高效热不对称交互式PCR技术克隆地黄基因 被引量：3

1

作者 周延清 王婉珅 +4 位作者 张喻 李静云 陈娟娟 苑璐璐 魏俊 《河南师范大学学报（自然科学版）》 CAS 北大核心 2015年第1期100-105,共6页

利用高效热不对称交互式PCR（hiTAIL-PCR）技术从地黄基因组中扩增出3个DNA片段,经过电泳检测、回收、纯化和测序获得2个片段的碱基序列.其中一个由578个bp组成,包含一个453bp的开放阅读框（ORF）,编码151个氨基酸,与一些已知纤维素合... 利用高效热不对称交互式PCR（hiTAIL-PCR）技术从地黄基因组中扩增出3个DNA片段,经过电泳检测、回收、纯化和测序获得2个片段的碱基序列.其中一个由578个bp组成,包含一个453bp的开放阅读框（ORF）,编码151个氨基酸,与一些已知纤维素合酶基因在DNA水平和氨基酸水平的同源性分别高达81%~91%和83%~99%,而且推测蛋白质具有纤维素合酶的结构域;另一个由385个bp组成,没有ORF,不编码蛋白质,但是,预测其包含启动子元件.这些结果表明使用hiTAIL-PCR技术可以克隆地黄基因,克隆的基因将为地黄基因分子作用机制和分子育种研究奠定基础. 展开更多

关键词 地黄 高效热不对称交互式pcr技术 基因克隆 启动子

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利用交错式热不对称PCR法获取多脊椎蒙古羊Hoxc8启动子序列的研究 被引量：2

2

作者 陈琦 赵静 +1 位作者 张立岭 马月辉 《安徽农业科学》 CAS 2012年第3期1511-1513,1516,共4页

[目的]探索获得蒙古羊Hoxc8基因启动子序列的方法。[方法]尝试利用交错式热不对称PCR法,获得蒙古羊Hoxc8启动子序列。[结果]通过PCR获得的序列不理想,测序结果无法与已知序列相匹配。虽然利用交错式热不对称PCR法未获得蒙古羊的Hoxc8的... [目的]探索获得蒙古羊Hoxc8基因启动子序列的方法。[方法]尝试利用交错式热不对称PCR法,获得蒙古羊Hoxc8启动子序列。[结果]通过PCR获得的序列不理想,测序结果无法与已知序列相匹配。虽然利用交错式热不对称PCR法未获得蒙古羊的Hoxc8的启动子序列,但可为今后的相关研究提供借鉴。[结论]该研究为进一步分析蒙古羊Hoxc8的启动子区域的甲基化状态奠定了基础。 展开更多

关键词 Hoxc8 exon-1 多脊椎蒙古羊 染色体步移技术 交错式热不对称pcr法 启动子

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TAIL-PCR的技术改良及对香蕉NBS-RGC5基因侧翼序列的克隆 被引量：2

3

作者 罗静瑶 陈云云 +3 位作者 谢俊 韦双双 夏幽泉 汤华 《广东农业科学》 CAS CSCD 北大核心 2013年第10期143-145,170,共4页

香蕉枯萎病是一种毁灭性真菌病害,对香蕉的种植和产业发展危害严重,研究香蕉枯萎病相关的抗性基因,具有重要的理论意义。对TAIL-PCR进行技术改良,以简并引物组合的方式与特异性引物进行扩增,代替最初的单一简并引物方式,在TAIL-PCR第一... 香蕉枯萎病是一种毁灭性真菌病害,对香蕉的种植和产业发展危害严重,研究香蕉枯萎病相关的抗性基因,具有重要的理论意义。对TAIL-PCR进行技术改良,以简并引物组合的方式与特异性引物进行扩增,代替最初的单一简并引物方式,在TAIL-PCR第一轮扩增的大循环中设置不同的退火温度;采用改良后的TAIL-PCR成功克隆了巴西蕉NBS型抗性蛋白(NBS-RGC5)基因的侧翼序列。 展开更多

关键词 香蕉 枯萎病 热不对称交错pcr(TAIL-pcr) NBS-RGC5 侧翼序列

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应用hiTAIL-PCR技术克隆Marinomonas sp.BSi20584菌株β-半乳糖苷酶基因 被引量：3

4

作者 周莉莉 陈瑞琴 +2 位作者 陈秀兰 曾胤新 陈波 《极地研究》 CAS CSCD 北大核心 2013年第3期249-256,共8页

实验使用hiTAIL-PCR(high-efficiency thermal asymmetric interlaced PCR,高效热不对称交错PCR)方法,从海单胞菌Marinomonas sp.BSi20584中克隆β-半乳糖苷酶基因。从GenBank注册的已知β-半乳糖苷酶氨基酸序列出发,设计引物克隆编码β... 实验使用hiTAIL-PCR(high-efficiency thermal asymmetric interlaced PCR,高效热不对称交错PCR)方法,从海单胞菌Marinomonas sp.BSi20584中克隆β-半乳糖苷酶基因。从GenBank注册的已知β-半乳糖苷酶氨基酸序列出发,设计引物克隆编码β-半乳糖苷酶保守片段的DAN序列;根据Marinomonas sp.BSi20584天然酶N端氨基酸残基测序结果,设计上游引物,保守DNA片段5'端设计下游引物,克隆N端到保守序列之间的DNA片段;将所得的2个DNA片段拼接并命名拼接后的片段为nbs。根据hiTAIL-PCR方法设计引物,染色体步移克隆nbs上下游片段,拼接上下游片段得到全长序列,设计引物扩增全长片段并测序。本文成功克隆了Marinomonas sp.BSi20584菌株β-半乳糖苷酶的编码基因,全长1 971 bp,NCBI比对表明其编码产物为GH-42家族的一个新成员。 展开更多

关键词 Β-半乳糖苷酶 高效热不对称交错pcr 染色体步移

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TAIL-PCR方法快速克隆银杏查尔酮合成酶基因及序列分析(英文) 被引量：20

5

作者 许锋 程水源 +2 位作者 王燕 李琳玲 程述汉 《果树学报》 CAS CSCD 北大核心 2007年第2期237-243,共7页

热不对称交错PCR(TAIL-PCR)方法已广泛应用于从多种生物克隆已知DNA序列的侧翼序列。对传统的TAIL-PCR方法进行改良:(1)将TAIL技术应用于TAIL-PCR中第3步PCR循环。(2)以10bp的随机简并引物即RAPD引物代替基因侧翼简并引物。以银杏品种... 热不对称交错PCR(TAIL-PCR)方法已广泛应用于从多种生物克隆已知DNA序列的侧翼序列。对传统的TAIL-PCR方法进行改良:(1)将TAIL技术应用于TAIL-PCR中第3步PCR循环。(2)以10bp的随机简并引物即RAPD引物代替基因侧翼简并引物。以银杏品种家佛手的叶基因组DNA为模板,利用简并引物克隆到银杏查尔酮合成酶基因(CHS)片段序列Gbchs1,以此序列设计3条特异引物,利用改良的热不对称交错PCR方法克隆到CHS基因Gbchs2。结果表明,Gbchs2长1238bp,编码304个氨基酸并包含3’末端序列。GbCHS2蛋白质序列与其他植物的CHS蛋白质序列高度同源,包含CHS蛋白质保守的环化作用活性位点,催化活性位点、香豆素活性位点、及催化活性基序。改良后的TAIL-PCR方法为基因全长的克隆提供了一种简单快速高效的新方法。 展开更多

关键词 银杏 热不对称交错pcr 查尔酮合成酶基因 克隆 序列分析

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应用改良TAIL-PCR克隆黄瓜6PGDH基因上游序列 被引量：2

6

作者 魏跃 陈啸寅 +1 位作者 王全智 陈劲枫 《浙江农业学报》 CSCD 北大核心 2011年第5期900-904,共5页

运用改良的热不对称交错PCR(thermal asymmetric interlaced PCR,TAIL-PCR)对黄瓜6-磷酸葡萄糖酸脱氢酶基因(6-phosphogluconate dehydrogenasegene,6PGDH)的上游序列进行了克隆。与最初的TAIL-PCR相比较,主要改进之处有:(1)根据Primer ... 运用改良的热不对称交错PCR(thermal asymmetric interlaced PCR,TAIL-PCR)对黄瓜6-磷酸葡萄糖酸脱氢酶基因(6-phosphogluconate dehydrogenasegene,6PGDH)的上游序列进行了克隆。与最初的TAIL-PCR相比较,主要改进之处有:(1)根据Primer 5.0软件计算结果从随机RAPD引物库中筛选出合适的上游引物,低严谨和高严谨反应中的退火温度也分别进行了调整;(2)将热不对称交替反应继续应用到第3轮PCR扩增反应中以提高特异目的条带和减少非目的条带。经过3轮PCR扩增反应最终获得位于黄瓜6PGDH起始密码子ATG上游长度为517 bp新序列。试验结果表明,应用改良TAIL-PCR能快速、有效地克隆与已知区域相邻的序列。 展开更多

关键词 热不对称交错pcr 6-磷酸葡萄糖酸脱氢酶 黄瓜 上游序列

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利用TAIL-PCR克隆Gluconobacter suboxydans葡萄糖脱氢酶基因及其生物信息学分析 被引量：3

7

作者 戴宝新 冯惠勇 +3 位作者 李天明 刘天佳 刘静文 仪宏 《食品科学》 EI CAS CSCD 北大核心 2014年第1期194-198,共5页

以Gluconobacter suboxydans J菌株基因组DNA为模板，基于吡咯喹啉醌附着位点的保守区域设计引物，通过交错式热不对称PCR获得编码葡萄糖脱氢酶（glucose dehydrogenase，GDH）的全长基因（gdh），并对其序列进行生物信息学分析。结果... 以Gluconobacter suboxydans J菌株基因组DNA为模板，基于吡咯喹啉醌附着位点的保守区域设计引物，通过交错式热不对称PCR获得编码葡萄糖脱氢酶（glucose dehydrogenase，GDH）的全长基因（gdh），并对其序列进行生物信息学分析。结果表明：gdh基因全长2 268 bp，编码755个氨基酸，其蛋白序列与Gluconobacter属的GDH具有较高的同源性。GDH的分子质量约为81.72 ku，pI值约为5.14；GDH蛋白的二级结构由18.41%的α-螺旋、16.16%的延伸和65.43%的无规则卷曲3种结构模块组成；GDH N末端的AA 1～140区域有5个跨膜结构域。 展开更多

关键词 葡萄糖酸 交错式热不对称pcr 弱氧化醋酸杆菌 葡萄糖脱氢酶 生物信息学

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例析未知序列的PCR扩增

8

作者 马学乔 《生物学教学》 2022年第3期87-88,共2页

本文例析并介绍了未知序列的PCR扩增方法。要对已知序列两侧的未知序列进行测序分析,可将其连成环状,利用已知序列设计引物,进行反向PCR。为减少随机片段的含量,可再进行巢式PCR。未知序列也可用热不对称交错PCR来扩增。

关键词 未知序列扩增 反向pcr 热不对称交错pcr

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裂殖壶菌pks2基因启动子序列扩增及其活性分析 被引量：1

9

作者 朱清 臧晓南 +1 位作者 王振东 马帅 《中国海洋大学学报（自然科学版）》 CAS CSCD 北大核心 2023年第1期66-73,共8页

针对目前裂殖壶菌(Aurantiochytrium limacinum)基因工程相关研究中,对内源启动子的了解和利用仍处在初步阶段的现状,本研究从裂殖壶菌中产多不饱和脂肪酸的主要途径聚酮合酶(PKS)途径出发,利用热不对称交错PCR技术(TAIL-PCR),针对pks2... 针对目前裂殖壶菌(Aurantiochytrium limacinum)基因工程相关研究中,对内源启动子的了解和利用仍处在初步阶段的现状,本研究从裂殖壶菌中产多不饱和脂肪酸的主要途径聚酮合酶(PKS)途径出发,利用热不对称交错PCR技术(TAIL-PCR),针对pks2基因扩增出了未知的5’端侧翼序列,初步分析得到pks2基因启动子序列,并分别在原核宿主大肠杆菌(Escherichia coli)与真核宿主酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)中对启动子活性做进一步研究,发现了pks2基因启动子可以在大肠杆菌和酿酒酵母中有效启动绿色荧光蛋白的表达,而且pks2基因启动子相较于pks1、pks3基因启动子具有更高的启动活性,显现出了其作为启动子用于基因工程研究的可操作性。 展开更多

关键词 启动子 热不对称交错pcr技术 裂殖壶菌 pks2基因 绿色荧光蛋白

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克隆启动子方法的比较及应用 被引量：16

10

作者 郝迪萩 赵琳 +1 位作者 陈李淼 李文滨 《东北农业大学学报》 CAS CSCD 北大核心 2010年第3期154-160,共7页

基因的表达调控已成为分子生物学研究热点之一。启动子是基因表达调控的重要顺式元件,启动子的克隆对于研究基因表达调控、构建基因工程载体、表达目的蛋白有着重要的意义。启动子克隆的方法很多,从常用的启动子陷阱技术筛选启动子到PC... 基因的表达调控已成为分子生物学研究热点之一。启动子是基因表达调控的重要顺式元件,启动子的克隆对于研究基因表达调控、构建基因工程载体、表达目的蛋白有着重要的意义。启动子克隆的方法很多,从常用的启动子陷阱技术筛选启动子到PCR方法的应用,基于PCR克隆启动子技术有:载体锚定PCR、反向PCR、接头PCR、交错热不对称PCR等,为克隆启动子提供了更可靠,更合理的方法。文章着重介绍了几种启动子的克隆方法,分析了它们的优缺点,并展望了今后的研究前景。 展开更多

关键词 启动子 反向pcr 锚定pcr 交错热不对称pcr

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天山雪莲rbcS基因启动子的克隆及序列分析 被引量：2

11

作者 张亚敏 杨晶 +1 位作者 王爱英 祝建波 《西北农业学报》 CAS CSCD 北大核心 2014年第5期146-152,共7页

以天山雪莲(S.involucrata Kar.et Kir.)为材料,根据已获得的天山雪莲1,5-二磷酸核酮糖羧化/加氧酶小亚基基因组序列设计引物,采用热不对称交错PCR(TAIL-PCR)和高效TAIL-PCR(hiTAIL-PCR)扩增到rbcS基因5′上游启动子序列,长为1 668bp。... 以天山雪莲(S.involucrata Kar.et Kir.)为材料,根据已获得的天山雪莲1,5-二磷酸核酮糖羧化/加氧酶小亚基基因组序列设计引物,采用热不对称交错PCR(TAIL-PCR)和高效TAIL-PCR(hiTAIL-PCR)扩增到rbcS基因5′上游启动子序列,长为1 668bp。用PlantCare和PLACE软件序列分析表明,该序列具有启动子的基本元件TATA-box、CA AT-box,包含多个胁迫诱导元件,如光诱导元件、赤霉素、低温诱导元件,昼夜节律调控元件等。构建pBI-PsikrbcS-GUS植物表达载体,并成功将其转化进入农杆菌。sikrbcS基因启动子的克隆与分析为进一步研究雪莲1,5-二磷酸核酮糖羧化/加氧酶小亚基基因的表达调控奠定了基础。 展开更多

关键词 天山雪莲 RBCS 热不对称交错pcr 高效TAIL-pcr 启动子 序列分析

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斑地锦查尔酮合酶基因及启动子的克隆与分析 被引量：3

12

作者 郭三保 宋美玲 +3 位作者 李灵心 尧子钊 桂明明 黄胜和 《生物技术通报》 CAS CSCD 北大核心 2023年第4期148-156,共9页

黄酮类化合物槲皮素是斑地锦主要药效成分之一,而查尔酮合酶(CHS)是槲皮素生物合成过程中的关键酶。为阐明斑地锦中槲皮素生物合成机制,本研究以斑地锦为材料,根据转录组测序数据结合3'RACE、Tail-PCR技术,克隆了CHS基因及其启动子... 黄酮类化合物槲皮素是斑地锦主要药效成分之一,而查尔酮合酶(CHS)是槲皮素生物合成过程中的关键酶。为阐明斑地锦中槲皮素生物合成机制,本研究以斑地锦为材料,根据转录组测序数据结合3'RACE、Tail-PCR技术,克隆了CHS基因及其启动子,将该基因命名为EmCHS(GenBank登录号为ON652865)。对EmCHS蛋白进行氨基酸序列比对、理化性质、跨膜结构域、亚细胞定位和系统进化树等分析,并采用实时荧光定量PCR技术检测EmCHS在不同生长期不同组织中的表达情况。结果显示,EmCHS开放阅读框(ORF)全长为1194 bp,编码397个氨基酸,EmCHS蛋白定位于细胞质,理论等电点为5.96,相对分子质量为43.48 kD,不含跨膜区域,为结构稳定的亲水性蛋白。氨基酸序列比对和系统进化树分析结果显示,EmCHS与同为大戟科的木薯氨基酸序列相似性最高(91.92%),符合植物分类学的特点。RT-qPCR实验表明,EmCHS基因在斑地锦不同生长期不同组织中均有表达,且存在明显差异,在生殖生长期叶内表达水平最低,生殖生长期根内表达水平最高。克隆到的EmCHS启动子(GenBank登录号为OP626754),长度为971 bp,生物信息学分析结果显示,其既含TATA-box、CAAT-box等基本序列,也含有MYB、MYC等转录因子结合位点、多个光反应元件(G-box等)和激素反应元件(ABRE等)等顺式作用元件。实验结果为进一步研究斑地锦CHS基因功能及表达调控奠定基础。 展开更多

关键词 斑地锦 CHS 启动子 克隆 热不对称交错pcr 生物信息学 基因表达

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水稻早抽穗突变体zc1的表型分析及候选基因鉴定 被引量：1

13

作者 郝宏姣 王鑫 +7 位作者 田瑶 兰志鹏 周诗晨 刘晓男 郑瑞 王馨翊 张泗举 栾维江 《天津师范大学学报（自然科学版）》 CAS 北大核心 2021年第3期47-52,共6页

从水稻T-DNA插入突变体库中筛选了一个早抽穗突变体zc1.为了克隆突变基因,对突变体株系进行了遗传分析,发现早抽穗表型和T-DNA共分离.利用热不对称交错PCR技术,扩增了T-DNA的侧翼序列.经序列比对发现,T-DNA插入到了一个富亮氨酸类受体激... 从水稻T-DNA插入突变体库中筛选了一个早抽穗突变体zc1.为了克隆突变基因,对突变体株系进行了遗传分析,发现早抽穗表型和T-DNA共分离.利用热不对称交错PCR技术,扩增了T-DNA的侧翼序列.经序列比对发现,T-DNA插入到了一个富亮氨酸类受体激酶(LRR-RLK)基因的外显子区,造成了基因功能的丧失.候选基因的克隆,为进一步解析水稻抽穗期形成的分子机理奠定了基础. 展开更多

关键词 水稻 抽穗期 热不对称交错pcr 类受体蛋白激酶

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添加餐厨废油脂培养酵母进行γ-癸内酯生物转化 被引量：1

14

作者 王荣霞 朱廷恒 汪琨 《食品与发酵工业》 CAS CSCD 北大核心 2019年第20期106-111,共6页

为了降低工业化生产γ-癸内酯(γ-decalactone,GDL)的成本,利用餐厨废弃油脂代替部分培养基成分培养解脂耶氏酵母(Yarrowia lipolytica),当添加餐厨废弃油脂6 g/L,葡萄糖由20 g/L降为12.5 g/L,酵母提取物由10 g/L降为5 g/L时,培养12 h... 为了降低工业化生产γ-癸内酯(γ-decalactone,GDL)的成本,利用餐厨废弃油脂代替部分培养基成分培养解脂耶氏酵母(Yarrowia lipolytica),当添加餐厨废弃油脂6 g/L,葡萄糖由20 g/L降为12.5 g/L,酵母提取物由10 g/L降为5 g/L时,培养12 h后获得与完全培养基相当的生物量。在Y.lipolytica中过表达酰基辅酶A氧化酶基因pox2获得工程菌,将蓖麻油酸转化为GDL产量达1.5 g/L,是出发菌株的2.2倍。利用分解油脂活性高的Y.lipolytica菌株(解脂假丝酵母Candida lipolytica CICC31223)与工程菌混菌降解餐厨废弃油脂并转化蓖麻油生产GDL,最佳条件为:当C.lipolytica与Y.lipolytica工程菌的接种比例为1∶10(体积比)、接种方式为先接种C.lipolytica,28℃,振荡培养(200 r/min)12 h后再接种Y.lipolytica,混菌发酵培养基中GDL产量达0.15 g/L,显著高于工程菌单菌发酵产量0.08 g/L。结果表明,餐厨废弃油脂是廉价的碳源,通过不同菌株的混菌发酵转化生产GDL的方法具有很大的工业化应用前景。 展开更多

关键词 餐厨废弃油脂 解脂耶氏酵母 解脂假丝酵母 Γ-癸内酯 交错式热不对称pcr

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