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CTAB法用于染病烟草植株中烟草丛顶病毒RNA的提取 被引量:6
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作者 左瑞娟 周雨泫 +3 位作者 李丽娟 董鹏 陈海如 李凡 《云南农业大学学报(自然科学版)》 CAS CSCD 北大核心 2011年第1期26-29,共4页
CTAB法是一种广泛用于从染病植物中提取总核酸,并用于后续相关病原物PCR检测的核酸提取法,已普遍运用于DNA病毒、植原体、细菌、真菌侵染植物的总DNA提取和病原检测。本文尝试将CTAB法用于一种由RNA病毒(烟草丛顶病毒)引起的烟草丛顶病... CTAB法是一种广泛用于从染病植物中提取总核酸,并用于后续相关病原物PCR检测的核酸提取法,已普遍运用于DNA病毒、植原体、细菌、真菌侵染植物的总DNA提取和病原检测。本文尝试将CTAB法用于一种由RNA病毒(烟草丛顶病毒)引起的烟草丛顶病染病组织总核酸的提取,以总核酸进行烟草丛顶病毒的RT-PCR检测,并与常规RNA病毒核酸提取法——Trizol法作比较。结果表明CTAB法和Trizol法提取的核酸用于烟草丛顶病毒RT-PCR检测时,均能扩增到目的条带,检测结果一致。在对复合侵染材料进行检测时发现,CTAB法提取的染病植物组织总核酸既包括DNA也包含RNA,有利于对DNA和RNA病原物同时进行检测;CTAB法所用试剂较Trizol法便宜,毒性小,且提取的核酸量较多、保存时间较长。因此CTAB法是一种高效、简便、经济的从烟草丛顶病染病组织中提取烟草丛顶病毒RNA的方法。 展开更多
关键词 CTAB法 TRIZOL法 核酸提取 草丛病毒
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从烟草丛顶病病原复合物中分离烟草扭脉病毒的方法 被引量:2
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作者 刘芳 马琨玲 +3 位作者 兰平秀 缪玉东 李晓静 李凡 《植物保护》 CAS CSCD 北大核心 2014年第4期101-106,共6页
烟草丛顶病是由烟草丛顶病毒(TBTV)、烟草丛顶病毒类似卫星RNA(Sat-TBTV)、烟草扭脉病毒(TVDV)和烟草扭脉病毒相关RNA(TVDVaRNA)复合侵染引起的一类特殊病害,目前尚不清楚这些病原物各自在病害症状形成和病害传播中的作用。本... 烟草丛顶病是由烟草丛顶病毒(TBTV)、烟草丛顶病毒类似卫星RNA(Sat-TBTV)、烟草扭脉病毒(TVDV)和烟草扭脉病毒相关RNA(TVDVaRNA)复合侵染引起的一类特殊病害,目前尚不清楚这些病原物各自在病害症状形成和病害传播中的作用。本文根据蚜虫传播烟草丛顶病复合病原物传毒特性的差异,探索了3种分离TVDV的生物学方法。方法A为将获得了烟草丛顶病复合病原物的蚜虫饥饿24h后,以单虫单苗的方式接到健康烟株上传毒,24h后灭虫。方法B为将无毒蚜虫饥饿2-4h后转接到感病烟株上饲毒48h,再以单虫单苗的方式接到健康烟株上传毒,24h后灭虫。方法C为将无毒蚜虫于感病烟株上饲毒48h后,以单虫单苗的方式接到健康烟株上传毒24h,此后每隔24h将蚜虫移到另一健康烟株上传毒,直到蚜虫死亡。其中方法 A和B均可将TVDV从烟草丛顶病病原复合体中分开,方法A操作简单、分离周期短且TVDV的分离效率高。单独TVDV侵染的烟株无明显的丛顶症状,叶片靠近主脉的地方会出现皱缩,生长后期叶片变得细长且顶端会发生扭曲。本试验可为研究TVDV与其他病原物、寄主植物和传播介体的相互作用提供很好的试验材料,也可为蚜虫传播的复合侵染病毒的生物学分离提供参考。 展开更多
关键词 草丛 病原复合物 草扭脉病毒 蚜虫 生物学分离
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烟草丛顶病伴随RNA临沧分离物基因组全长序列测定和结构分析 被引量:1
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作者 赵兴能 陈海如 莫笑晗 《安徽农业科学》 CAS 2013年第20期8480-8480,8524,共2页
[目的]对烟草丛顶病伴随RNA(TBTDaRNA)临沧分离物基因组全长序列进行测定,并对其进行结构分析。[方法]应用RT-PCR方法扩增烟草丛顶病伴随RNA临沧分离物的基因组,并进行全长序列的测定,同时对烟草丛顶病伴随RNA临沧分离物和龙陵分离物的... [目的]对烟草丛顶病伴随RNA(TBTDaRNA)临沧分离物基因组全长序列进行测定,并对其进行结构分析。[方法]应用RT-PCR方法扩增烟草丛顶病伴随RNA临沧分离物的基因组,并进行全长序列的测定,同时对烟草丛顶病伴随RNA临沧分离物和龙陵分离物的基因组进行比较分析。[结果]烟草丛顶病伴随RNA临沧分离物和龙陵分离物的基因组全长序列一致性为95.4%;ORF1a编码产物的氨基酸序列一致性为93.1%;ORF1b编码产物的氨基酸序列一致性为98.3%;3'端非编码区的核苷酸序列一致性为95.5%。[结论]该研究为研究TBTDaRNA的分子变异奠定了基础。 展开更多
关键词 草丛病伴随rna 基因组 序列测定
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烟草丛顶病毒编码的沉默抑制子初步鉴定 被引量:1
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作者 张润 王连春 +1 位作者 陈海如 李凡 《云南农业大学学报(自然科学版)》 CAS CSCD 北大核心 2011年第6期749-754,共6页
烟草丛顶病毒(Tobacco bushy top virus,TBTV)为幽影病毒属成员,能在烟草上造成严重危害。TBTV基因组编码4个ORF,其中ORF3和ORF4几乎完全重叠,可能在TBTV的致病性中发挥重要作用。分别将TBTV的ORF3和ORF4与载体pGR107连接,构建植物表达... 烟草丛顶病毒(Tobacco bushy top virus,TBTV)为幽影病毒属成员,能在烟草上造成严重危害。TBTV基因组编码4个ORF,其中ORF3和ORF4几乎完全重叠,可能在TBTV的致病性中发挥重要作用。分别将TBTV的ORF3和ORF4与载体pGR107连接,构建植物表达载体pGR107-ORF3,pGR107-ORF4。经农杆菌与含外源GFP基因的pGREEN208共浸润转GFP基因的本氏烟16c叶片,2~5 d后(days post-inoculation,dpi)在紫外灯下观察发现浸润区有明显绿色荧光,其中pGR107-ORF4在12 dpi后浸润区绿色荧光区域扩大,推断ORF4编码产物可能具有局部抑制本氏烟16c对外源GFP基因进行沉默的功能;而pGR107-ORF3浸润区绿色荧光逐渐恢复红色,GFP基因发生沉默,说明ORF3编码产物不具有抑制基因沉默的功能。进一步利用real-time PCR定量检测发现,pGR107-ORF4浸润15 dpi的本氏烟叶片中GFP RNA的含量要比仅接种pGR107的对照高,比未接种的本氏烟16c稍低。推断是因为ORF4编码蛋白抑制了植物对外源GFP RNA产生的沉默,使GFP得以在本氏烟内表达。由此进一步证实ORF4编码产物是TBTV的基因沉默抑制子。 展开更多
关键词 草丛病毒 ORF3 ORF4 沉默抑制子 鉴定
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烟草丛顶病毒云南不同分离物全基因组序列测定与分析
5
作者 吕婧 刘芳 +7 位作者 谭冠林 魏薇 尹朝先 马龑 陈小姣 和理淮 陈海如 李凡 《云南农业大学学报(自然科学版)》 CSCD 北大核心 2017年第3期410-420,共11页
【目的】探明烟草丛顶病毒(Tobacco bushy top virus,TBTV)云南不同分离物之间的遗传差异并完成系统进化分析。【方法】采用RT-PCR方法扩增获得云南不同地区10个TBTV分离物的全基因组序列。【结果】10个TBTV云南分离物的全基因组序列均... 【目的】探明烟草丛顶病毒(Tobacco bushy top virus,TBTV)云南不同分离物之间的遗传差异并完成系统进化分析。【方法】采用RT-PCR方法扩增获得云南不同地区10个TBTV分离物的全基因组序列。【结果】10个TBTV云南分离物的全基因组序列均为4 152 bp,基因组结构由4个开放阅读框(ORFs)构成,ORF2通过与ORF1发生-1位的移码(frameshift)表达融合蛋白,推测ORF1末端的GGAUUUU特征序列是确定ORF1与ORF2是否发生移码翻译的依据。各TBTV云南分离物全基因组序列的核苷酸序列同源性为84.9%~99.1%,其中来自德宏的分离物(TBTV-YDHo)变异最大。TBTV不同分离物间存在重组现象,且分离物之间亲缘关系与重组的发生有关,重组主要发生在变异较大的ORF1~ORF2区段。TBTV分离物的各区段中,ORF1和ORF1~ORF2变异最大,而ORF4和3'UTR较为保守。系统进化分析结果表明:TBTV作为幽影病毒属(Umbravirus)的成员之一,其与同属中的罂粟花叶病毒(Opium poppy mosaic virus,OPMV)亲缘关系最近,核苷酸序列同源性为61.1%~61.6%;与CMo V和CMo MV亲缘关系较远,同源性为54%~55.1%。除幽影病毒属外,TBTV与番茄丛矮病毒科(Tombusviridae)其他属的病毒核苷酸序列同源性为25.1%~49.8%;Tombusviridae中Umbravirus与香石竹环斑病毒属(Dianthovirus)的RNA2亲缘关系最远,与其他病毒属成员的亲缘关系都相对较近。【结论】TBTV云南各分离物之间存在一定的分子变异,有的存在重组现象;TBTV与OPMV亲缘关系最近。 展开更多
关键词 草丛病毒 幽影病毒 番茄丛矮病毒 序列分析 重组
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2012年-2022年TBTV、TVDV、TBTVsatRNA和TVDVaRNA在云南主要烟区的发生与分布
6
作者 杨亚辉 杨洁 +6 位作者 罗恒明 刘芳 吕婧 陈平 陈海如 陈小姣 李凡 《植物保护》 CAS CSCD 北大核心 2024年第2期296-302,331,共8页
烟草丛顶病(tobacco bushy top disease,TBTD)是一种由烟草丛顶病毒(tobacco bushy top virus,TBTV)及其卫星RNA(tobacco bushy top virus satellite RNA,TBTVsatRNA)和烟草扭脉病毒(tobacco vein distorting virus,TVDV)及其伴随RNA(to... 烟草丛顶病(tobacco bushy top disease,TBTD)是一种由烟草丛顶病毒(tobacco bushy top virus,TBTV)及其卫星RNA(tobacco bushy top virus satellite RNA,TBTVsatRNA)和烟草扭脉病毒(tobacco vein distorting virus,TVDV)及其伴随RNA(tobacco vein distorting virus associated RNA,TVDVaRNA)共同侵染引起的危险性病害,曾在云南很多烟区造成严重损失。本研究对烟草丛顶病及其相关病原物在云南烟草上的发生情况进行了多年的调查研究,力图对烟草丛顶病及其相关病原物的发生与分布进行追踪和分析。结果表明,2012年-2022年,烟草丛顶病在云南各大烟区仅零星发生,2019年以来已很难发现。烟草丛顶病的相关病原物主要在曾经暴发流行过病害的楚雄、保山和大理发现,且TBTV、TVDV、TBTVsatRNA和TVDVaRNA在烟草上并不总是同时被检出,其中引起烟草丛顶病典型症状的TBTV+TVDV+TBTVsatRNA+TVDVaRNA检出率在5%以下,TVDV的检出率最高,达30.44%,TBTVsatRNA的检出率最低,为7.68%。TBTV、TVDV、TBTVsatRNA和TVDVaRNA不能同时感染同一烟株可能是当前烟草丛顶病很少发生的主要原因。 展开更多
关键词 草丛病毒 草扭脉病毒 烟草丛顶病毒卫星rna 草扭脉病毒伴随rna 发生与分布
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云南烟草丛枝症病害研究 Ⅺ 病原研究:类病毒问题 被引量:3
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作者 杨根华 吴建宇 +9 位作者 程建勇 孔宝华 蔡红 秦西云 钏相俊 杨程 宋立明 陈观廉 李天飞 陈海如 《云南农业大学学报》 CAS CSCD 1999年第2期194-198,共5页
感染云南烟草丛枝症病害的病苗的细胞切片中观察到类似于旁壁体的质膜体,旁壁体是类病毒侵染植物形成的特征病变结构,但多次双向电泳实验均未检测到类病毒分子,质膜体的形成可能和莫笑晗等发现的与云南烟草丛枝症病害相关的稳定RN... 感染云南烟草丛枝症病害的病苗的细胞切片中观察到类似于旁壁体的质膜体,旁壁体是类病毒侵染植物形成的特征病变结构,但多次双向电泳实验均未检测到类病毒分子,质膜体的形成可能和莫笑晗等发现的与云南烟草丛枝症病害相关的稳定RNA有密切关系,但线性开环结构和失活温度说明其不具有类病毒核酸特征. 展开更多
关键词 云南 草丛枝症病害 病毒 低分子量rna
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津巴布韦烟草丛顶病病原物的分子鉴定
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作者 赵兴能 张未 +5 位作者 张丽芳 徐萍 李艳琼 张谊寒 陈海如 莫笑晗 《云南农业大学学报(自然科学版)》 CAS CSCD 北大核心 2022年第2期237-242,共6页
【目的】鉴定津巴布韦烟草丛顶病病原复合体组成。【方法】采集津巴布韦烟草丛顶病样品,对其病原复合体进行分子鉴定。【结果】烟草丛顶病毒津巴布韦分离物(tobacco bushy top virus-Zimbabwe,TBTV-Zimbabwe)在基因组RNA核苷酸序列水平... 【目的】鉴定津巴布韦烟草丛顶病病原复合体组成。【方法】采集津巴布韦烟草丛顶病样品,对其病原复合体进行分子鉴定。【结果】烟草丛顶病毒津巴布韦分离物(tobacco bushy top virus-Zimbabwe,TBTV-Zimbabwe)在基因组RNA核苷酸序列水平上与幽影病毒属(Umbravirus)其他成员的一致性为47.8%~94.6%,其中与埃塞俄比亚烟草丛顶病毒(Ethiopian tobacco bushy top virus,ETBTV)序列的一致性最高,为94.6%;与中国烟草丛顶病毒(tobacco bushy top virus,TBTV)序列的一致性仅为56.9%。分子系统进化分析表明:该病毒分离物与ETBTV同源性最高,为ETBTV的分离物,与TBTV为不同的病毒种。TBTV-Zimbabwe卫星RNA与ETBTV卫星RNA在基因组全长核苷酸序列水平上的一致性为93.9%,与GenBank数据库中除ETBTV卫星RNA之外的其他序列无同源性。研究还获得了津巴布韦烟草丛顶病病原复合体中马铃薯卷叶病毒(potato leafroll virus,PLRV)外壳蛋白基因部分核苷酸序列。【结论】津巴布韦烟草丛顶病病原复合体包含3种病毒组分,它们分别与埃塞俄比亚烟草丛顶病病原复合体的3种组分在病毒种的分类水平上一致。津巴布韦与中国烟草丛顶病病原物差异较大。 展开更多
关键词 津巴布韦 草丛 病原复合体 卫星rna 马铃薯卷叶病毒
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烟草扭脉病毒云南分离物rtp基因克隆及序列分析
9
作者 杨亚辉 杨洁 +3 位作者 陈平 陈海如 陈小姣 李凡 《植物医学》 2024年第2期38-48,共11页
探究来自云南不同时间和不同地区的烟草扭脉病毒(TVDV)各分离物间rtp基因序列差异,分析烟草丛顶病近年在田间发生趋势减缓的原因.以2020—2022年从云南楚雄、大理、保山及红河采集的染病烟草样品为材料,对TVDV的rtp基因进行扩增和序列分... 探究来自云南不同时间和不同地区的烟草扭脉病毒(TVDV)各分离物间rtp基因序列差异,分析烟草丛顶病近年在田间发生趋势减缓的原因.以2020—2022年从云南楚雄、大理、保山及红河采集的染病烟草样品为材料,对TVDV的rtp基因进行扩增和序列分析,共得到TVDV 7个不同分离物的rtp基因序列,长度均为2172 nt,包含618 nt的cp基因及1554 nt的rtd区;推导的TVDVRTP蛋白共编码722个氨基酸,其中包含CP蛋白的205个氨基酸,RTD的517个氨基酸.多重序列比对结果发现,获得的7个TVDV分离物与GenBank上登录的其他TVDV分离物间cp基因核苷酸序列一致性为98.71%~100%,不同TVDV分离物间CP蛋白的氨基酸序列一致性为98.05%~100%,存在4个氨基酸的差异.获得的7个TVDV分离物与GenBank数据库登录的其他TVDV分离物间rtd区核苷酸序列一致性为96.68%~99.81%,RTD蛋白的氨基酸序列一致性为96.52%~100%,存在39个氨基酸的差异.这些TVDV分离物rtp基因的变异可能会对TVDV的蚜虫传播效率产生影响,进而影响到烟草丛顶病在田间的发生与流行. 展开更多
关键词 草扭脉病毒 草丛 通读蛋白 分子变异 蚜虫传播
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TBTV卫星RNA不同分离物的序列测定及系统进化分析 被引量:2
10
作者 尹朝先 包娜 +2 位作者 冉志伟 陈海如 李凡 《云南农业大学学报(自然科学版)》 CAS CSCD 北大核心 2010年第6期797-801,共5页
利用RT-PCR方法对烟草丛顶病毒(tobacco bushy top virus,TBTV)卫星RNA不同分离物进行扩增和克隆测序,同时运用DNAMAN,MEGA,ClustalX等生物软件对TBTV和其它幽影病毒的卫星RNA核苷酸序列进行同源性比较,构建了幽影病毒属成员卫星RNA的... 利用RT-PCR方法对烟草丛顶病毒(tobacco bushy top virus,TBTV)卫星RNA不同分离物进行扩增和克隆测序,同时运用DNAMAN,MEGA,ClustalX等生物软件对TBTV和其它幽影病毒的卫星RNA核苷酸序列进行同源性比较,构建了幽影病毒属成员卫星RNA的系统进化树。E结果显示:TBTV不同分离物卫星RNA的核苷酸同源性为79.2%~99.0%。它们与幽影病毒属其它成员卫星RNA的核苷酸同源性为32.5%~44.1%。通过构建幽影病毒属成员卫星RNA的系统进化树可以看出:TBTV的卫星RNA与GRV的卫星RNA亲缘关系最近,与CMoMV的亲缘关系最远。 展开更多
关键词 草丛病毒 幽影病毒 卫星rna 序列分析 系统进化
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利用免疫荧光标记技术分析TVDV在介体蚜虫消化道内的分布 被引量:1
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作者 熊锋 吴维 +4 位作者 毛倩卓 刘琴利 陈海如 魏太云 李凡 《云南农业大学学报(自然科学版)》 CSCD 北大核心 2018年第2期208-212,共5页
【目的】制备TVDV CP蛋白抗血清,明确TVDV侵入蚜虫消化道的部位以及TVDV在蚜虫体内的分布。【方法】首先构建原核表达载体p DEST17-TVDV-CP,所得载体转化到Rocceta菌株中诱导表达TVDV CP蛋白,收集目的蛋白免疫小鼠制备TVDV CP特异性抗... 【目的】制备TVDV CP蛋白抗血清,明确TVDV侵入蚜虫消化道的部位以及TVDV在蚜虫体内的分布。【方法】首先构建原核表达载体p DEST17-TVDV-CP,所得载体转化到Rocceta菌株中诱导表达TVDV CP蛋白,收集目的蛋白免疫小鼠制备TVDV CP特异性抗血清。再利用制备的抗血清,通过免疫荧光技术标记TVDV,对TVDV在介体蚜虫中的分布解剖观察。【结果】TVDV CP蛋白在Rocceta菌株中,IPTG溶度为1、0.5、0.2、0.1 mmol/L,温度为28℃都能成功诱导表达;所得抗血清对TVDV侵染蚜虫总蛋白进行western blot检测,检测到大小约24 ku特异性条带;对免疫荧光标记的蚜虫消化道进行共聚焦观察,在蚜虫中肠上皮细胞检测到标记的TVDV荧光信号。【结论】制备了TVDV CP特异性抗血清,明确了TVDV分布于介体蚜虫消化道的中肠,由介体蚜虫以循回方式传播。 展开更多
关键词 草丛 草扭脉病毒 免疫荧光 蚜虫 中肠
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