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利用CRISPR/Cas9技术制备BLG基因敲除牛乳腺上皮细胞系
1
作者 丁修虎 林志平 +8 位作者 赵芳 陈坤琳 仲跻峰 张燕 高运东 李惠侠 王慧利 张建丽 丁强 《畜牧兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2024年第10期4475-4488,共14页
旨在利用CRISPR/Cas9系统构建BLG基因敲除牛乳腺上皮细胞系(bovine mammary epithelial cells,bMECs),同时检测BLG基因敲除后对细胞的影响。本研究利用体外切割试验筛选获得靶向牛的BLG基因的第一外显子序列的3条sgRNA,与CRISPR/Cas9表... 旨在利用CRISPR/Cas9系统构建BLG基因敲除牛乳腺上皮细胞系(bovine mammary epithelial cells,bMECs),同时检测BLG基因敲除后对细胞的影响。本研究利用体外切割试验筛选获得靶向牛的BLG基因的第一外显子序列的3条sgRNA,与CRISPR/Cas9表达载体电转染入bMECs,利用浓度为1.8μg·mL^(-1)嘌呤霉素和6μg·mL^(-1)稻瘟菌素双药筛和PCR分析鉴定获得BLG基因编辑的单克隆细胞株;利用Western blot(WB)验证细胞BLG表达;绘制生长曲线和CCK-8试验检测BLG基因敲除对bMECs细胞增殖的影响;同时根据sgRNA序列,对基因组上潜在脱靶位点进行PCR测序分析。经筛选和PCR序列分析,共筛选获得了9株BLG基因编辑细胞株,其编辑效率为90%(9/10),其中4株细胞株BLG基因大片段删除。序列分析结果显示,单克隆细胞株编辑位点呈现片段插入缺失和碱基替换等多种编辑类型,WB结果显示敲除细胞株BLG蛋白表达显著降低,且细胞生长曲线和CCK-8检测结果表明BLG基因敲除的细胞生长速度加快。本研究利用CRISPR/Cas9技术成果构建了牛乳腺上皮细胞BLG基因高效敲除方法,BLG基因敲除后可显著影响牛乳腺上皮细胞的增殖,为探究BLG敲除牛在乳腺上皮细胞水平探究其功能机制提供细胞模型。 展开更多
关键词 BLG基因 牛乳腺上皮细胞系 CRISPR/Cas9 基因编辑
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丁酸钠通过AMPK通路调控LPS造成牛乳腺上皮细胞脂代谢紊乱的作用机制 被引量：4
2
作者 李林 曹萌 +3 位作者 宫彬彬 赵梅 王婕 张晓辉 《畜牧兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2022年第9期3221-3230,共10页
通过向脂多糖(LPS)诱导牛乳腺上皮细胞系(MAC-T)脂代谢紊乱模型中添加不同浓度(2、8、16μmol·L^(-1))的丁酸钠,探讨其对细胞脂代谢的调控机理及炎症损伤的修复作用。分别用1 000 ng·mLLPS刺激MAC-T细胞9 h后,检测细胞脂滴面... 通过向脂多糖(LPS)诱导牛乳腺上皮细胞系(MAC-T)脂代谢紊乱模型中添加不同浓度(2、8、16μmol·L^(-1))的丁酸钠,探讨其对细胞脂代谢的调控机理及炎症损伤的修复作用。分别用1 000 ng·mLLPS刺激MAC-T细胞9 h后,检测细胞脂滴面积及三酰甘油(TG)含量;用不同浓度的丁酸钠刺激MAC-T细胞12 h后,流式细胞术检测细胞凋亡率;试验共分为5组:对照组、LPS处理组、2μmol·L^(-1)丁酸钠+LPS处理组、8μmol·L^(-1)丁酸钠+LPS处理组和16μmol·L^(-1)丁酸钠+LPS处理组,分别对细胞TG含量、AMPK信号通路蛋白、脂代谢关键基因以及相关炎症因子进行检测。结果显示:LPS会造成MAC-T细胞总脂滴面积显著下降(P<0.05),TG含量极显著下降(P<0.01);不同浓度的丁酸钠对MAC-T细胞凋亡率没有影响;与对照组相比,LPS处理组TG含量极显著下降(P<0.01)、P-AMPK表达水平显著上升(P<0.05)、脂合成代谢相关基因ACC、SCD-1以及FAS mRNA表达水平均显著(P<0.05)或极显著(P<0.01)下降、脂分解代谢相关基因CPT-1、CPT-2以及ACO mRNA表达水平均显著上升(P<0.05)、炎症因子TNF-α和IL-6含量显著上升(P<0.05);与LPS处理组相比,(2、8、16μmol·L^(-1))丁酸钠+LPS处理组TG含量有一定程度上升,P-AMPK表达水平下降,脂合成代谢相关基因表达水平上升,脂分解代谢相关基因表达水平有一定程度下降,炎症因子TNF-α和IL-6含量下降。本研究表明丁酸钠会通过AMPK通路激活脂合成代谢,调控TG的合成,并且对MAC-T细胞的炎症损伤具有一定的缓解作用。 展开更多
关键词 脂多糖 丁酸钠 牛乳腺上皮细胞系(mac-t) 脂代谢紊乱
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血管紧张素转化酶2对Ang Ⅱ诱导的牛乳腺上皮细胞炎症损伤的缓解作用 被引量：1
3
作者 朱斌 刘小倩 +2 位作者 刘颖 纪晓霞 张源淑 《畜牧兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2019年第7期1458-1465,共8页
以不同浓度血管紧张素Ⅱ(AngⅡ)诱导牛乳腺上皮细胞(MAC-T)炎症损伤,探讨血管紧张素转化酶2(ACE 2)的变化及与AngⅡ的相互作用。研究包括:ELISA检测细胞上清中细胞炎性因子的分泌或释放;Western blot检测细胞ACE 2和ACE的蛋白表达变化,... 以不同浓度血管紧张素Ⅱ(AngⅡ)诱导牛乳腺上皮细胞(MAC-T)炎症损伤,探讨血管紧张素转化酶2(ACE 2)的变化及与AngⅡ的相互作用。研究包括:ELISA检测细胞上清中细胞炎性因子的分泌或释放;Western blot检测细胞ACE 2和ACE的蛋白表达变化,并进行相关性分析;添加ACE 2活性蛋白对AngⅡ诱导损伤的保护作用。结果显示:1)AngⅡ处理MAC-T,细胞上清中促炎因子TNF-α、IL-6、IL-8含量显著(P<0.05)或极显著(P<0.01)增加,抗炎因子IL-10含量显著降低(P<0.05);2)不同浓度AngⅡ处理细胞后,ACE 2蛋白表达均有降低,10-6 mol·L^-1 AngⅡ处理后显著降低(P<0.05);ACE蛋白表达结果相反;ACE 2与AngⅡ浓度之间存在显著负相关;3)添加外源性ACE 2活性蛋白,细胞上清中TNF-α、IL-6和IL-8浓度均有一定程度的下降,IL-10浓度升高。本研究表明ACE 2/ACE轴的失衡是AngⅡ诱导细胞炎性损伤的主要原因。高水平AngⅡ可激活炎症因子促进炎症反应,是促进炎症反应的主要介质,ACE 2可以通过降解AngⅡ,抑制其对炎症反应的上调效应。 展开更多
关键词 血管紧张素转化酶2(ACE 2) 血管紧张素Ⅱ(AngⅡ) 牛乳腺上皮细胞(mac-t) 炎性反应
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