姜黄素影响铁死亡途径缓解LPS诱导牛乳腺上皮细胞炎性反应的分析

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作者 杨文哲 王锦浩 +7 位作者 赵子琛 赵彤 潘飞龙 陈芳芳 邵雯琪 刘克祥 赵树臣 赵立佳 《畜牧兽医学报》 北大核心 2025年第9期4730-4740,共11页

本研究旨在从铁死亡途径探究姜黄素(curcumin,Cur)对脂多糖(LPS)诱导的牛乳腺上皮细胞(MAC-T)炎性反应的影响。将处于对数生长期的MAC-T细胞按照试验要求随机分组并进行相应的处理,每组3个重复。采用MTT法测定不同浓度的LPS/Cur对MAC-T... 本研究旨在从铁死亡途径探究姜黄素(curcumin,Cur)对脂多糖(LPS)诱导的牛乳腺上皮细胞(MAC-T)炎性反应的影响。将处于对数生长期的MAC-T细胞按照试验要求随机分组并进行相应的处理,每组3个重复。采用MTT法测定不同浓度的LPS/Cur对MAC-T细胞存活率的影响;RT-PCR法检测炎症相关基因(TNF-α、IL-6、IL-1β、iNOS、CXCL2、CCL2)与铁死亡相关基因(PTGS2、SLC7A11、GPX4、FTH1、ACSL4)的转录水平;BODIPY 581/591 C11染色检测细胞脂质过氧化水平;试剂盒检测细胞中MDA含量、LPO浓度、GSH含量、GSH/GSSG比值;Ferro-Orange染色和Fe2+检测试剂盒测定细胞中Fe2+含量;ELISA试剂盒检测细胞中TNF-α、IL-6、IL-1β浓度;Western blot检测GPX4、ACSL4、TNF-α、IL-6、IL-1β蛋白的相对表达水平。结果显示,与CON组相比,10μg·mL^(-1)LPS或20μmol·L^(-1)Cur处理对MAC-T细胞存活率无显著影响。LPS处理后细胞中促炎相关基因(TNF-α、IL-6、IL-1β、iNOS、CXCL2、CCL2)、促铁死亡相关基因(PTGS2、ACSL4)以及相关蛋白(ACSL4)的表达水平极显著升高(P<0.01);抗铁死亡相关基因(SLC7A11、GPX4、FTH1)和蛋白(GPX4)的表达水平极显著下降(P<0.01);MDA含量和LPO浓度均极显著升高(P<0.01);GSH含量和GSH/GSSG比值均极显著下降(P<0.01);Fe2+含量极显著升高(P<0.01);TNF-α、IL-6、IL-1β的浓度和蛋白的表达水平均极显著升高(P<0.01)。与LPS单独处理组相比,LPS与Cur-H共处理组促炎相关基因、促铁死亡相关基因以及相关蛋白的表达水平极显著下降(P<0.01);抗铁死亡相关基因和蛋白的表达水平极显著升高(P<0.01);脂质过氧化水平、MDA含量和LPO浓度均极显著下降(P<0.01);GSH含量和GSH/GSSG比值均极显著升高(P<0.01);Fe^(2+)含量极显著下降(P<0.01);TNF-α、IL-6、IL-1β的浓度和蛋白的表达水平均极显著下降(P<0.01)。此外,铁死亡激活剂Erastin显著抑制了Cur对LPS诱导炎症的缓解作用。综上所述,Cur可通过抑制铁死亡缓解LPS诱导的MAC-T细胞炎性反应。 展开更多

关键词 铁死亡 姜黄素 脂多糖 牛乳腺上皮细胞(mac-t)

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基于CRISPR/Cas9技术的牛乳腺上皮细胞全基因组敲除文库的构建

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作者 高林娜 蒋影影 +6 位作者 王悦 史倩倩 安振江 王慧利 沈阳阳 陈坤琳 张乐颖 《畜牧兽医学报》 北大核心 2025年第6期2711-2723,共13页

旨在构建奶牛乳腺CRISPR/Cas9全基因组敲除细胞文库,用于筛选与奶牛泌乳、应激及疾病等相关的功能基因。本研究靶向牛全基因组蛋白编码基因,利用CRISPR/Cas9技术设计合成转录sgRNAs文库,克隆至慢病毒载体LentiCRISPR-V2,建立牛全基因组C... 旨在构建奶牛乳腺CRISPR/Cas9全基因组敲除细胞文库,用于筛选与奶牛泌乳、应激及疾病等相关的功能基因。本研究靶向牛全基因组蛋白编码基因,利用CRISPR/Cas9技术设计合成转录sgRNAs文库,克隆至慢病毒载体LentiCRISPR-V2,建立牛全基因组CRISPR/Cas9敲除质粒文库,并进行gEditing ScreeningTM文库测序验证;然后将敲除质粒文库进行慢病毒包装和滴度测定,感染牛乳腺上皮细胞(bovine mammary epithelial cells,bMECs)后经嘌呤霉素抗性筛选及RT-qPCR、Western blot技术确定最佳感染效果,最终通过高通量测序验证敲除细胞库中sgRNA覆盖率确定细胞文库质量。本研究构建的全基因组敲除质粒文库共靶向20545个蛋白编码基因,包含61237条sgRNA和3062条牛基因组上无靶点的sgRNA;gEditing ScreeningTM质粒文库测序结果显示,全基因组质粒文库覆盖率为100%,均一性为2.35,测序深度为577×;进一步对质粒文库进行慢病毒包装,获得滴度为7.01×10^(8) TU·mL^(-1)的病毒液并感染bMECs,嘌呤霉素筛选14 d得到MOI=0.2、0.3、0.4、0.5的稳转细胞株,RT-qPCR、Western blot结果表明,MOI=0.2时感染效果最佳;高通量测序结果显示,细胞文库覆盖率为78.74%,碱基稳定、序列质量较高。综上所述,牛全基因组质粒文库、全基因组敲除细胞文库符合质量标准和试验需求,能为挖掘调控牛泌乳性状及乳腺健康的关键基因研究提供重要的细胞筛选平台。 展开更多

关键词 牛 CRISPR/Cas9 全基因组 敲除质粒文库 牛乳腺上皮细胞 敲除细胞文库

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牛乳腺上皮细胞经牛异体移植炎症因子1处理诱导的生物学功能变化研究

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作者 周安骏 汪敏玟 赵燕英 《云南畜牧兽医》 2025年第4期8-11,共4页

乳腺上皮细胞是血乳屏障的重要组成部分,奶牛乳腺炎重要病理生理特征是乳腺损伤和血乳屏障的打开。在乳腺炎牛乳中,牛异体移植炎症因子1含量显著升高,而奶牛康复后,其水平回落。为研究牛异体移植炎症因子1对牛乳腺上皮细胞生物学功能的... 乳腺上皮细胞是血乳屏障的重要组成部分,奶牛乳腺炎重要病理生理特征是乳腺损伤和血乳屏障的打开。在乳腺炎牛乳中,牛异体移植炎症因子1含量显著升高,而奶牛康复后,其水平回落。为研究牛异体移植炎症因子1对牛乳腺上皮细胞生物学功能的影响,采用牛异体移植炎症因子1处理乳腺上皮细胞48 h后,检测牛乳腺上皮细胞活力、胞外乳酸脱氢酶酶活性、细胞凋亡比例、活性氧、ATP产生和线粒体膜孔复合物的打开及线粒体膜电位。结果显示,经牛异体移植炎症因子1处理后,损伤了牛乳腺上皮细胞的活力,增加了上皮细胞膜通透性,促进了细胞的坏死;同时刺激了细胞氧化应激,诱发了线粒体膜孔复合物的打开,造成线粒体膜去极化和ATP产生受阻,最终造成乳腺上皮细胞的凋亡。结果提示,牛异体移植炎症因子1损伤了乳腺上皮细胞,推测这种损伤可能是由于线粒体功能障碍而引发。 展开更多

关键词 牛乳腺上皮细胞 异体移植炎症因子1 细胞凋亡 线粒体功能障碍

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丁酸钠通过G蛋白偶联受体41介导蛋白激酶B/哺乳动物雷帕霉素靶蛋白信号通路刺激牛乳腺上皮细胞增殖 被引量：1

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作者 张静 卜丽君 +4 位作者 郎姣姣 刘亚鹏 夏呈强 霍文婕 刘强 《动物营养学报》 CAS CSCD 北大核心 2024年第3期1878-1891,共14页

本试验旨在研究丁酸钠(SB)刺激牛乳腺上皮细胞(BMECs)增殖的分子机制。采用单因素设计,以含不同浓度(0、15、30、45、60和75μmol/L)SB的DMEM/F12培养基(含10%新生胎牛血清)培养BMECs,通过细胞计数试剂盒(CCK⁃8)检测细胞活性,确定适宜S... 本试验旨在研究丁酸钠(SB)刺激牛乳腺上皮细胞(BMECs)增殖的分子机制。采用单因素设计,以含不同浓度(0、15、30、45、60和75μmol/L)SB的DMEM/F12培养基(含10%新生胎牛血清)培养BMECs,通过细胞计数试剂盒(CCK⁃8)检测细胞活性,确定适宜SB浓度。然后以对照(0μmol/L)和适宜SB浓度培养BMECs,并采用蛋白激酶B(Akt)阻断剂(AKT⁃IN⁃1)、哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)阻断剂雷帕霉素(Rap)或小干扰RNA(siR⁃NA)沉默G蛋白偶联受体41(GPR41)对信号通路及受体进行处理,检测BMECs细胞增殖、凋亡以及GPR41和Akt/mTOR信号通路相关基因和蛋白表达的变化。结果表明:1)与对照组相比,60μmol/L的SB显著提高了BMECs细胞活力(P<0.05),75μmol/L的SB显著抑制了BMECs细胞活力(P<0.05);60μmol/L的SB极显著增加了增殖细胞核抗原(PCNA)、细胞周期蛋白A2(CCNA2)和细胞周期蛋白D1(CCND1)的mRNA相对表达量(P<0.01),显著增加了PCNA和细胞周期蛋白A1(CCNA1)的蛋白相对表达量(P<0.05)。2)与对照组相比,60μmol/L SB显著或极显著提高了B细胞淋巴瘤2(BCL2)的mRNA和蛋白相对表达量及BCL2/B细胞淋巴瘤2相关X蛋白(BAX)比值(P<0.05或P<0.01),显著或极显著降低了BAX、半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3(Caspase⁃3)和半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-9(Caspase⁃9)的mRNA和蛋白相对表达量(P<0.05),同时显著或极显著提高了磷酸化蛋白激酶B(p⁃Akt)/Akt和磷酸化哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(p⁃mTOR)/mTOR比值(P<0.05或P<0.01)。60μmol/L的SB对Akt和mTOR信号通路的激活被AKT⁃IN⁃1极显著阻断(P<0.01),而Rap抑制mTOR完全逆转了60μmol/L SB对BMECs增殖的促进作用以及增殖基因和蛋白表达的改变(P<0.05或P<0.01),但不影响与凋亡和SB激活的Akt信号通路相关的mRNA或蛋白表达(P>0.05)。3)与对照组相比,60μmol/L的SB极显著提高了GPR41的mRNA相对表达量(P<0.01),显著提高了GPR41蛋白相对表达量(P<0.05)。GPR41 siRNA沉默GPR41后完全逆转了60μmol/L SB对BMECs增殖的促进作用以及Akt/mTOR信号通路相关的增殖基因和蛋白的mRNA或蛋白表达(P<0.05或P<0.01)。由此可见,60μmol/L SB可通过GPR41介导Akt/mTOR信号通路促进BMECs增殖。 展开更多

关键词 Akt mTOR 信号通路 牛乳腺上皮细胞 增殖 丁酸钠

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利用CRISPR/Cas9技术制备BLG基因敲除牛乳腺上皮细胞系 被引量：2

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作者 丁修虎 林志平 +8 位作者 赵芳 陈坤琳 仲跻峰 张燕 高运东 李惠侠 王慧利 张建丽 丁强 《畜牧兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2024年第10期4475-4488,共14页

旨在利用CRISPR/Cas9系统构建BLG基因敲除牛乳腺上皮细胞系(bovine mammary epithelial cells,bMECs),同时检测BLG基因敲除后对细胞的影响。本研究利用体外切割试验筛选获得靶向牛的BLG基因的第一外显子序列的3条sgRNA,与CRISPR/Cas9表... 旨在利用CRISPR/Cas9系统构建BLG基因敲除牛乳腺上皮细胞系(bovine mammary epithelial cells,bMECs),同时检测BLG基因敲除后对细胞的影响。本研究利用体外切割试验筛选获得靶向牛的BLG基因的第一外显子序列的3条sgRNA,与CRISPR/Cas9表达载体电转染入bMECs,利用浓度为1.8μg·mL^(-1)嘌呤霉素和6μg·mL^(-1)稻瘟菌素双药筛和PCR分析鉴定获得BLG基因编辑的单克隆细胞株;利用Western blot(WB)验证细胞BLG表达;绘制生长曲线和CCK-8试验检测BLG基因敲除对bMECs细胞增殖的影响;同时根据sgRNA序列,对基因组上潜在脱靶位点进行PCR测序分析。经筛选和PCR序列分析,共筛选获得了9株BLG基因编辑细胞株,其编辑效率为90%(9/10),其中4株细胞株BLG基因大片段删除。序列分析结果显示,单克隆细胞株编辑位点呈现片段插入缺失和碱基替换等多种编辑类型,WB结果显示敲除细胞株BLG蛋白表达显著降低,且细胞生长曲线和CCK-8检测结果表明BLG基因敲除的细胞生长速度加快。本研究利用CRISPR/Cas9技术成果构建了牛乳腺上皮细胞BLG基因高效敲除方法,BLG基因敲除后可显著影响牛乳腺上皮细胞的增殖,为探究BLG敲除牛在乳腺上皮细胞水平探究其功能机制提供细胞模型。 展开更多

关键词 BLG基因 牛乳腺上皮细胞系 CRISPR/Cas9 基因编辑

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脂多糖与钙离子共处理的牛乳腺上皮细胞miRNA表达谱的比较分析

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作者 许浩天 于月通 +5 位作者 李静 马志远 杨彬 王泽坤 陀海欣 齐萌 《中国畜牧兽医》 CAS CSCD 北大核心 2024年第9期4066-4079,共14页

【目的】探索钙离子对牛乳腺上皮细胞炎症反应的调控作用,比较分析脂多糖与钙离子共处理的牛乳腺上皮细胞的miRNA表达谱。【方法】使用脂多糖处理牛乳腺上皮细胞构建炎症反应模型,检测不同浓度(0.5~6.6 mmol/L)钙离子和脂多糖(50μg/mL... 【目的】探索钙离子对牛乳腺上皮细胞炎症反应的调控作用,比较分析脂多糖与钙离子共处理的牛乳腺上皮细胞的miRNA表达谱。【方法】使用脂多糖处理牛乳腺上皮细胞构建炎症反应模型,检测不同浓度(0.5~6.6 mmol/L)钙离子和脂多糖(50μg/mL)共处理的牛乳腺上皮细胞的炎症因子转录水平。提取正常、脂多糖处理、脂多糖与钙离子共处理牛乳腺上皮细胞样本中总RNA,每组各3个样本。对9个RNA样本进行质量评估,并对其开展miRNA测序和生物信息学分析,最后对3组共有差异表达miRNA进行实时荧光定量PCR验证。【结果】在牛乳腺上皮细胞炎症模型中,高浓度钙离子可抑制炎症因子的转录。9个样本的clean reads在raw reads中占比为93.86%~98.18%,序列分布长度均集中在21~24 nt之间。3组样本的组内相似性高,而组间差异度高。3组样本共鉴定出47个差异表达miRNA,共有差异表达miRNA分别为bta-miR-11980、bta-miR-1246和bta-miR-677。GO功能和KEGG通路富集分析显示,差异表达miRNA的靶基因显著富集于细胞通讯调节、信号调节、内膜系统、系统发育、细胞发育过程、细胞分化等GO条目,显著富集于HIF-1信号通路、ErbB信号通路、TNF信号通路、突触囊泡周期、肌醇磷酸代谢途径等通路。实时荧光定量PCR验证结果显示,3组样本共有差异表达miRNA(bta-miR-677和bta-miR-1246)表达趋势与转录组测序结果一致。【结论】钙离子通过调控牛乳腺上皮细胞内bta-miR-11980、bta-miR-1246和bta-miR-677等差异表达miRNA的表达模式,间接影响牛乳腺上皮细胞炎症反应进程。 展开更多

关键词 脂多糖 钙离子 牛乳腺上皮细胞 miRNA表达谱

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牛乳腺上皮细胞的分离培养 被引量：31

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作者 李震 王英 +1 位作者 刘惠莉 张德福 《上海农业学报》 CSCD 2000年第3期25-28,共4页

比较了几种乳腺细胞分离培养方法的特点。实验证明 :胶原酶消化法和组织块种植法均可用于培养牛原代乳腺细胞。其中 ,胶原酶消化法容易得到均匀的乳腺细胞 ,且上皮细胞所占比例也比较高 ;组织块培养法不容易丢失、损伤上皮细胞 ,但上皮... 比较了几种乳腺细胞分离培养方法的特点。实验证明 :胶原酶消化法和组织块种植法均可用于培养牛原代乳腺细胞。其中 ,胶原酶消化法容易得到均匀的乳腺细胞 ,且上皮细胞所占比例也比较高 ;组织块培养法不容易丢失、损伤上皮细胞 ,但上皮细胞长出较晚 ,且占比例较低 ,然而 ,用于培养小动物乳腺组织具有优势 ,并且可结合组织块转移、胰蛋白酶消化纯化上皮细胞 ,用此方法本实验获得了牛乳腺上皮细胞富集的细胞系 ;同时讨论了乳腺上皮细胞增殖与分化的关系 。 展开更多

关键词 牛乳腺上皮细胞 分离培养 胶原酶消化法 组织块种植法 细胞增殖 细胞分化

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游离亚麻酸对奶牛乳腺上皮细胞脂肪酸代谢相关基因mRNA转录的影响 被引量：12

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作者 胡菡 王加启 +3 位作者 李发弟 卜登攀 李喜艳 周凌云 《动物营养学报》 CAS CSCD 北大核心 2010年第5期1342-1349,共8页

本研究以体外培养的奶牛乳腺上皮细胞为模型,研究外源添加不同浓度游离α-亚麻酸(LNA)对细胞脂肪酸代谢相关靶基因mRNA转录水平的影响。体外培养的奶牛乳腺上皮细胞,以牛血清白蛋白(BSA)代替胎牛血清为对照组,BSA与不同浓度LNA为试验组... 本研究以体外培养的奶牛乳腺上皮细胞为模型,研究外源添加不同浓度游离α-亚麻酸(LNA)对细胞脂肪酸代谢相关靶基因mRNA转录水平的影响。体外培养的奶牛乳腺上皮细胞,以牛血清白蛋白(BSA)代替胎牛血清为对照组,BSA与不同浓度LNA为试验组,试验培养36h,采用RT-qPCT对目的基因进行定量,检测其表达丰度。结果显示:1)0.625～5.000μmol/LLNA极显著上调了脂肪酸转运基因中CD36的表达(P<0.01),而较高浓度(≥5μmol/L)的LNA下调了另2种转运蛋白,即长链酰基辅酶A合成酶-1基因(ACSL1)和脂肪酸结合蛋白-3(FABP3)基因的表达(P<0.01);2)LNA对奶牛乳腺上皮细胞脂肪酸合成相关基因表达丰度的影响具有剂量效应,较高浓度(≥5μmol/L)的LNA极显著降低脂肪酸合成酶(FASN)基因和硬脂酰去饱和酶(SCD)基因mRNA转录水平(P<0.01);3)LNA的浓度对过氧化物酶体增殖物激活受体-γ(PPARG)基因的mRNA转录水平没有显著影响(P>0.05),但所有浓度的LNA均极显著降低了固醇调节元件结合蛋白-1(SREBF1)基因的mRNA转录水平(P<0.01)。本试验结果证实,长链脂肪酸LNA对乳腺上皮细胞脂肪酸关键合成酶的基因转录具有抑制作用,而CD36在长链脂肪酸转运进入奶牛乳腺上皮细胞的过程中具有重要作用。 展开更多

关键词 牛乳腺上皮细胞 亚麻酸 脂肪酸 摄取与转运 内源合成 硬脂酰去饱和酶

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牛乳腺上皮细胞β-酪蛋白的检测及核型分析 被引量：14

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作者 王治国 卜登攀 王加启 《中国畜牧兽医》 CAS 2007年第2期8-11,共4页

本试验用Western-blotting检测奶牛乳腺上皮细胞培养液中的β-酪蛋白,鉴定该细胞的生理功能是否正常;通过分析染色体数目及核型以鉴定体外培养的奶牛乳腺上皮细胞是否发生转化。结果显示:培养液中含有β-酪蛋白,说明该乳腺上皮细胞生理... 本试验用Western-blotting检测奶牛乳腺上皮细胞培养液中的β-酪蛋白,鉴定该细胞的生理功能是否正常;通过分析染色体数目及核型以鉴定体外培养的奶牛乳腺上皮细胞是否发生转化。结果显示:培养液中含有β-酪蛋白,说明该乳腺上皮细胞生理状况良好;染色体数目正常,染色体数目为60,核型与哺乳动物染色体图谱一致,说明该细胞系在体外培养条件下未发生转化。 展开更多

关键词 Β-酪蛋白 牛乳腺上皮细胞 染色体

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与脐带间充质干细胞共培养促进奶牛乳腺上皮细胞乳蛋白合成及其机制 被引量：1

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作者 赵艳坤 邵伟 +2 位作者 雒诚龙 武开乐 余雄 《细胞与分子免疫学杂志》 CAS CSCD 北大核心 2017年第2期185-189,共5页

目的研究脐带间充质干细胞(UCMSC)调节奶牛乳腺上皮细胞(BMEC)乳蛋白合成的可能作用机制。方法利用TranswellTM小室将UCMSC和BMEC进行双层共培养,BMEC单纯培养为对照组,胰岛素样生长因子1受体(IGF-1R)抑制剂AG1024处理细胞,ELISA检测上... 目的研究脐带间充质干细胞(UCMSC)调节奶牛乳腺上皮细胞(BMEC)乳蛋白合成的可能作用机制。方法利用TranswellTM小室将UCMSC和BMEC进行双层共培养,BMEC单纯培养为对照组,胰岛素样生长因子1受体(IGF-1R)抑制剂AG1024处理细胞,ELISA检测上清IGF-1和β酪蛋白(CSN2)、κ酪蛋白(CSN3)含量变化,实时定量PCR检测Janus激酶2/信号转导子与转录激活子5(JAK2/STAT5)信号通路相关基因的相对表达丰度;再用JAK2信号通路阻断剂AG490孵育细胞,实时定量PCR检测CSN2、CSN3 mRNA的相对表达丰度。结果与UCMSC共培养后,BMEC的CSN2、CSN3合成量和CSN2、CSN3、JAK2、STAT5、E74样ETS转录因子5(ELF5)mRNA相对表达丰度均显著高于单纯培养的BMEC;AG1024处理后,显著降低BMEC的CSN2、CSN3合成量,显著降低CSN2、CSN3、JAK2、STAT5、ELF5 mRNA的相对表达丰度;给予AG490阻断后,显著降低CSN2、CSN3 mRNA相对表达丰度;在AG1024基础上,加入AG490后显著降低CSN2、CSN3 mRNA相对表达丰度。结论UCMSC能够通过IGF-1介导JAK2/STAT5信号通路,上调BMEC乳蛋白合成关键基因mRNA的表达丰度,促进其乳蛋白的合成。 展开更多

关键词 脐带间充质干细胞(UCMSC) 牛乳腺上皮细胞(BMEC) 共培养 乳蛋白 β酪蛋白(CSN2) κ酪蛋白(CSN3)

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牛白细胞介素-17真核表达载体的构建及在牛乳腺上皮细胞中的表达

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作者 王婷 崔新洁 +4 位作者 刘秉春 陶琳 胡庆亮 修磊 王潇 《华南农业大学学报》 CAS CSCD 北大核心 2014年第1期79-85,共7页

【目的】在体外分离培养牛乳腺上皮原代细胞,并构建牛白细胞介素-17(bIL-17)基因真核表达质粒,观察重组质粒在牛乳腺上皮细胞的表达.【方法】提取牛脾脏细胞总RNA,通过RT-PCR扩增bIL-17,将bIL-17连入pMD19-T进行测序,测序成功后将bIL-1... 【目的】在体外分离培养牛乳腺上皮原代细胞,并构建牛白细胞介素-17(bIL-17)基因真核表达质粒,观察重组质粒在牛乳腺上皮细胞的表达.【方法】提取牛脾脏细胞总RNA,通过RT-PCR扩增bIL-17,将bIL-17连入pMD19-T进行测序,测序成功后将bIL-17插入含有增强型绿色荧光蛋白报告基因的真核表达质粒pEGFP-N3上,构建真核表达质粒pEGFP-N3-bIL-17.用脂质体法将pEGFP-N3-bIL-17质粒转染于牛乳腺上皮细胞,荧光显微镜观察绿色荧光蛋白在细胞中的表达,RT-PCR检测bIL-17基因在细胞内的转录,定量ELISA检测bIL-17蛋白在细胞内的表达情况.【结果和结论】成功构建具有绿色荧光和新霉素抗性的双选择标记的牛白细胞介素-17真核表达载体,并可在牛乳腺上皮细胞成功表达. 展开更多

关键词 牛白细胞介素-17 载体构建 牛乳腺上皮细胞 转染 表达

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血管紧张素转化酶2对Ang Ⅱ诱导的牛乳腺上皮细胞炎症损伤的缓解作用 被引量：1

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作者 朱斌 刘小倩 +2 位作者 刘颖 纪晓霞 张源淑 《畜牧兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2019年第7期1458-1465,共8页

以不同浓度血管紧张素Ⅱ(AngⅡ)诱导牛乳腺上皮细胞(MAC-T)炎症损伤,探讨血管紧张素转化酶2(ACE 2)的变化及与AngⅡ的相互作用。研究包括:ELISA检测细胞上清中细胞炎性因子的分泌或释放;Western blot检测细胞ACE 2和ACE的蛋白表达变化,... 以不同浓度血管紧张素Ⅱ(AngⅡ)诱导牛乳腺上皮细胞(MAC-T)炎症损伤,探讨血管紧张素转化酶2(ACE 2)的变化及与AngⅡ的相互作用。研究包括:ELISA检测细胞上清中细胞炎性因子的分泌或释放;Western blot检测细胞ACE 2和ACE的蛋白表达变化,并进行相关性分析;添加ACE 2活性蛋白对AngⅡ诱导损伤的保护作用。结果显示:1)AngⅡ处理MAC-T,细胞上清中促炎因子TNF-α、IL-6、IL-8含量显著(P<0.05)或极显著(P<0.01)增加,抗炎因子IL-10含量显著降低(P<0.05);2)不同浓度AngⅡ处理细胞后,ACE 2蛋白表达均有降低,10-6 mol·L^-1 AngⅡ处理后显著降低(P<0.05);ACE蛋白表达结果相反;ACE 2与AngⅡ浓度之间存在显著负相关;3)添加外源性ACE 2活性蛋白,细胞上清中TNF-α、IL-6和IL-8浓度均有一定程度的下降,IL-10浓度升高。本研究表明ACE 2/ACE轴的失衡是AngⅡ诱导细胞炎性损伤的主要原因。高水平AngⅡ可激活炎症因子促进炎症反应,是促进炎症反应的主要介质,ACE 2可以通过降解AngⅡ,抑制其对炎症反应的上调效应。 展开更多

关键词 血管紧张素转化酶2(ACE 2) 血管紧张素Ⅱ(AngⅡ) 牛乳腺上皮细胞(mac-t) 炎性反应

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黄曲霉毒素B1激活核转录因子-κB信号通路引起牛乳腺上皮细胞发生炎性反应 被引量：4

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作者 任晓丽 皇甫和平 +3 位作者 王军 靳双星 王俊东 石冬梅 《动物营养学报》 CAS CSCD 北大核心 2023年第7期4587-4595,共9页

本试验旨在研究不同浓度黄曲霉毒素B1(AFB1)对牛乳腺上皮细胞(MAC-T细胞)中核转录因子-κB(NF-κB)信号通路介导的炎症反应的影响。向MAC-T细胞中分别加入不同浓度的AFB1处理培养液培养24 h,分析AFB1对MAC-T细胞活力、乳酸脱氢酶(LDH)... 本试验旨在研究不同浓度黄曲霉毒素B1(AFB1)对牛乳腺上皮细胞(MAC-T细胞)中核转录因子-κB(NF-κB)信号通路介导的炎症反应的影响。向MAC-T细胞中分别加入不同浓度的AFB1处理培养液培养24 h,分析AFB1对MAC-T细胞活力、乳酸脱氢酶(LDH)活性、促炎细胞因子含量和基因表达以及NF-κB信号通路相关蛋白表达的影响。结果显示:1)与对照组相比,2.5、5.0、10.0和20.0μmol/L AFB1处理MAC-T细胞均能显著或极显著降低细胞活力(P<0.05或P<0.01),显著或极显著升高培养上清液中乳酸脱氢酶(LDH)活性(P<0.05或P<0.01),且呈剂量依赖性。2)与对照组(0μmol/L AFB1)相比,5.0、10.0和20.0μmol/L AFB1处理MAC-T细胞使上清液中白细胞介素-1β(IL-1β)、白细胞介素-6(IL-6)、白细胞介素-8(IL-8)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)的含量显著或极显著升高(P<0.05或P<0.01);5.0μmol/L AFB1处理使MAC-T细胞中IL-1β、IL-8和TNF-αmRNA的相对表达量显著或极显著升高(P<0.05),10.0μmol/L AFB1处理使MAC-T细胞中IL-1β、IL-6、IL-8和TNF-αmRNA的相对表达量显著或极显著升高(P<0.01),20.0μmol/L AFB1处理使MAC-T细胞中IL-1β、IL-6、IL-8和TNF-αmRNA的相对表达量极显著升高(P<0.01)。3)与对照组相比,10.0和20.0μmol/L AFB1处理使MAC-T细胞中磷酸化P65(p-P65)、磷酸化核转录因子-κB抑制因子α(p-IκBα)蛋白的相对表达量极显著升高(P<0.01)。上述结果提示,AFB1通过促进炎症相关因子表达和激活NF-κB信号通路,引起MAC-T细胞发生炎性反应。 展开更多

关键词 黄曲霉毒素B1 牛乳腺上皮细胞 NF-ΚB信号通路 炎性反应

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热应激造成奶牛乳腺上皮细胞损伤并影响乳合成相关载体的基因表达 被引量：8

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作者 权素玉 张源淑 卜登攀 《畜牧兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2016年第8期1704-1713,共10页

本试验以奶牛乳腺上皮细胞为模型,旨在寻找热应激下调奶牛泌乳功能的相关因素。42℃高温处理奶牛乳腺上皮细胞0、0.5、1、1.5、2、4、8及12h,检测其对细胞活率,线粒体膜电位,热休克分子及蛋白基因、氧化应激相关基因以及氨基酸和葡萄糖... 本试验以奶牛乳腺上皮细胞为模型,旨在寻找热应激下调奶牛泌乳功能的相关因素。42℃高温处理奶牛乳腺上皮细胞0、0.5、1、1.5、2、4、8及12h,检测其对细胞活率,线粒体膜电位,热休克分子及蛋白基因、氧化应激相关基因以及氨基酸和葡萄糖转运载体基因表达的影响。结果显示,不同时间热处理显著降低乳腺上皮细胞活率（P〈0.05）,损伤细胞线粒体膜电位。HSP27基因表达显著下降（P〈0.05）,HSP70基因表达显著上调（P〈0.05）,HSP90基因表达在前4h显著上调（P〈0.05）,后恢复至正常水平,HSF-1基因表达在某些时间点显著上调（P〈0.05）。氧化应激相关基因Keach样环氧氯丙烷相关蛋白-1（Keap1）表达无显著变化（P〉0.05）,核因子E2相关因子2（Nrf2）表达显著上调（P〈0.05）,NAD（P）H脱氢酶醌-1（NQO1）表达显著上调（P〈0.05）。跨膜氨基酸转运载体SLC7A7基因表达在1h和4h显著上调（P〈0.05）。葡萄糖转运载体GLUT1及GLUT8基因表达显著下调（P〈0.05）。葡萄糖转运载体GLUT12在热处理0~2h表达显著上调,4~12h显著下调（P〈0.05）。热应激能够显著降低奶牛乳腺上皮细胞活率,引起氧化应激,改变热休克蛋白和分子及跨膜转运载体的基因表达。 展开更多

关键词 热应激 牛乳腺上皮细胞 细胞活力 线粒体膜电位 氧化应激 热休克蛋白 跨膜转运载体

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丁酸钠通过AMPK通路调控LPS造成牛乳腺上皮细胞脂代谢紊乱的作用机制 被引量：4

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作者 李林 曹萌 +3 位作者 宫彬彬 赵梅 王婕 张晓辉 《畜牧兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2022年第9期3221-3230,共10页

通过向脂多糖(LPS)诱导牛乳腺上皮细胞系(MAC-T)脂代谢紊乱模型中添加不同浓度(2、8、16μmol·L^(-1))的丁酸钠,探讨其对细胞脂代谢的调控机理及炎症损伤的修复作用。分别用1 000 ng·mLLPS刺激MAC-T细胞9 h后,检测细胞脂滴面... 通过向脂多糖(LPS)诱导牛乳腺上皮细胞系(MAC-T)脂代谢紊乱模型中添加不同浓度(2、8、16μmol·L^(-1))的丁酸钠,探讨其对细胞脂代谢的调控机理及炎症损伤的修复作用。分别用1 000 ng·mLLPS刺激MAC-T细胞9 h后,检测细胞脂滴面积及三酰甘油(TG)含量;用不同浓度的丁酸钠刺激MAC-T细胞12 h后,流式细胞术检测细胞凋亡率;试验共分为5组:对照组、LPS处理组、2μmol·L^(-1)丁酸钠+LPS处理组、8μmol·L^(-1)丁酸钠+LPS处理组和16μmol·L^(-1)丁酸钠+LPS处理组,分别对细胞TG含量、AMPK信号通路蛋白、脂代谢关键基因以及相关炎症因子进行检测。结果显示:LPS会造成MAC-T细胞总脂滴面积显著下降(P<0.05),TG含量极显著下降(P<0.01);不同浓度的丁酸钠对MAC-T细胞凋亡率没有影响;与对照组相比,LPS处理组TG含量极显著下降(P<0.01)、P-AMPK表达水平显著上升(P<0.05)、脂合成代谢相关基因ACC、SCD-1以及FAS mRNA表达水平均显著(P<0.05)或极显著(P<0.01)下降、脂分解代谢相关基因CPT-1、CPT-2以及ACO mRNA表达水平均显著上升(P<0.05)、炎症因子TNF-α和IL-6含量显著上升(P<0.05);与LPS处理组相比,(2、8、16μmol·L^(-1))丁酸钠+LPS处理组TG含量有一定程度上升,P-AMPK表达水平下降,脂合成代谢相关基因表达水平上升,脂分解代谢相关基因表达水平有一定程度下降,炎症因子TNF-α和IL-6含量下降。本研究表明丁酸钠会通过AMPK通路激活脂合成代谢,调控TG的合成,并且对MAC-T细胞的炎症损伤具有一定的缓解作用。 展开更多

关键词 脂多糖 丁酸钠 牛乳腺上皮细胞系(mac-t) 脂代谢紊乱

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SNAT2介导蛋氨酸对牛乳腺上皮细胞增殖与自噬的调节作用 被引量：2

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作者 祁昊 孟春雨 +1 位作者 高学军 甄贞 《中国畜牧兽医》 CAS 北大核心 2019年第9期2516-2525,共10页

钠离子依赖性中性氨基酸转运体2(SNAT2)是一种氨基酸转运蛋白,可转运中性氨基酸,广泛分布于多种细胞中。氨基酸既可作为蛋白质合成的底物,也是调节细胞新陈代谢的关键信号分子,但SNAT2是否介导氨基酸调节BMECs增殖和自噬尚未见报道。本... 钠离子依赖性中性氨基酸转运体2(SNAT2)是一种氨基酸转运蛋白,可转运中性氨基酸,广泛分布于多种细胞中。氨基酸既可作为蛋白质合成的底物,也是调节细胞新陈代谢的关键信号分子,但SNAT2是否介导氨基酸调节BMECs增殖和自噬尚未见报道。本研究利用CASY细胞计数和Western blotting技术检测SNAT2过表达和siRNA干扰后牛乳腺上皮细胞(BMECs)增殖情况以及SNAT2对自噬标志蛋白LC3-Ⅰ/Ⅱ表达量的影响,并利用免疫荧光检测细胞自噬斑点(LC3-Ⅱ)变化。结果显示,SNAT2过表达时,p-PI3K、p-mTOR和Cyclin D1表达量增加,反之,p-PI3K、p-mTOR和Cyclin D1表达量下降。SNAT2抑制时,LC3-Ⅱ表达量增加,免疫荧光检测自噬斑点增多。添加自噬增强剂海藻糖(trehalose,Tre)和蛋氨酸(methionine,Met)后,与单一添加Tre组相比,Met+Tre组p-mTOR表达量增加,LC3-Ⅱ表达量降低,胞浆内绿色自噬斑点减少;添加Tre和Met并抑制SNAT2时,p-mTOR表达量下降,LC3-Ⅱ表达量增多,胞浆内绿色自噬斑点增加。以上结果表明,SNAT2可介导Met通过调控PI3K-mTOR/Cyclin D1信号通路调节BMECs的增殖与自噬。 展开更多

关键词 钠离子依赖性中性氨基酸转运体2(SNAT2) 牛乳腺上皮细胞(BMECs) MTOR 增殖 自噬

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脂多糖对牛乳腺上皮细胞自噬和凋亡的影响 被引量：1

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作者 张兴 高英魁 +8 位作者 郝中华 刘静静 张华强 归荣 张珂菲 周广薇 邓立新 王学兵 童超 《动物医学进展》 北大核心 2023年第9期69-75,共7页

为探究脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)对牛乳腺上皮细胞(MAC-T)自噬和凋亡的影响,以MAC-T细胞为试验对象,用CCK-8和乳酸脱氢酶(LDH)法检测不同浓度LPS(100、150、200、250μg/mL),检测细胞的存活率和损伤,从上述分组中挑选浓度为0(对照... 为探究脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)对牛乳腺上皮细胞(MAC-T)自噬和凋亡的影响,以MAC-T细胞为试验对象,用CCK-8和乳酸脱氢酶(LDH)法检测不同浓度LPS(100、150、200、250μg/mL),检测细胞的存活率和损伤,从上述分组中挑选浓度为0(对照)、50、100、200μg/mL的LPS建立试验组,Hoechst33342检测细胞核形态,qPCR法检测MAC-T细胞中自噬和凋亡基因(LC3B、p62、BAX、BCL-2、ATG5、ATG7、Beclin-1、caspase-3)mRNA的表达量,Western blot检测MAC-T细胞中自噬和凋亡(LC3B、p62、BAX、BCL-2、ATG5、ATG7、Beclin-1、caspase-3)相关蛋白表达。结果显示,MAC-T细胞的活力会随着LPS的浓度和时间的推移下降,细胞上清中的LDH随着LPS浓度上升而增加,Hoechst33342染色后可以发现细胞核形态出现异型性,染色质碎裂、固缩。qPCR和Western blot检测结果显示LPS在50~100μg/mL浓度下可引起MAC-T细胞自噬,200μg/mL可抑制此过程,同时细胞凋亡随着LPS浓度上升而加剧。说明LPS可引起MAC-T细胞自噬同时诱导细胞凋亡,为大肠埃希氏菌诱导牛乳腺炎发生机制的研究提供参考。 展开更多

关键词 牛乳腺上皮细胞 脂多糖 自噬 凋亡

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异体移植炎症因子1通过核因子κB信号促进牛乳腺上皮细胞炎症因子的释放 被引量：2

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作者 伍迎欢 杨丹茹 赵燕英 《畜牧兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2021年第3期782-788,共7页

奶牛乳腺炎是指在不同理化因素刺激下奶牛乳腺的炎性反应,其严重影响了奶牛养殖业的健康发展。许多细胞因子是炎症调节剂,但与奶牛乳腺炎相关的关键细胞因子还未被鉴定。异体移植炎症因子1(allograft inflammatory factor-1,AIF-1)在免... 奶牛乳腺炎是指在不同理化因素刺激下奶牛乳腺的炎性反应,其严重影响了奶牛养殖业的健康发展。许多细胞因子是炎症调节剂,但与奶牛乳腺炎相关的关键细胞因子还未被鉴定。异体移植炎症因子1(allograft inflammatory factor-1,AIF-1)在免疫调节中扮演重要角色,并在多种炎性疾病中过量表达。因此,本研究探讨了牛AIF-1在乳腺炎中的可能作用。首先,利用ELISA试剂盒检测了乳腺炎牛奶中牛AIF-1的含量,并用RT-PCR方法克隆牛AIF-1基因,然后,用亲和层析纯化牛AIF-1蛋白。用此重组蛋白刺激牛乳腺上皮细胞,ELISA试剂盒检测肿瘤坏死因子α、白细胞介素6和单核细胞趋化蛋白1的分泌,Western blot测定IκBα的磷酸化。结果显示,患乳腺炎奶牛乳中AIF-1的平均含量显著高于健康奶牛,而抗生素治愈后的奶牛乳中AIF-1的含量回落到正常水平。这些结果提示,牛AIF-1是一个分泌型蛋白,可能与乳腺炎相关。为了进一步探索这种关系,本研究克隆了牛AIF-1基因并纯化了牛AIF-1蛋白。此蛋白上调了牛乳腺上皮细胞肿瘤坏死因子α、白细胞介素6和单核细胞趋化蛋白1的分泌,并刺激了IκBα的磷酸化。IκBα磷酸化抑制剂BAY 11-7085阻断了牛AIF-1刺激的炎性细胞因子上调。综上表明,牛AIF-1通过核因子κB信号促进了牛乳腺上皮细胞炎症因子的释放。 展开更多

关键词 奶牛乳腺炎 牛乳腺上皮细胞 异体移植炎症因子1 核因子ΚB

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牛奶中乳腺上皮细胞的分离培养及鉴定 被引量：7

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作者 崔新洁 王婷 +2 位作者 刘秉春 陶林 王潇 《生物技术通报》 CAS CSCD 北大核心 2013年第3期107-113,共7页

旨在建立简便、经济、纯净的牛乳腺上皮细胞的体外培养方法,并对所培养细胞进行鉴定。以新鲜牛奶为材料,离心收集细胞进行原代培养并传代,通过测定生长曲线、乳腺上皮细胞骨架蛋白-角蛋白8和18、β-酪蛋白、核型等对所培养细胞进行鉴定... 旨在建立简便、经济、纯净的牛乳腺上皮细胞的体外培养方法,并对所培养细胞进行鉴定。以新鲜牛奶为材料,离心收集细胞进行原代培养并传代,通过测定生长曲线、乳腺上皮细胞骨架蛋白-角蛋白8和18、β-酪蛋白、核型等对所培养细胞进行鉴定,以确定其为乳腺上皮细胞。离心收集到的细胞原代培养3 d后形成多个单克隆,细胞呈典型的铺路石状,同时伴随少量的吞噬细胞,继续培养至单克隆汇合时,细胞表层产生大小不等的乳滴,吞噬细胞大多转移到乳滴中,传代后,得到纯净的乳腺上皮细胞,吞噬细胞随传代而消失;细胞生长曲线呈"S"型,RT-PCR法扩增到了乳腺上皮细胞的骨架蛋白8、18以及β-酪蛋白,细胞免疫组化检测到了细胞角蛋白8,核型为29对端着丝粒常染色体,1对近端着丝粒性染色体。通过以上试验证明,乳汁分离法可以培养纯净的、具有正常分裂增生能力的牛乳腺上皮细胞,建立了乳腺上皮细胞的体外培养模型。 展开更多

关键词 乳汁 牛乳腺上皮细胞 细胞骨架蛋白 泌乳

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pEGFP-hTERT真核表达载体的构建及转染牛乳腺细胞方法的优化 被引量：6

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作者 闫晶 贺小英 +2 位作者 潘春留 兰志刚 张涌 《动物医学进展》 CSCD 北大核心 2009年第5期14-19,共6页

针对牛乳腺细胞体外培养存活周期短、转染效率低等特点,分别采用Ⅰ型、Ⅱ型胶原酶消化培养法及组织贴壁培养法,比较了牛乳腺细胞的生长、迁移、分化和凋亡等一系列特征。同时构建了携带绿色荧光蛋白报告基因的端粒酶融合表达载体pEGFP-h... 针对牛乳腺细胞体外培养存活周期短、转染效率低等特点,分别采用Ⅰ型、Ⅱ型胶原酶消化培养法及组织贴壁培养法,比较了牛乳腺细胞的生长、迁移、分化和凋亡等一系列特征。同时构建了携带绿色荧光蛋白报告基因的端粒酶融合表达载体pEGFP-hTERT,采用脂质体分别转染两种真核表达载体pEGFP-hTERT、pEGFP-C1,通过比较载体不同浓度、传代细胞转染适合密度及生长活力、转染后的荧光强度等检测转染效率。结果表明,第3代细胞接种密度大约70%,浓度为350 ng/μL的载体适合于牛乳腺细胞的转染,转染效率大约为25%。试验结果为牛乳腺细胞体外转基因研究奠定了技术基础。 展开更多

关键词 牛乳腺上皮细胞 胶原酶 表达载体 转染

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