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牛干扰素-γ基因的克隆、序列分析及表达研究 被引量：1
1
作者 杨洁 张书光 +5 位作者 李长青 刘世高 柴俊 刘旭川 史宪伟 张以芳 《中国畜牧兽医》 CAS 北大核心 2014年第10期1-6,共6页
为了使干扰素-γ(interferonγ,IFN-γ)在牛结核等疾病的诊断和防制方面取得更有效的应用,试验采用RT-PCR法从云南本地黄牛外周血淋巴细胞总RNA中扩增牛IFN-γ(BoIFN-γ)基因,测序并进行序列分析;然后亚克隆至pET-28a,转化大肠杆菌BL21(... 为了使干扰素-γ(interferonγ,IFN-γ)在牛结核等疾病的诊断和防制方面取得更有效的应用,试验采用RT-PCR法从云南本地黄牛外周血淋巴细胞总RNA中扩增牛IFN-γ(BoIFN-γ)基因,测序并进行序列分析;然后亚克隆至pET-28a,转化大肠杆菌BL21(DE3),用IPTG诱导表达。序列分析结果表明,克隆的IFN-γ基因与GenBank中荷斯坦牛IFN-γ序列同源性达99.60%。表达产物经SDS-PAGE分析,在大小约23ku处可见目的蛋白表达条带,与预期结果一致;用ELISA检测,表达的蛋白具有明显的生物学活性,在菌体中的含量为244ng/mL。本试验结果为牛IFN-γ蛋白的进一步研究和应用奠定了基础。 展开更多
关键词 牛干扰素-γ 序列分析 原核表达 生物学活性
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重组牛γ-干扰素单克隆抗体的研制 被引量：15
2
作者 张成全 陈祥 +6 位作者 牛中伟 杨卫冲 徐正中 孟闯 潘志明 黄金林 焦新安 《中国动物传染病学报》 CAS 2009年第4期15-19,共5页
为制备针对重组牛γ-干扰素(rBoIFN-γ)的单克隆抗体(mAb),以纯化的原核表达融合蛋白rHis-BoIFN-γ为免疫原,用纯化的rGST-BoIFN-γ为筛选抗原,应用淋巴细胞杂交瘤技术,研制抗rBoIFN-γ的mAb。结果获得13株稳定分泌抗BoIFN-γmAb的细胞... 为制备针对重组牛γ-干扰素(rBoIFN-γ)的单克隆抗体(mAb),以纯化的原核表达融合蛋白rHis-BoIFN-γ为免疫原,用纯化的rGST-BoIFN-γ为筛选抗原,应用淋巴细胞杂交瘤技术,研制抗rBoIFN-γ的mAb。结果获得13株稳定分泌抗BoIFN-γmAb的细胞株,命名为1C12、1F7、1G5、3E6、4D5、5E11、5G4、6F8、6G6、7E9、8D3、8F8和9G11。腹水的效价除单抗9G11外,其余效价都在1∶80 000以上;除5G4mAb亚类为IgG2b外,其余均为IgG1。Dot-ELISA结果表明,所得单抗只与融合蛋白rHis-BoIFN-γ和rGST-BoIFN-γ反应,而不与其它重组细胞因子和对照细菌反应,显示其良好的特异性。Western blot显示所获单抗能与相应的融合蛋白发生反应,出现特异性条带。同时所获单抗均能与牛IFN-γ标准品反应。13株单抗均为针对rBoIFN-γ的特异性mAb,为进一步研究rBoIFN-γmAb在牛的免疫调控、牛疫病的致病机制及其诊断中的应用奠定基础。 展开更多
关键词 重组牛γ-干扰素 原核表达 单克隆抗体
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牛γ-干扰素单克隆抗体的制备及ELISA检测方法的建立 被引量：3
3
作者 李超 林祥梅 +2 位作者 梅琳 李全芬 韩雪清 《中国畜牧兽医》 CAS 北大核心 2011年第1期72-76,共5页
建立牛结核病的γ-干扰素(BovIFN-γ)免疫学检测方法。本研究利用rBovIFN-γ抗原免疫Balb/c小鼠,经5次免疫后,通过淋巴细胞杂交瘤技术及间接ELISA筛选制备抗BovIFN-γ的单克隆抗体,在McAb及多克隆抗体的基础上建立双抗体夹心ELISA,并进... 建立牛结核病的γ-干扰素(BovIFN-γ)免疫学检测方法。本研究利用rBovIFN-γ抗原免疫Balb/c小鼠,经5次免疫后,通过淋巴细胞杂交瘤技术及间接ELISA筛选制备抗BovIFN-γ的单克隆抗体,在McAb及多克隆抗体的基础上建立双抗体夹心ELISA,并进一步优化ELISA反应条件。结果表明,获得一株能稳定分泌抗BovIFN-γMcAb的杂交瘤细胞株A12E9,分泌单克隆抗体腹水效价为1∶107,属于IgG1亚类,具有良好的特异性;所建立的双抗体夹心ELISA方法,BovIFN-γ最低检测限为40 ng/mL,与其他蛋白不发生交叉反应,表现出良好的特异性。该方法为建立牛结核病的γ-干扰素诊断方法奠定了基础。 展开更多
关键词 牛γ-干扰素 单克隆抗体 双抗体夹心ELISA
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夹心ELISA检测牛γ-干扰素方法的建立及应用 被引量：2
4
作者 钱琨 赵巍 +2 位作者 黄大卢 邵红霞 秦爱建 《中国动物传染病学报》 CAS 北大核心 2016年第5期57-62,共6页
为建立检测牛γ-干扰素(Bo IFN-γ)的双夹心ELISA方法,将前期获得的针对Bo IFN-γ的单克隆抗体作为捕捉抗体进行夹心ELISA检测天然Bo IFN-γ,结果表明单克隆抗体Bo IFN-γ-6E5、Bo IFN-γ-3E1、Bo IFN-γ-3C2三株能捕捉到天然的牛γ干... 为建立检测牛γ-干扰素(Bo IFN-γ)的双夹心ELISA方法,将前期获得的针对Bo IFN-γ的单克隆抗体作为捕捉抗体进行夹心ELISA检测天然Bo IFN-γ,结果表明单克隆抗体Bo IFN-γ-6E5、Bo IFN-γ-3E1、Bo IFN-γ-3C2三株能捕捉到天然的牛γ干扰素。经过条件摸索和优化,最终建立了以3E1/HRP-6E5为最佳组合的检测Bo IFN-γ的夹心ELISA方法。用建立的双夹心ELISA检测方法和进口试剂盒同时对66份血样进行检测,结果表明双夹心ELISA方法和进口试剂盒检测结果的符合率达95.45%,说明该方法能有效地对牛结核病γ-干扰素进行检测。 展开更多
关键词 牛γ-干扰素 双夹心ELISA 应用
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悬浮培养Sf21细胞高效表达牛γ-干扰素及其特性鉴定 被引量：2
5
作者 王海春 贾红 +4 位作者 袁维峰 侯绍华 郭晓宇 鑫婷 朱鸿飞 《中国畜牧兽医》 CAS 北大核心 2012年第11期1-6,共6页
本试验旨在研究重组牛γ-干扰素(rBovIFN-γ)在Sf21细胞中高效表达及其特性鉴定。利用逆转录—聚合酶链式反应(RT-PCR)技术从奶牛外周血淋巴细胞的总RNA中扩增出不含信号肽的BovIFN-γ基因片段。将其克隆到pFast-BacTMHTA中构建重组质粒... 本试验旨在研究重组牛γ-干扰素(rBovIFN-γ)在Sf21细胞中高效表达及其特性鉴定。利用逆转录—聚合酶链式反应(RT-PCR)技术从奶牛外周血淋巴细胞的总RNA中扩增出不含信号肽的BovIFN-γ基因片段。将其克隆到pFast-BacTMHTA中构建重组质粒pFastBacTMHTA-BovIFN-γ。然后将重组质粒转化至DH10Bac感受态细胞获得重组穿梭质粒rBacmid-BovIFN-γ。转染Sf21昆虫细胞后获得重组杆状病毒rBac-BovIFN-γ,应用Sf21细胞悬浮培养技术大量表达rBov-IFN-γ。利用Western blotting、质谱分析(MS)、抗病毒试验等对rBovIFN-γ进行鉴定。Western blotting分析显示,rBovIFN-γ具有良好的反应原性;MS分析表明,rBovIFN-γ的6个肽段序列与牛IFN-γ的氨基酸序列完全匹配,在蛋白质质谱数据库中搜索结果为牛IFN-γ;MDBK/VSV抗病毒试验显示,rBovIFN-γ具有很高的抗病毒活性,为1.05×105 IU/mg。 展开更多
关键词 牛γ-干扰素 杆状病毒 悬浮培养 质谱分析 抗病毒活性
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谷氨酸棒杆菌增强型表达载体构建及牛α-干扰素表达 被引量：2
6
作者 孙曼曼 高雄 +4 位作者 方求武 严豪 刘秀霞 杨艳坤 白仲虎 《生物学杂志》 CAS CSCD 北大核心 2020年第3期16-20,共5页
谷氨酸棒杆菌是一种传统的食品级工业微生物,近年来正逐渐被开发成为一种新型的无内毒素重组蛋白表达宿主。为提高其外源蛋白的表达能力,将内源双顺反子元件引入到穿梭载体pXMJ19的多克隆位点之前,得到含有增强型Ptac启动子的谷氨酸棒... 谷氨酸棒杆菌是一种传统的食品级工业微生物,近年来正逐渐被开发成为一种新型的无内毒素重组蛋白表达宿主。为提高其外源蛋白的表达能力,将内源双顺反子元件引入到穿梭载体pXMJ19的多克隆位点之前,得到含有增强型Ptac启动子的谷氨酸棒杆菌表达载体pSM19,该载体以EGFP作为报告基因,相比出发载体表达量提高了99.5%。将密码子优化的,带有组氨酸标签的牛α-干扰素成熟蛋白编码基因合成并克隆到pSM19载体中,转化谷氨酸棒杆菌表达菌株Corynebacterium glutamicum CGMCC1.15647中进行诱导表达。培养温度为30℃时,重组牛α-干扰素蛋白大部分以包涵体形式存在,而16℃培养时的蛋白可溶性有较大改善。在5 L发酵罐中进行放大培养,得到大量表达重组牛α-干扰素的菌体,并用镍柱进行了简单纯化,产量预估为68 mg/L菌液。利用MDBK-VSV系统对重组牛α-干扰素进行生物学活性测定,其抗病毒效价为(1.35±0.23)×106 U/mg。 展开更多
关键词 谷氨酸棒杆菌 启动子 蛋白表达 牛α-干扰素
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牛γ-干扰素EIA与TST检测牛结核病的比较 被引量：4
7
作者 朱冬冬 孙泉云 +4 位作者 曹传闺 陈建生 许光明 李凯航 薛霞 《上海畜牧兽医通讯》 2011年第2期14-15,共2页
采用牛γ-干扰素EIA(酶免疫分析)与结核菌素皮内试验(TST)两种方法对某奶牛场中182头奶牛进行牛结核病的检测,并对牛γ-干扰素EIA与TST两种检测方法进行比较。结果:TST检出阳性123份、可疑20份、阴性39份,牛γ-干扰素EIA检出阳性58份、... 采用牛γ-干扰素EIA(酶免疫分析)与结核菌素皮内试验(TST)两种方法对某奶牛场中182头奶牛进行牛结核病的检测,并对牛γ-干扰素EIA与TST两种检测方法进行比较。结果:TST检出阳性123份、可疑20份、阴性39份,牛γ-干扰素EIA检出阳性58份、阴性124份,TST的阳性率大于牛γ-干扰素EIA,EIA与TST相比,敏感性为30.30%、特异性为82.05%、符合率为39.56%。 展开更多
关键词 牛γ-干扰素EIA TST 牛结核病 检测
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牛干扰素诱导蛋白-10单克隆抗体的制备及其流式检测方法的建立 被引量：2
8
作者 徐正中 沈轩云 +3 位作者 朱兆成 夏爱鸿 陈祥 焦新安 《中国预防兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2021年第9期959-964,共6页
为制备针对牛干扰素诱导蛋白-10(BoIP-10)的高亲和力单克隆抗体(MAb),并建立基于胞内染色技术的BoIP-10流式检测方法,本研究以纯化的原核表达融合蛋白rHis-BoIP-10为免疫原,使用纯化的rGST-BoIP-10为筛选抗原,利用淋巴细胞杂交瘤技术制... 为制备针对牛干扰素诱导蛋白-10(BoIP-10)的高亲和力单克隆抗体(MAb),并建立基于胞内染色技术的BoIP-10流式检测方法,本研究以纯化的原核表达融合蛋白rHis-BoIP-10为免疫原,使用纯化的rGST-BoIP-10为筛选抗原,利用淋巴细胞杂交瘤技术制备并筛选针对BoIP-10的MAb,结果显示,筛选获得8株稳定分泌BoIP-10 MAb的细胞株,分别为3E11、2A5、1C6、3B12、3E12、2D5、2H8和3A12;通过间接ELISA鉴定MAbs与真核BoIP-10的反应性,结果显示2A5、2D5、2H8等3株MAb与毕赤酵母表达的BoIP-10有较好的反应性;进一步采用阻断ELISA方法评价MAbs是否结合血浆中的天然BoIP-10,结果表明MAb 2D5可以识别血浆中的天然BoIP-10。将MAbs进行荧光标记后建立BoIP-10流式检测方法,结果显示建立的BoIP-10流式检测方法最佳刺激剂为ConA,最优刺激浓度为20μg/mL,最佳MAb株为2D5,MAb的最优使用浓度为4μg/mL。采用该BoIP-10流式方法检测BCG诱导牛外周血单核细胞Bo IP-10的表达水平,结果显示BCG体外感染牛外周血单核细胞12 h时表达较高水平的Bo IP-10。本研究制备并筛选出针对天然Bo IP-10的特异性MAb 2D5,基于此建立的流式检测方法为进一步研究Bo IP-10在牛机体免疫应答评价、牛结核病等传染性动物疫病诊断中的应用提供新的技术手段。 展开更多
关键词 牛干扰素诱导蛋白-10 单克隆抗体 流式检测方法
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重组牛γ-干扰素对牛外周血淋巴细胞分裂抑制作用
9
作者 刘雪红 韩凤丽 +3 位作者 李娟 董紫凌 宋平 李明峰 《饲料研究》 CAS 2007年第7期33-35,共3页
观察重组牛γ-干扰素对牛外周血淋巴细胞的作用。无菌采取牛外周血,分离培养淋巴细胞,取第一代细胞,分为试验组和对照组。试验组加入不同浓度的重组牛γ-干扰素,作用5d,观察细胞数量及细胞凋亡效应。结果为试验组淋巴细胞数目下降,细胞... 观察重组牛γ-干扰素对牛外周血淋巴细胞的作用。无菌采取牛外周血,分离培养淋巴细胞,取第一代细胞,分为试验组和对照组。试验组加入不同浓度的重组牛γ-干扰素,作用5d,观察细胞数量及细胞凋亡效应。结果为试验组淋巴细胞数目下降,细胞凋亡效应减弱。试验结果表明,重组牛γ-干扰素对牛外周血淋巴细胞具有抑制分裂及抗凋亡的作用。 展开更多
关键词 牛γ-干扰素 淋巴细胞 细胞分裂 细胞凋亡
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不同监测方法在奶牛结核病检疫中的应用 被引量：4
10
作者 石琴 袁立岗 +5 位作者 蒲敬伟 李静 徐晶晶 梁俊明 沙丽 柳炜 《中国奶牛》 2017年第1期33-35,共3页
为了解牛型提纯结核菌素PPD皮内变态反应试验和牛结核γ-干扰素ELISA试验的相关性,对规模牛场先进行牛型PPD皮内变态反应试验,采集检疫阳性牛和部分阴性牛抗凝血进行牛结核γ-干扰素ELISA试验,通过试验结果找出两者之间的相关性,研究牛... 为了解牛型提纯结核菌素PPD皮内变态反应试验和牛结核γ-干扰素ELISA试验的相关性,对规模牛场先进行牛型PPD皮内变态反应试验,采集检疫阳性牛和部分阴性牛抗凝血进行牛结核γ-干扰素ELISA试验,通过试验结果找出两者之间的相关性,研究牛结核γ-干扰素ELISA试验在牛结核病检疫中的可行性。 展开更多
关键词 奶牛 结核病 PPD皮内变态反应试验 牛结核γ-干扰素ELISA试验
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