pBI121载体的GUSA基因和CaMV35启动子基因位置。酶切及PCR检测结果显示,napin启动子和WRI1已插入相应位置,完成2种载体种子特异性表达WRI1基因重组载体pBI121+napin+WRI1的构建,命名为pBI121NW2、pBI121NW4。 展开更多

关键词 甘蓝型油菜 懈朋 克隆 种子特异性表达载体

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猪PBD-1基因乳腺特异性表达载体的构建 被引量：1

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作者 黎丽荣 黄海军 +7 位作者 高其双 董斌科 邓兵 刘艳 陶弼菲 向敏 吴建英 蒋思文 《生物技术通报》 CAS CSCD 北大核心 2009年第5期127-129,134,共4页

为构建猪PBD-1基因乳腺特异性表达载体,采用PCR方法从质粒pcDNA3.1-BLG-HNP-1中扩增出山羊乳球蛋白(BLG)基因,插入到真核表达载体pIRES2-EGFP-PBD-1构建成乳腺特异性表达载体pIRES2-EGFP-BLG-PBD-1。经PCR鉴定、限制性内切酶酶切分析和... 为构建猪PBD-1基因乳腺特异性表达载体,采用PCR方法从质粒pcDNA3.1-BLG-HNP-1中扩增出山羊乳球蛋白(BLG)基因,插入到真核表达载体pIRES2-EGFP-PBD-1构建成乳腺特异性表达载体pIRES2-EGFP-BLG-PBD-1。经PCR鉴定、限制性内切酶酶切分析和克隆片段序列测定、比较,鉴定。结果成功构建了乳腺特异性表达载体pIRES2-EGFP-BLG-PBD-1。乳腺特异性表达载体pIRES2-EGFP-BLG-PBD-1的成功构建,为进一步研究PBD-1蛋白的抗菌活性、抗菌机理及将进一步该载体应用于动物乳腺生物反应器的研究奠定基础。 展开更多

关键词 猪β防御素1 山羊乳球蛋白 乳腺特异性表达载体 抗菌机理

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甘蓝型油菜pep基因片段的克隆和种子特异性反义表达载体的构建 被引量：7

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作者 张志刚 白德朗 +3 位作者 陈烈臣 熊兴华 李栒 官春云 《湖南农业大学学报（自然科学版）》 CAS CSCD 北大核心 2005年第3期249-252,共4页

丙酮酸羧化酶(PEP)是控制油菜蛋白质/油脂含量比例的一个关键酶,抑制种子中pepc基因的表达,使其底物(丙酮酸)更多地朝生成油脂的方向流动,对提高种子的含油量,增加油菜的经济价值具有重要的意义.利用PCR技术从甘蓝型油菜湘油15号基因组... 丙酮酸羧化酶(PEP)是控制油菜蛋白质/油脂含量比例的一个关键酶,抑制种子中pepc基因的表达,使其底物(丙酮酸)更多地朝生成油脂的方向流动,对提高种子的含油量,增加油菜的经济价值具有重要的意义.利用PCR技术从甘蓝型油菜湘油15号基因组中扩增了PEP基因片段,并将其克隆到pGEM-TEasy载体上进行测序.测序结果表明:扩增片段长576bp,与Yannai报道的PEP基因相应区域的同源性为95%.用扩增引物上设计的BamHI和SacI两位点酶将PEP基因片段切下,反向插入到pBI121.N质粒的Napin启动子之后,构建了种子特异性反义PEP表达载体,并通过农杆菌介导法将反义PEP基因转化到湘油15号中. 展开更多

关键词 甘蓝型油菜 PCR 反义PEP 种子特异性表达载体

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奶牛溶菌酶基因(Lyz)乳腺特异性表达质粒构建与鉴定 被引量：1

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作者 张志鹏 江静宜 +3 位作者 夏海磊 冀德君 李明勋 杨章平 《家畜生态学报》 北大核心 2019年第5期24-28,共5页

研究旨在构建具有高效抗菌、活性持久的奶牛乳腺特异性表达质粒,探索研制新型抗菌制剂,为利用基因工程技术防治奶牛乳房炎提供重要材料。根据GenBank中奶牛溶菌酶基因(lysozyme,Lyz)mRNA序列(GenBank号:NM_180999.1)设计引物,从奶牛乳... 研究旨在构建具有高效抗菌、活性持久的奶牛乳腺特异性表达质粒,探索研制新型抗菌制剂,为利用基因工程技术防治奶牛乳房炎提供重要材料。根据GenBank中奶牛溶菌酶基因(lysozyme,Lyz)mRNA序列(GenBank号:NM_180999.1)设计引物,从奶牛乳腺上皮细胞中RT-PCR扩增Lyz基因编码序列,将其克隆到携带增强型绿色荧光蛋白通用型表达载体pEGFP-N1中测序。重组质粒pEGFP-N1-Lyz经AseI+HindIII双酶切除CMV启动子,将奶牛乳腺特异性表达β-乳球蛋白基因(BLG)启动子同源重组替换到AseI和HindIII酶切位点,构建奶牛溶菌酶基因(Lyz)乳腺特异性表达质粒pBLG-EGFP-N1-Lyz,采用脂质体法转染奶牛乳腺上皮细胞(BMEC)、人肾脏上皮细胞(HEK293T),荧光显微镜检测转染细胞中绿色荧光蛋白的表达情况。结果表明,重组表达质粒pBLG-EGFP-N1-Lyz测序结果与目的片段长度相符,转染至BMEC细胞和HEK293T细胞,在奶牛乳腺上皮细胞观察到绿色荧光,HEK293T细胞未观察到绿色荧光,奶牛Lyz基因乳腺特异性表达质粒构建成功。 展开更多

关键词 奶牛乳房炎 溶菌酶 乳腺特异性表达载体 基因治疗

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构建LEF1基因毛囊特异表达载体并稳定转染胎儿成纤维细胞

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作者 李彬 鲍文蕾 +5 位作者 张涛 侯鑫 郭旭东 王潇 王志钢 刘东军 《生物技术通报》 CAS CSCD 北大核心 2011年第3期141-145,共5页

旨在构建内蒙古白绒山羊(Capra hircus)淋巴样增强因子-1(Lymphoid enhancer factor,LEF1)基因真核表达载体并转染胎儿成纤维细胞,获得稳定表达红色荧光蛋白及毛囊特异性表达LEF1的转基因细胞克隆。以pCDsRed2载体为基本骨架将LEF1基因... 旨在构建内蒙古白绒山羊(Capra hircus)淋巴样增强因子-1(Lymphoid enhancer factor,LEF1)基因真核表达载体并转染胎儿成纤维细胞,获得稳定表达红色荧光蛋白及毛囊特异性表达LEF1的转基因细胞克隆。以pCDsRed2载体为基本骨架将LEF1基因亚克隆到KAP6-1启动子下游,连接红色荧光蛋白表达元件,构建LEF1基因毛囊特异表达载体pCDsRed-KL。外源表达载体以lipofectamineTM2000介导转染胎儿成纤维细胞,通过G418筛选获得稳定转染的细胞克隆。PCR鉴定外源基因在细胞基因组中的整合。测序显示构建的表达载体pCDsRed-KL序列中,LEF1基因正确连接在KAP6-1启动子下游,顺序连接CMV启动子和红色荧光蛋白基因,载体构建正确。脂质体介导的稳定转染效率约为14.0%,经G418筛选得到高效表达红色荧光蛋白转基因细胞克隆。PCR检测显示外源KAP6-1启动子和LEF1基因整合到胎儿成纤维细胞基因组中。 展开更多

关键词 内蒙古白绒山羊 淋巴样增强因子-1 毛囊特异性表达载体 稳定转染

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大豆球蛋白G1启动子的克隆及植物表达载体构建 被引量：1

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作者 王永芹 陈德富 +1 位作者 王绘砖 陈喜文 《广西植物》 CAS CSCD 北大核心 2009年第2期254-259,共6页

从大豆冀nf37和冀豆15中克隆了大豆球蛋白G1基因的启动子片段。序列分析表明,两种启动子片段均为688bp,与GenBank现有的3种启动子序列(四川大豆(DQ250808)、南农87-c38(AY649096)和Dare(X15121))间的同源性在96.4%～99.6%之间。其中来自... 从大豆冀nf37和冀豆15中克隆了大豆球蛋白G1基因的启动子片段。序列分析表明,两种启动子片段均为688bp,与GenBank现有的3种启动子序列(四川大豆(DQ250808)、南农87-c38(AY649096)和Dare(X15121))间的同源性在96.4%～99.6%之间。其中来自冀nf37的启动子片段除Legumin盒上有一个碱基差异外,其它元件与DQ250808完全相同,据此推测该启动子片段具有种子特异性启动子活性。将其与已有γ-生育酚甲基转移酶基因连接,构建了种子特异性表达载体pBG1TMT,为通过代谢工程手段调控油料作物种子维生素E组成、提高其营养品质奠定了基础。 展开更多

关键词 大豆 球蛋白G1 启动子 γ-生育酚甲基转移酶(γ-TMT) 种子特异性表达载体

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人血清白蛋白基因的克隆及其真核表达载体构建

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作者 洪志勇 李玉芳 +4 位作者 张兴峰 林秀娇 李鸿翔 庄益芬 张文昌 《福建畜牧兽医》 2013年第5期1-5,共5页

利用RT-PCR扩增并克隆了含人血清白蛋白序列长约1.8 kb的片段,酶切鉴定并进行序列分析,测序结果与GenBank中登录的人血清白蛋白cDNA序列的同源性为97%;以鹌鹑卵清蛋白5’调控区POV来启动HAS的表达。用限制性内切酶kpnⅠ和HindⅢ双酶切质... 利用RT-PCR扩增并克隆了含人血清白蛋白序列长约1.8 kb的片段,酶切鉴定并进行序列分析,测序结果与GenBank中登录的人血清白蛋白cDNA序列的同源性为97%;以鹌鹑卵清蛋白5’调控区POV来启动HAS的表达。用限制性内切酶kpnⅠ和HindⅢ双酶切质粒pOV和pHSA,然后用T4连接酶定向连接成重组质粒pOV-pHSA,经酶切鉴定,两者成功融合。 展开更多

关键词 人血清白蛋白 鹌鹑 卵管特异性表达载体

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拟南芥ACOS5基因启动子的克隆和表达载体构建

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作者 李亚琴 陈燕 +3 位作者 郑帮 孙虎林 周树敏 张卫 《河南师范大学学报（自然科学版）》 CAS 北大核心 2014年第6期103-107,共5页

花药组织特异性启动子在花药发育的分子遗传学中有重要的研究价值.采用PCR方法克隆了1kb长度的ACOS5基因启动子,并将其连入含有GFP基因的拟南芥表达载体p1300中.电激转化农杆菌GV3101后,通过农杆菌介导转化拟南芥,获得转基因植株.显微... 花药组织特异性启动子在花药发育的分子遗传学中有重要的研究价值.采用PCR方法克隆了1kb长度的ACOS5基因启动子,并将其连入含有GFP基因的拟南芥表达载体p1300中.电激转化农杆菌GV3101后,通过农杆菌介导转化拟南芥,获得转基因植株.显微观察显示,转基因植物花药只在绒毡层中有荧光表达.这说明ACOS5基因启动子可以在拟南芥花药中驱动外源GFP基因的特异性表达. 展开更多

关键词 ACOS5 拟南芥 花药 特异性表达载体

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绵羊毛角蛋白Ⅱ型中间丝9基因的扩增及表达 被引量：4

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作者 于永生 王晓阳 +2 位作者 朴庆林 罗晓彤 金海国 《中国畜牧兽医》 CAS 北大核心 2011年第6期64-67,共4页

本试验旨在构建绵羊毛角蛋白Ⅱ型中间丝9(keratin typeⅡintermediate filament 9,KIFⅡ-9)基因cDNA的毛囊特异性表达载体,转染辽宁绒山羊胎儿成纤维细胞,筛选出稳定表达外源基因并可用于核移植的转基因细胞克隆。通过PCR扩增得到的KAP... 本试验旨在构建绵羊毛角蛋白Ⅱ型中间丝9(keratin typeⅡintermediate filament 9,KIFⅡ-9)基因cDNA的毛囊特异性表达载体,转染辽宁绒山羊胎儿成纤维细胞,筛选出稳定表达外源基因并可用于核移植的转基因细胞克隆。通过PCR扩增得到的KAP6-1基因启动子,然后与RT-PCR扩增得到的KIFⅡ-9 cDNA序列连接构成皮肤特异性表达载体pcDNA3.1-KK,将重组表达载体以脂质体介导转染胎儿成纤维细胞,通过G418筛选获得转基因细胞克隆,结果显示,外源KAP6-1启动子序列和KIFⅡ-9 cDNA整合到细胞基因组中,为下一步通过核移植方法获得转基因绒山羊提供了条件。 展开更多

关键词 辽宁绒山羊 毛角蛋白Ⅱ型中间丝基因 毛囊特异性表达载体 转基因体细胞

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口蹄疫病毒VP1基因在转基因拟南芥种子中的表达及活性检测

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作者 潘丽 张永光 +8 位作者 王永录 方玉珍 蒋守田 王宝琴 王文秀 王炜 孙元 吕建亮 谢庆阁 《畜牧兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2006年第5期469-473,共5页

构建了FMDV VP1基因的种子特异性表达载体p7SBin438/VP1,在根癌农杆菌GV3101的介导下,通过浸花法转化拟南芥花序,转基因拟南芥通过卡那霉素抗性筛选后,进行了目的基因PCR扩增和ELISA检测,对ELISA筛选的阳性植株进行Western blot检测,并... 构建了FMDV VP1基因的种子特异性表达载体p7SBin438/VP1,在根癌农杆菌GV3101的介导下,通过浸花法转化拟南芥花序,转基因拟南芥通过卡那霉素抗性筛选后,进行了目的基因PCR扩增和ELISA检测,对ELISA筛选的阳性植株进行Western blot检测,并对转基因拟南芥后代进行了目的基因PCR分析。结果表明,种子特异性表达载体p7SBin438/VP1构建正确,FMDV结构蛋白VP1编码基因已整合进拟南芥基因组并获得表达,表达蛋白具有免疫反应活性,转基因拟南芥后代分析表明VP1基因已经遗传给后代。本试验为将FMDV免疫基因向豆科植物种子中的转化提供了依据。 展开更多

关键词 口蹄疫病毒 VP1基因 种子特异性表达载体 转基因拟南芥

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转人乳铁蛋白基因山羊乳腺上皮细胞的研究 被引量：7

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作者 郑月茂 刘凤军 +1 位作者 何小宁 张涌 《畜牧兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2006年第12期1282-1286,共5页

利用脂质体包裹含人乳铁蛋白基因的重组质粒,并导入到山羊乳腺上皮细胞,经G418及PCR筛选获得阳性细胞;转染细胞增殖后经激素诱导,培养液上清通过Western blot检测证明,转染细胞表达并分泌出人乳铁蛋白,其分子质量为58 ku。

关键词 人乳铁蛋白基因乳腺特异性表达载体 绿色荧光蛋白 转基因山羊乳腺上皮细胞

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郑州大学学报(医学版)双月刊1957年创刊第39卷总目次

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《郑州大学学报（医学版）》 CAS 北大核心 2004年第6期i001-i009,共9页

关键词 治疗体会 患者 疗效观察 蛋白 李建生 大鼠脑 乔玉环 临床观察 内皮素 细胞凋亡 乳腺特异性表达载体 肾母细胞瘤 杜氏盐藻 食管癌 食管肿瘤 食管鳞癌 夜遗尿 学报 连续出版物 医学 现代医药学 目次

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