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牛病毒性腹泻病毒1型SYBR GreenⅠ荧光定量PCR方法的建立与应用
1
作者 刘飞飞 杨澳飞 +7 位作者 贾东鹭 韩新雨 陈慧敏 陈建 魏颖 丁轲 张春杰 陈松彪 《中国预防兽医学报》 北大核心 2025年第4期363-369,共7页
为建立牛病毒性腹泻病毒1型(BVDV-1)荧光定量RT-PCR(RT-qPCR)检测方法,本研究参考GenBank中的不同BVDV-1序列,设计并合成Npro基因保守区域特异性引物,以重组质粒标准品作为模板对反应体系进行优化,初步建立一种BVDV-1特异性SYBR GreenⅠ... 为建立牛病毒性腹泻病毒1型(BVDV-1)荧光定量RT-PCR(RT-qPCR)检测方法,本研究参考GenBank中的不同BVDV-1序列,设计并合成Npro基因保守区域特异性引物,以重组质粒标准品作为模板对反应体系进行优化,初步建立一种BVDV-1特异性SYBR GreenⅠRT-qPCR方法,结果显示,RT-qPCR方法的最适退火温度为55℃,最佳引物终浓度为0.4μmol/L;质粒标准品浓度在5.46×10^(1)拷贝/μL~5.46×10^(7)拷贝/μL之间与各自的Ct值具有良好的线性关系,线性方程为:y=-3.2011x+33.6,R^(2)=0.9975,熔解曲线为单一峰值;以BVDV-1、牛病毒性腹泻病毒2型、牛病毒性腹泻病毒3型、边界病毒、猪瘟病毒、牛轮状病毒和牛冠状病毒等的RNA反转录所得cDNA以及大肠杆菌和鼠伤寒沙门菌总DNA为模板,采用本研究建立的RT-qPCR方法检测,评估该方法的特异性;分别以10倍倍比稀释(10^(1)~10^(9))的pMD19-T-Npro重组质粒标准品作为模板,利用本研究建立的方法与普通RT-PCR方法检测,比较所建方法的敏感性;以5个不同浓度的重组质粒标准品pMD19-T-Npro作为模板,利用RT-qPCR方法分别于同一时间和不同时间分别进行批内和批间重复性试验,评估该方法的重复性。特异性试验结果显示,该方法仅对BVDV-1有特异性扩增曲线,牛病毒性腹泻病毒2型、牛病毒性腹泻病毒3型、边界病毒、猪瘟病毒、牛轮状病毒、牛冠状病毒、大肠杆菌、鼠伤寒沙门菌均为阴性;敏感性试验结果显示,该方法对质粒标准品的检测限为5.46×10^(1)拷贝/μL,敏感性高;对重组质粒标准品的批内和批间重复性试验的变异系数均小于2%,具有良好的重复性和稳定性。采用本研究建立的RT-qPCR方法和文献中的BVDV-1 RT-qPCR方法分别对50份腹泻牛粪便样品检测,结果显示,两种方法的阳性检出率均为16%(8/50),总符合率达100%。本研究建立的RT-qPCR方法具有特异性强、敏感性高、重复性好的优点,为BVDV临床快速检测、流行病学调查及疫病防控工作提供了新的技术支撑和思路。 展开更多
关键词 牛病毒性腹泻病毒1型 Npro基因 荧光定量RT-PCR 应用
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牛病毒性腹泻病毒1型E2蛋白抗体侧流免疫层析检测方法的建立 被引量：1
2
作者 刘鑫欢 张纹纹 +8 位作者 程子龙 金前跃 郭志睿 郭大伟 龙云凤 杨蕾蕾 刘茂军 白娟 李文良 《南京农业大学学报》 北大核心 2025年第5期1100-1107,共8页
[目的]本研究旨在使用金-银纳米颗粒标记纯化的牛病毒性腹泻病毒1型(BVDV-1)重组E2蛋白,建立基于金-银纳米颗粒的E2蛋白抗体侧流免疫层析检测方法。[方法]对金-银纳米颗粒标记条件进行优化,选取2 mg·mL^(-1)的金黄色葡萄球菌A蛋白(... [目的]本研究旨在使用金-银纳米颗粒标记纯化的牛病毒性腹泻病毒1型(BVDV-1)重组E2蛋白,建立基于金-银纳米颗粒的E2蛋白抗体侧流免疫层析检测方法。[方法]对金-银纳米颗粒标记条件进行优化,选取2 mg·mL^(-1)的金黄色葡萄球菌A蛋白(staphylococal protein A,SPA)和BVDV-1单克隆抗体1E2B3包被于硝酸纤维素(NC)膜上,分别作为检测线(test line,T线)和质控线(control line,C线),对反应条件进行优化后建立侧流免疫层析检测方法。[结果]金-银纳米颗粒最佳标记条件:以pH7.4的硼酸-硼砂缓冲液作为金-银纳米颗粒的溶剂;最佳标记蛋白浓度为10μg·mL^(-1)。优化后的侧流免疫层析检测方法的反应条件:2 mg·mL^(-1)的SPA作为T线,0.6 mg·mL^(-1)的1E2B3作为C线,待检血清稀释度为1∶50。特异性试验结果表明建立的金-银纳米颗粒免疫层析试纸条不与猪瘟病毒(CSFV)、牛病毒性腹泻病毒2型(BVDV-2)、牛副流感病毒3型(BPIV3)、传染性牛鼻气管炎病毒(IBRV)、口蹄疫病毒(FMDV)、牛支原体和布鲁氏菌阳性血清发生交叉反应。敏感性试验结果显示,将BVDV阳性血清(中和抗体效价为1∶2048)稀释512倍时金-银纳米颗粒免疫层析试纸条仍可检出。使用金-银纳米颗粒免疫层析试纸条检测125份牛血清,并与中和试验结果比较,两者阴性血清符合率为100%,阳性血清符合率为96.04%,总体符合率为96.80%。[结论]本试验基于金-银纳米颗粒建立的免疫层析抗体检测方法具有特异性好、灵敏度高、操作简便快捷的特点,为快速检测BVDV-1抗体提供了有力的技术支撑。 展开更多
关键词 牛病毒性腹泻病毒 E2蛋白 抗体 金-银纳米颗粒 侧流免疫层析方法
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牛病毒性腹泻病毒1型KE-9基因缺失弱毒疫苗和牛病毒性腹泻病毒2型NY-93基因缺失弱毒疫苗在怀孕母牛中垂直传播能力评价 被引量：1
3
作者 孙艳永 田赵勇 +2 位作者 徐瑞 陈宁 文世富 《中国动物传染病学报》 CAS 北大核心 2024年第1期82-87,共6页
本研究通过对怀孕母牛免疫牛病毒性腹泻病毒1型KE-9基因缺失弱毒疫苗和牛病毒性腹泻病毒2型NY-93基因缺失弱毒疫苗后检测胎牛组织中是否存在疫苗病毒,以评价该疫苗的垂直传播能力。试验将16头牛病毒性腹泻病毒(BVDV)抗原和抗体阴性,怀孕... 本研究通过对怀孕母牛免疫牛病毒性腹泻病毒1型KE-9基因缺失弱毒疫苗和牛病毒性腹泻病毒2型NY-93基因缺失弱毒疫苗后检测胎牛组织中是否存在疫苗病毒,以评价该疫苗的垂直传播能力。试验将16头牛病毒性腹泻病毒(BVDV)抗原和抗体阴性,怀孕60~90 d的母牛随机分成2组,第1组6母牛肌肉注射2.0 mL牛病毒性腹泻病毒1型KE-9基因缺失弱毒疫苗;另外2头牛不做任何接种作为哨兵牛同群饲养。第2组6母牛肌肉注射2.0 mL牛病毒性腹泻病毒2型NY-93基因缺失弱毒疫苗;另外2头牛不做任何接种作为哨兵牛同群饲养。母牛免疫后血清抗体转阳,BVDV抗体明显升高。免疫后第56 d剖取免疫牛的胎牛,采集胎牛脑、胸腺、肠系膜淋巴结和脾脏组织用病毒分离方法检测牛病毒性腹泻病毒。结果显示,所有怀孕母牛在整个试验期内无任何临床症状,也无流产现象。试验结束时胎牛发育良好,且未在胎牛的脑、胸腺、肠系膜淋巴结和脾脏组织中分离到牛病毒性腹泻病毒。综上所述,牛病毒性腹泻病毒1型KE-9基因缺失弱毒疫苗和牛病毒性腹泻病毒2型NY-93基因缺失弱毒疫苗对怀孕母牛和胎牛都是安全的,无垂直传播。 展开更多
关键词 牛病毒性腹泻病毒 基因缺失弱毒疫苗 垂直传播
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牛病毒性腹泻病毒1型KE-9基因缺失弱毒疫苗和牛病毒性腹泻病毒2型NY-93基因缺失弱毒疫苗对4~6月龄犊牛的安全性研究 被引量：1
4
作者 孙艳永 杨德洪 +1 位作者 徐瑞 陈宁 《中国动物传染病学报》 CAS 北大核心 2024年第2期97-105,共9页
本试验旨在评估牛病毒性腹泻病毒1型KE-9基因缺失弱毒疫苗和牛病毒性腹泻病毒2型NY-93基因缺失弱毒疫苗对4~6月龄犊牛的安全性。12头4~6月龄犊牛随机分成3组,每组4头,各组分别肌肉注射牛病毒性腹泻病毒1型KE-9基因缺失弱毒疫苗、牛病毒... 本试验旨在评估牛病毒性腹泻病毒1型KE-9基因缺失弱毒疫苗和牛病毒性腹泻病毒2型NY-93基因缺失弱毒疫苗对4~6月龄犊牛的安全性。12头4~6月龄犊牛随机分成3组,每组4头,各组分别肌肉注射牛病毒性腹泻病毒1型KE-9基因缺失弱毒疫苗、牛病毒性腹泻病毒2型NY-93基因缺失弱毒疫苗或疫苗稀释液,2 mL/头。试验结果表明,免疫后所有试验用牛无牛病毒性腹泻病毒引起的发热和临床症状,也不引起白细胞水平的下降;仅1头牛在免疫牛病毒性腹泻病毒2型NY-93基因缺失疫苗后第7 d检测到病毒血症和鼻腔排毒,在其他时间点均为阴性。所有犊牛均无大体病理学和组织病理学变化。综上所述,牛病毒性腹泻病毒1型KE-9基因缺失弱毒疫苗和牛病毒性腹泻病毒2型NY-93基因弱毒疫苗对4~6月龄的犊牛安全性良好。 展开更多
关键词 牛病毒性腹泻病毒 基因缺失弱毒疫苗 安全性
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牛病毒性腹泻病毒1型和2型双重RT-PCR检测方法的建立 被引量：3
5
作者 王克栋 熊浩 +4 位作者 季新成 冉多良 彭武丽 于学辉 史茜 《动物医学进展》 CSCD 北大核心 2013年第10期21-25,共5页
根据GenBank已发表的牛病毒性腹泻病毒(BVDV)基因1型和2型毒株的5′端非编码区(5′-UTR)保守序列的差异,设计2对特异性引物,并以牛GAPDH基因为内标,设计1对特异性引物,建立牛病毒性腹泻病毒分型与内标三重RT-PCR检测方法。3对引物可分... 根据GenBank已发表的牛病毒性腹泻病毒(BVDV)基因1型和2型毒株的5′端非编码区(5′-UTR)保守序列的差异,设计2对特异性引物,并以牛GAPDH基因为内标,设计1对特异性引物,建立牛病毒性腹泻病毒分型与内标三重RT-PCR检测方法。3对引物可分别扩增出的片段大小为127、94、152bp,与预期大小相符。经反应条件优化,该方法的灵敏度为10°TCID50,与不加内标检测灵敏度相当。经临床样品检测验证,该方法具有较好的特异性和重复性,可用来对牛病毒性腹泻病毒分型进行快速准确的检测。 展开更多
关键词 牛病毒性腹泻病毒 GAPDH基因 基因分型 内标 双重RT-PCR
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牛病毒性腹泻病毒1型RT-RAA快速诊断方法的建立 被引量：3
6
作者 范颖 田雪 +5 位作者 孙淑芳 吴发兴 尼博 刘建柱 孙翔翔 胡莉萍 《中国动物检疫》 CAS 2023年第4期93-98,共6页
为解决牛病毒性腹泻病毒(BVDV)现场快速诊断难点,提升应急响应速度,根据BVDV 1型基因组5’-UTR保守区序列设计特异性引物和探针,建立了BVDV 1型重组酶聚合酶等温核酸扩增方法(reverse transcription recombinase aid amplification,RT-R... 为解决牛病毒性腹泻病毒(BVDV)现场快速诊断难点,提升应急响应速度,根据BVDV 1型基因组5’-UTR保守区序列设计特异性引物和探针,建立了BVDV 1型重组酶聚合酶等温核酸扩增方法(reverse transcription recombinase aid amplification,RT-RAA),并对该方法的特异性、敏感性和重复性进行评估。结果显示:该方法在39℃等温条件下检测时间为20 min,对BVDV 1型核酸检测下限为1.2×10^(2) copies/μL;3个浓度梯度的核酸组内重复性试验的变异系数(CV)分别为3.24%、9.48%和8.79%,均在10.00%以内,重复性好;建立的方法与猪瘟病毒、牛冠状病毒、牛传染性鼻气管炎病毒等无特异性反应。对66份临床样品进行检测,发现所建立的方法与荧光定量PCR检测结果符合率为98.48%,Kappa值为0.881(P<0.001)。结果表明,本研究建立的RT-RAA快速诊断方法特异性强、灵敏度高、操作便捷,可用于BVDV 1型的现场快速检测。 展开更多
关键词 牛病毒性腹泻病毒 重组酶介导的等温扩增 快速诊断
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牛星状病毒、牛病毒性腹泻病毒1型、牛冠状病毒和牛轮状病毒四重实时荧光定量RT-PCR检测方法的建立 被引量：12
7
作者 刘梦瑶 王展慧 +2 位作者 吴浩 谷月 吴文学 《畜牧兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2021年第7期1942-1952,共11页
利用多重荧光定量RT-PCR(real-time RT-PCR)方法,提高对多病原检测的速度和灵敏度,促进对犊牛腹泻的快速诊断和及时治疗。分别在牛星状病毒(BAstV)ORF2基因,牛病毒性腹泻病毒1型(BVDV-1)5′端非编码区,牛冠状病毒(BCV)N pro基因和牛轮... 利用多重荧光定量RT-PCR(real-time RT-PCR)方法,提高对多病原检测的速度和灵敏度,促进对犊牛腹泻的快速诊断和及时治疗。分别在牛星状病毒(BAstV)ORF2基因,牛病毒性腹泻病毒1型(BVDV-1)5′端非编码区,牛冠状病毒(BCV)N pro基因和牛轮状病毒(BRV)VP6基因的保守基因序列设计、合成并试验筛选了四对有效的特异性引物和探针。进一步利用含4种病毒目的片段的重组质粒,对引物和探针的浓度以及反应条件进行了优化,建立了Real-time RT-PCR标准曲线,并对四重Real-time PCR方法的特异性、敏感性、重复性和各种临床样本的适用性进行了评价。结果显示:Real-time RT-PCR最适退火温度和时间分别为50.0℃和45 s,BAstV、BVDV-1、BCV和BRV的引物浓度分别为300、300、400和500 nmol·L^(-1),探针浓度分别为250、150、100和300 nmol·L^(-1)。对BVDV-1、BCV和BRV的最低检测限均为102copies·μL^(-1),对BAstV的最低检测限为103 copies·μL^(-1),具有良好的特异性和重复性。该方法对临床采集的粪样的阳性检出率高于PCR方法。上述结果表明,建立的四重Real-time RT-PCR方法可以用于犊牛腹泻常见病原BAstV、BVDV-1、BCV和BRV的快速鉴别诊断。 展开更多
关键词 牛星状病毒 牛病毒性腹泻病毒 牛冠状病毒 牛轮状病毒 实时荧光定量RT-PCR
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基于RTCPA-CRISPR/Cas12a的牛病毒性腹泻病毒检测方法的建立及应用
8
作者 蒙琦 常亮 +2 位作者 杨明 曹映辉 贺泂杰 《中国动物传染病学报》 北大核心 2025年第2期80-88,共9页
本研究旨在建立一种检测牛病毒性腹泻病毒的RT-CPA-CRISPR/Cas12a方法。选取BVDV的E0蛋白基因序列为基础,设计CPA特异性引物。同时,依据CRISPR/Cas12a的设计原则,设计了crRNA靶向RT-RAA扩增产物,并优化了RT-CPA-CRISPR/Cas12a反应体系,... 本研究旨在建立一种检测牛病毒性腹泻病毒的RT-CPA-CRISPR/Cas12a方法。选取BVDV的E0蛋白基因序列为基础,设计CPA特异性引物。同时,依据CRISPR/Cas12a的设计原则,设计了crRNA靶向RT-RAA扩增产物,并优化了RT-CPA-CRISPR/Cas12a反应体系,此外,借助建立的该方法,开展了临床样品的检测。结果显示:所建立的检测方法对BVDV的最低检出限为8.0 copies/μL,并具有高度特异性,对42份临床样品检测显示,该方法与传统PCR方法的一致性好,符合率能达到92.86%。该研究建立了牛病毒性腹泻病毒的RT-CPA-CRISPR/Cas12a检测方法,为该病的诊断提供了技术手段。 展开更多
关键词 牛病毒性腹泻病毒 交叉引物恒温扩增技术 CRISPR/Cas12a 灵敏度 特异性
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2022—2024年中国部分地区牛病毒性腹泻病毒分子检测及基因分型
9
作者 安乐乐 任晓婷 +5 位作者 蓝秋菊 莫永利 曹小安 丁玉林 马忠仁 马晓霞 《畜牧兽医学报》 北大核心 2025年第10期5328-5334,共7页
牛病毒性腹泻病毒(BVDV)是引起牛群中重要经济损失的病毒之一,尤其对幼牛的健康和发展造成了严重影响。本试验旨在建立通用型BVDV SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR(BVDV SYBR GreenⅠqPCR)方法并对中国部分地区散养牛群样本进行病原学检测... 牛病毒性腹泻病毒(BVDV)是引起牛群中重要经济损失的病毒之一,尤其对幼牛的健康和发展造成了严重影响。本试验旨在建立通用型BVDV SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR(BVDV SYBR GreenⅠqPCR)方法并对中国部分地区散养牛群样本进行病原学检测,掌握中国部分地区散养牛群BVDV感染情况、流行基因型及亚型。依据GenBank不同基因亚型BVDV 5′UTR序列建立通用型BVDV SYBR GreenⅠqPCR方法。使用该方法对2022年6月—2024年12月采集的712份散养牛血清样本及咳嗽、发烧、拉稀症状犊牛组织样本进行检测及遗传进化分析,同时对犊牛样本进行病毒分离、间接免疫荧光(IFA)鉴定和苏木精-伊红染色法(HE染色)观察。结果显示,建立的BVDV SYBR GreenⅠqPCR方法标准曲线的线性关系良好、敏感性高、特异性强和重复性好。散养牛血清样本阳性率为19.10%,并成功分离BVDV-24GS毒株。在5′UTR基因系统进化树分析中,BVDV基因亚型包括1c、1m、1o、1i、1q、1b和2。以上结果表明,成功建立通用型BVDV SYBR GreenⅠqPCR方法并实施初步检测,中国部分地区散养牛群中均存在不同程度BVDV感染,病毒基因分型鉴定丰富了BVDV的分子流行病学基础数据,为BVDV的科学防控、疫苗研制和免疫策略优化提供了依据。 展开更多
关键词 牛病毒性腹泻病毒 SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR 分子检测 基因分型鉴定
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不同生物型牛病毒性腹泻病毒NS4B蛋白的生物信息学分析 被引量：1
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作者 吴树康 梁滋旺 +3 位作者 姜伟 金彩虹 陈岩 郭明佳 《中国动物检疫》 2025年第2期108-113,共6页
牛病毒性腹泻病毒(BVDV)是一种引起牛病毒性腹泻的高度致死性病原,根据生物型不同可分为致细胞病变型(CP)及非致细胞病变型(NCP)2种。本研究通过多种生物信息学方法,对这2种生物型BVDV毒株NS4B蛋白的差异及相似性进行了比较。结果显示:... 牛病毒性腹泻病毒(BVDV)是一种引起牛病毒性腹泻的高度致死性病原,根据生物型不同可分为致细胞病变型(CP)及非致细胞病变型(NCP)2种。本研究通过多种生物信息学方法,对这2种生物型BVDV毒株NS4B蛋白的差异及相似性进行了比较。结果显示:2种生物型BVDV的NS4B蛋白均属于不含信号肽和跨膜区的不稳定性疏水蛋白,其N端具有较高变异性;亚细胞定位预测发现,NS4B蛋白不含有线粒体导肽(mTP)或分泌通道信号肽(SP),且定位在内质网和线粒体中的概率最高;高级结构预测发现,2种生物型NS4B蛋白的二级与三级结构相似,均以α-螺旋为主;B细胞抗原表位分析发现,NCP型BVDV含有8个B细胞抗原表位肽段,CP型含有9个;蛋白翻译后修饰预测发现,NCP型BVDV具有1个特异性N-糖基化修饰位点,NCP型BVDV具有36个潜在的磷酸化修饰位点,而CP型具有35个。结果表明:2种生物型BVDV NS4B蛋白的基本理化性质及蛋白质结构相似性较高,但亚细胞定位情况和蛋白翻译后修饰有所不同,推测N端氨基酸序列的高突变性及蛋白翻译后修饰的不同可能会影响不同生物型BVDV与发病动物临床症状之间的关系。 展开更多
关键词 牛病毒性腹泻病毒 NS4B蛋白 生物信息学 遗传变异
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牛病毒性腹泻/黏膜病病原学特征及其检测方法研究进展 被引量：1
11
作者 陈伯祥 王佳 +2 位作者 赵子惠 杨明 唐云娇 《畜牧兽医杂志》 2025年第2期97-102,共6页
近年来,牛病毒性腹泻病/黏膜病(BVD-MD)在国内外流行广泛、对养牛业危害严重,仅通过临床症状和病理变化很难与其它腹泻病作出鉴别诊断。为了确诊和净化BVD-MD,选择一种最佳的检测方法就显得十分重要。本文对牛病毒性腹泻病毒(BVDV)病原... 近年来,牛病毒性腹泻病/黏膜病(BVD-MD)在国内外流行广泛、对养牛业危害严重,仅通过临床症状和病理变化很难与其它腹泻病作出鉴别诊断。为了确诊和净化BVD-MD,选择一种最佳的检测方法就显得十分重要。本文对牛病毒性腹泻病毒(BVDV)病原基本信息及流行毒株、检测方法和近年来的研究进行了综述,以期对牛病毒性腹泻/黏膜病的流行病学调查、致病机制、检测及防治提供参考。 展开更多
关键词 牛病毒性腹泻病毒 病原学 检测方法
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环介导等温扩增技术在牛病毒性腹泻检测中的应用
12
作者 周娴 陈文钦 +5 位作者 王雯熙 孙智武 张苗苗 郭妮妮 宋先荣 吴修竹 《养殖与饲料》 2025年第5期41-46,共6页
[目的]基于环介导等温扩增(loop mediated isothermal amplification,LAMP)技术,研究1种快速、灵敏检测牛病毒性腹泻病毒(bovine viral diarrhea virus,BVDV)检测方法,为牛病毒性腹泻的快速诊治提供参考。[方法]参考GenBank上BVDV序列,... [目的]基于环介导等温扩增(loop mediated isothermal amplification,LAMP)技术,研究1种快速、灵敏检测牛病毒性腹泻病毒(bovine viral diarrhea virus,BVDV)检测方法,为牛病毒性腹泻的快速诊治提供参考。[方法]参考GenBank上BVDV序列,依据BVDV的结构蛋白5'-UTR保守序列设计出多组引物探针,从中优选出1组扩增效果最佳的引物探针,经过优化反应体系和退火温度,建立BVDV的环介导等温扩增技术(LAMP)检测方法。随后对该方法的敏感性、特异性进行了评估,并应用该检测方法进行临床样品检测。[结果]所建立的LAMP方法展现出高度特异性,仅对BVDV产生扩增信号,与牛常见病原(如口蹄疫、沙门氏菌等)无交叉反应;通过梯度稀释重组质粒验证,其检测灵敏度为102 copies/μL,较常规PCR提升10倍;临床样本检测结果与PCR法完全一致(符合率100%)。[结论]本研究建立的BVDV LAMP检测方法敏感性高、特异性强,适用于牛病毒性腹泻病的临床诊治。 展开更多
关键词 牛病毒性腹泻病毒 环介导等温扩增技术 快速检测 临床诊治 应用
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青海海北地区牦牛病毒性腹泻病毒流行病学调查及5′-UTR遗传进化分析 被引量：2
13
作者 林伟山 马豆豆 +6 位作者 雷萌桐 魏斌 李国才 王光华 王戈平 简莹娜 李秀萍 《中国畜牧兽医》 北大核心 2025年第3期1241-1249,共9页
【目的】了解青海省海北地区牦牛群中牛病毒性腹泻病毒(Bovine viral diarrhea virus,BVDV)的流行情况及遗传学分子特征。【方法】对采集自青海海北地区的148份腹泻牦牛粪便样品提取病毒RNA并反转录合成cDNA,以其为模板扩增BVDV 5′-UT... 【目的】了解青海省海北地区牦牛群中牛病毒性腹泻病毒(Bovine viral diarrhea virus,BVDV)的流行情况及遗传学分子特征。【方法】对采集自青海海北地区的148份腹泻牦牛粪便样品提取病毒RNA并反转录合成cDNA,以其为模板扩增BVDV 5′-UTR保守区域,建立特异性检测牦牛BVDV的实时荧光定量PCR方法,并以该方法对青海海北地区牦牛养殖场BVDV感染情况进行检测。选取4份BVDV阳性样品,对BVDV 5′-UTR区域序列进行PCR扩增和测序,与NCBI中不同亚型BVDV以及同属病毒毒株进行相似性比对,并基于BVDV 5′-UTR区域进行遗传进化分析。【结果】本研究基于BVDV 5′-UTR成功建立实时荧光定量PCR检测方法,标准曲线相关系数(R^(2))为0.997,标准品浓度为2.69×10^(2)~2.69×10^(9)拷贝/μL时具有良好的线性关系,最小检出限为2.69×10^(2)拷贝/μL。重复性试验结果显示,变异系数均<1.7%,具有良好的重复性和稳定性。采用建立的实时荧光定量PCR方法对青海省海北地区门源县、祁连县、海晏县和湟源县的腹泻牦牛粪便样品进行检测,结果显示,BVDV阳性率分别为45.00%、36.00%、30.77%和29.00%。BVDV 5′-UTR序列比对结果显示,分离获得的4株牦牛源BVDV与伊朗、美国的BVDV-1a亚型毒株聚集在同一个独立分支,核苷酸序列相似性为76.6%~99.7%。【结论】本研究明确了BVDV-1a型是导致青海省海北地区牦牛腹泻的重要病原之一,为该地区牦牛养殖场及时、有效地采取防控措施提供了科学依据,同时丰富了当地BVDV的分子流行病学调查数据,为该地区牛病毒性腹泻病的防控及疫苗研发提供了理论基础。 展开更多
关键词 牦牛 牛病毒性腹泻病毒(BVDV) 流行病学 实时荧光定量PCR 遗传进化分析
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宁夏地区部分规模化牛场牛病毒性腹泻病毒分离鉴定
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作者 王雅诗 张祥胤 +5 位作者 张冯禧 舒金琪 王向阳 高娟 赵晓民 常玲玲 《动物医学进展》 北大核心 2025年第8期127-132,共6页
牛病毒性腹泻(Bovine viral diarrhea,BVD)是由牛病毒性腹泻病毒(Bovine viral diarrhea virus,BVDV)引起的一种传染病。为了解宁夏地区规模化牛场BVD的流行情况,2023年采集了宁夏地区53个牛场的血液及肛拭子样品共计963份,进行RT-PCR检... 牛病毒性腹泻(Bovine viral diarrhea,BVD)是由牛病毒性腹泻病毒(Bovine viral diarrhea virus,BVDV)引起的一种传染病。为了解宁夏地区规模化牛场BVD的流行情况,2023年采集了宁夏地区53个牛场的血液及肛拭子样品共计963份,进行RT-PCR检测,然后利用MDBK细胞对阳性样品分离纯化病毒。结果显示,宁夏地区BVDV的核酸阳性率为2.81%(27/963),牛场感染率为11.32%(6/53);5′UTR遗传进化分析结果显示主要有BVDV-1a、BVDV-1h、BVDV-1r和BVDV-1l共4种基因亚型。RT-PCR阳性样品经MDBK细胞盲传8代未出现细胞病变,荧光定量PCR测定病毒液Ct值,代入制定的BVDV标准曲线测得拷贝数为1.136×10^(6)copies/mL,间接免疫荧光呈BVDV E2蛋白抗原阳性。研究明确了宁夏地区牛场BVDV流行的主要基因亚型,并获得1株纯化的非细胞病变型BVDV-1a野毒株,为后续深入BVDV致病机制研究提供基础资料。 展开更多
关键词 牛病毒性腹泻病毒 分离 鉴定 规模化牛场
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赤羽病病毒、牛疱疹病毒1型和牛病毒性腹泻病毒多重RT-PCR检测方法的建立
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作者 张帆帆 韦家禛 +6 位作者 李杰茂 谭美芳 胡利珍 曾艳兵 龚小齐 杨群 徐俊 《福建农业学报》 CSCD 北大核心 2024年第11期1242-1247,共6页
【目的】旨在建立一种可同时检测赤羽病病毒(akabane virus,AKAV)、牛疱疹病毒1型(bovine herpesvirus1,BoHV-1)和牛病毒性腹泻病毒(bovine viral diarrhea virus,BVDV)的多重RT-PCR检测方法,为牛繁殖障碍类疫病鉴别诊断及防控奠定基础... 【目的】旨在建立一种可同时检测赤羽病病毒(akabane virus,AKAV)、牛疱疹病毒1型(bovine herpesvirus1,BoHV-1)和牛病毒性腹泻病毒(bovine viral diarrhea virus,BVDV)的多重RT-PCR检测方法,为牛繁殖障碍类疫病鉴别诊断及防控奠定基础。【方法】针对AKAV的S基因、BoHV-1的gH基因和BVDV的3'UTR保守区域设计3对引物,通过反应条件参数的优化,建立AKAV、BoHV-1和BVDV多重RT-PCR检测方法。【结果】特异性结果显示,该方法仅对AKAV、BoHV-1和BVDV阳性样品检测为阳性,对牛细小病毒(bovine parvovirus,BPV)、牛呼吸道合胞体病毒(bovine respiratory syncytial virus,BRSV)、牛副流感病毒3型(bovine parainfluenza virus 3,BPIV3)、口蹄疫病毒(foot-and-mouth disease virus,FMDV)、牛流行热病毒(bovine ephemeral fever rhabdovirus,BEFV)等阳性样品检测为阴性。敏感性结果显示,该方法对AKAV、BoHV-1和BVDV重组质粒的下限阈值均为1.0×10^(3)拷贝·μL^(-1)。重复性结果显示,批内、批间重复性均较好。利用建立的方法对143份患繁殖障碍的牛全血/组织样品进行测定,并与现有的地方标准进行对比,验证本检测方法的实际临床应用效能。结果显示,AKAV、BoHV-1和BVDV的阳性率分别为2.80%(4/143)、21.68%(31/143)、38.46%(55/143),存在混合感染现象,与AKAV、BoHV-1和BVDV地方标准检测方法的符合率为99.3%、98.6%和97.2%,Kappa系数分别为0.885、0.960和0.942,表明本研究建立的方法与地方标准检测结果一致性良好。【结论】本研究开创性建立了一种特异性强、灵敏度高和成本低的多重RT-PCR检测方法,适用于AKAV、BoHV-1和BVDV的鉴别检测。 展开更多
关键词 赤羽病病毒 牛疱疹病毒1型 牛病毒性腹泻病毒 多重RT-PCR 繁殖障碍
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牛病毒性腹泻病毒单克隆抗体的制备及捕获ELISA检测方法的建立
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作者 宋京格 周佳莹 +5 位作者 夏欣悦 王孟孟 李园 宋厚辉 徐义刚 王静 《中国预防兽医学报》 北大核心 2025年第5期473-479,共7页
为建立牛病毒性腹泻病毒(BVDV)的检测方法,本研究采用纯化的BVDV作为抗原免疫BALB/c小鼠,通过杂交瘤技术筛选获得一株稳定分泌单克隆抗体(MAb)的杂交瘤细胞株5C7,采用抗体分型试剂盒鉴定其亚类为IgG2α,经IFA鉴定显示MAb 5C7能够特异性... 为建立牛病毒性腹泻病毒(BVDV)的检测方法,本研究采用纯化的BVDV作为抗原免疫BALB/c小鼠,通过杂交瘤技术筛选获得一株稳定分泌单克隆抗体(MAb)的杂交瘤细胞株5C7,采用抗体分型试剂盒鉴定其亚类为IgG2α,经IFA鉴定显示MAb 5C7能够特异性识别BVDV,利用间接ELISA测定其抗体效价为1:10^(6)。利用该BVDV特异性MAb作为检测抗体,兔源BVDV E2蛋白多克隆抗体(PAb)作为捕获抗体,经各反应条件的优化,建立了检测BVDV的抗原捕获ELISA(AC-ELISA)方法。采用该方法分别检测BVDV、牛传染性鼻气管炎病毒、牛细小病毒、牛轮状病毒、牛呼吸道合胞体病毒和牛副流感病毒3型等病毒,分析该方法的特异性;将10^(6.7)TCID_(50)的BVDV 10倍倍比稀释(10^(0)~10^(6)倍)稀释后,采用建立的AC-ELISA检测,评估该方法的敏感性;利用同一批次和不同批次E2蛋白PAb包被的酶标板,采用建立的AC-ELISA方法检测BVDV阳性及阴性样品,评估该方法的重复性。结果显示,该方法仅能检测到BVDV,与其余病毒均无交叉反应;对病毒BVDV的检测限为10~2TCID_(50);批内、批间重复性试验的变异系数均小于5%。利用该方法对618份牛血清和352份腹泻犊牛粪便样品检测,结果显示两种样品的阳性检出率分别为25.7%(159/618)和38.9%(137/352),与RT-PCR方法检测结果的符合率均达100%。此外,RT-PCR分析显示,阳性样品中BVDV-1的检出率为29.6%,为主要流行基因型,BVDV-2的检出率为0.9%。本研究建立的AC-ELISA方法具有良好的特异性、敏感性和重复性,可有效用于BVDV的检测,为BVDV的流行病学调查提供了技术支撑。 展开更多
关键词 牛病毒性腹泻病毒 抗原捕获ELISA E2蛋白 单克隆抗体
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牛病毒性腹泻病毒TaqMan荧光定量PCR检测方法的建立
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作者 王亚新 陈萌萌 +4 位作者 王露 李欣 赵洪哲 温永俊 王凤雪 《中国动物传染病学报》 北大核心 2025年第4期131-138,共8页
为建立一种针对牛病毒性腹泻病毒的检测方法,本研究针对牛病毒性腹泻病毒的5'UTR设计特异性引物及TaqMan探针,进行扩增,进而构建阳性重组质粒。经过条件优化建立了牛病毒性腹泻病毒的TaqMan荧光定量PCR检测方法。结果显示:建立的实... 为建立一种针对牛病毒性腹泻病毒的检测方法,本研究针对牛病毒性腹泻病毒的5'UTR设计特异性引物及TaqMan探针,进行扩增,进而构建阳性重组质粒。经过条件优化建立了牛病毒性腹泻病毒的TaqMan荧光定量PCR检测方法。结果显示:建立的实时荧光定量PCR检测方法在阳性标准质粒拷贝数在1×10^(4)~1×10^(8)拷贝/μL时,线性关系良好,线性相关系数R2=0.998;该方法最低检测限为10拷贝/μL;可以特异性检测牛病毒性腹泻病毒(BVDV),与牛冠状病毒(BCV)、牛轮状病毒(BRV)、牛副流感病毒3型(BPIV-3),以及牛呼吸道合胞体病毒(BRSV)不发生交叉反应,病毒滴度与拷贝数线性关系良好,线性相关系数R2=0.997;与商品化检测试剂盒的符合率为97.5%。该方法为牛病毒性腹泻病毒的早期快速诊断提供了有力的技术支持。 展开更多
关键词 牛病毒性腹泻病毒 TaqMan荧光定量PCR 5'UTR
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牛病毒性腹泻病毒研究进展
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作者 高进东 匡磊 +6 位作者 刘诗汝 张恬钰 高翎珈 尹金花 张梦迪 吴兴 胡长敏 《现代畜牧科技》 2025年第7期118-121,共4页
牛病毒性腹泻病毒(BVDV)是对牛养殖业危害严重的病毒之一。该文从病毒学特征、流行病学、发病机制、诊断方法、治疗与防控以及最新研究成果等多方面对BVDV进行全面综述,旨在深入阐述该病毒的研究现状,为相关领域的科研人员、兽医从业者... 牛病毒性腹泻病毒(BVDV)是对牛养殖业危害严重的病毒之一。该文从病毒学特征、流行病学、发病机制、诊断方法、治疗与防控以及最新研究成果等多方面对BVDV进行全面综述,旨在深入阐述该病毒的研究现状,为相关领域的科研人员、兽医从业者以及养殖者提供系统的知识参考,以促进对牛病毒性腹泻的深入研究、有效诊断、科学防控以及新型治疗措施的开发。 展开更多
关键词 牛病毒性腹泻病毒 诊断 治疗 防控
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牛病毒性腹泻病毒和牛肠道病毒二重PCR检测方法的建立及病原学分析
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作者 闫志浩 杨柳菲 +4 位作者 曹馨月 杨钦 李世玲 杨梦晗 陈红英 《养殖与饲料》 2025年第10期52-56,共5页
[目的]为牛病毒性腹泻病毒(BVDV)和牛肠道病毒(BEV)的早期诊断及防控提供技术支持。[方法]在靶向BVDV和BEV 5’-UTR保守区,各设计1对特异性引物,建立1种能同时检测BVDV和BEV的二重PCR方法,运用该方法对2024-2025年采自河南、四川以及河... [目的]为牛病毒性腹泻病毒(BVDV)和牛肠道病毒(BEV)的早期诊断及防控提供技术支持。[方法]在靶向BVDV和BEV 5’-UTR保守区,各设计1对特异性引物,建立1种能同时检测BVDV和BEV的二重PCR方法,运用该方法对2024-2025年采自河南、四川以及河北等地牛场患腹泻牛的50份粪便样品进行检测并进行遗传进化分析,评估该方法的特异性和灵敏度。[结果]该方法能同时扩增BVDV的223 bp和BEV的96 bp,而对其他的常见牛病原核酸扩增均为阴性。BVDV和BEV的最低检测值分别为815 copies/μL和783 copies/μL。在50份粪便样品中,BVDV和BEV的检出率分别为68%、42%,二者混合感染率为24%。测序获得12株BVDV和12株BEV的5′-UTR序列。遗传分析显示,获得的12株BVDV均属于BVDV-1m亚型。12株BEV中,有10株属于BEV-F种,余下2株属于BEV-E种。[结论]成功建立1种BVDV和BEV二重PCR检测方法,且我国部分省份牛场中主要流行的是BVDV-1m亚型和BEF-F种。 展开更多
关键词 牛病毒性腹泻病毒 牛肠道病毒 二重PCR 遗传进化
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牛病毒性腹泻的诊断与治疗 被引量：1
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作者 巴桑 《今日畜牧兽医》 2025年第4期95-97,共3页
牛病毒性腹泻是由牛病毒性腹泻病毒引起的一种对家畜健康和生产性能产生严重影响的传染病。该病毒具有极强的传染性,并且流行病学特征复杂多变,其病因涉及多种因素。牛病毒性腹泻病毒对宿主的免疫系统具有抑制作用,感染该病毒的牛表现... 牛病毒性腹泻是由牛病毒性腹泻病毒引起的一种对家畜健康和生产性能产生严重影响的传染病。该病毒具有极强的传染性,并且流行病学特征复杂多变,其病因涉及多种因素。牛病毒性腹泻病毒对宿主的免疫系统具有抑制作用,感染该病毒的牛表现为腹泻、发热等症状,严重时甚至导致死亡。本文详细阐述了牛病毒性腹泻的病因学、流行病学特征、病理生理机制、诊断方法以及有效的治疗措施,旨在为有效遏制该病的传播、提升牛群健康水平提供科学依据。 展开更多
关键词 牛病毒性腹泻病毒 诊断方法 防治措施
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