化疗药物普遍缺乏特异性,开发一种可主动靶向递送化疗药物、对生物体无免疫原性的载体越来越受到人们的关注。本研究通过滚环扩增技术(rolling circle amplification,RCA)将合成的具有串联重复序列的DNA长单链与几条包含适配体AS1411的...化疗药物普遍缺乏特异性,开发一种可主动靶向递送化疗药物、对生物体无免疫原性的载体越来越受到人们的关注。本研究通过滚环扩增技术(rolling circle amplification,RCA)将合成的具有串联重复序列的DNA长单链与几条包含适配体AS1411的短链DNA杂交来构筑含有多价适配体的核酸载体(multivalent aptamer,Multi-Apt),利用其双螺旋结构大量负载抗肿瘤药物阿霉素(doxorubicin,Dox),用于靶向治疗小鼠黑色素瘤细胞(B16细胞)。通过琼脂糖凝胶电泳优化了RCA产物与短链的结合比例,利用酶标仪探究了Dox的负载及释放,并采用荧光显微镜、流式细胞术、酶标仪、CCK-8法和划痕实验考察了Multi-Apt-Dox对B16细胞的靶向性和生长抑制情况。实验结果显示,RCA产物与3条短链的最佳物质的量比为1∶50。荧光显微镜照片、流式细胞术和酶标仪实验结果表明,每个Multi-Apt可负载约200个Dox分子,而且其对B16细胞的亲和性是单价适配体的46倍。细胞实验表明,Multi-Apt在细胞内降解并释放药物后诱导产生选择性细胞毒性,从而极大降低Dox对正常细胞的毒性,为肿瘤治疗的靶向给药提供一种新的策略。展开更多
滚环扩增(rolling circle amplification,RCA)是新近发展起来的一种恒温核酸扩增方法。这种方法不仅可以直接扩增DNA和RNA,还可以实现对靶核酸的信号放大,灵敏度达到一个拷贝的核酸分子,因此在核酸检测中具有很大的应用价值和潜力。本...滚环扩增(rolling circle amplification,RCA)是新近发展起来的一种恒温核酸扩增方法。这种方法不仅可以直接扩增DNA和RNA,还可以实现对靶核酸的信号放大,灵敏度达到一个拷贝的核酸分子,因此在核酸检测中具有很大的应用价值和潜力。本文结合了滚环扩增技术在医药领域中的最新研究进展,介绍了滚环扩增的原理及其在医药领域中的应用。展开更多
目的应用滚环扩增(rolling circle amplification)技术建立对结核分枝杆菌耐药基因单碱基突变的快速检测方法。方法以结核分枝杆菌利福平耐药rpoB基因为研究对象,设计针对该基因常见突变位点的锁式探针。通过对突变型模板、野生型模板...目的应用滚环扩增(rolling circle amplification)技术建立对结核分枝杆菌耐药基因单碱基突变的快速检测方法。方法以结核分枝杆菌利福平耐药rpoB基因为研究对象,设计针对该基因常见突变位点的锁式探针。通过对突变型模板、野生型模板、非结核分枝杆菌基因序列模板及不同比例的突变型模板和野生型模板混合样本的检测,研究本实验方法的特异性和灵敏度。建立特异性地检测rpoB基因单碱基突变的滚环扩增方法。通过对临床样本的检测并与测序结果比较,评价该方法的临床应用价值。结果通过优化反应条件,应用滚环扩增技术能特异性的检测出结核分枝杆菌耐利福平rpoB基因的单碱基突变。通过对含有不同比例突变型模板的混合样本检测,最低能检测出1%突变型/野生型模板的样本。80株临床样本的检测与测序结果一致。结论滚环扩增技术特异性高、灵敏度高,无需特殊昂贵仪器且简单易操作,能够快速有效的检测出耐药结核的单碱基突变,是具有临床应用前景的方法。展开更多
结合恒温滚环扩增(rolling circle amlification,RCA)、单链特异性核酸外切酶Ⅰ(exonucleaseⅠ,ExoⅠ)和阳离子共轭聚合物(Cationic conjugated polymer,CCP)荧光共振能量转移(fluorescence reso-nance energy transfer,FRET)技术,建立...结合恒温滚环扩增(rolling circle amlification,RCA)、单链特异性核酸外切酶Ⅰ(exonucleaseⅠ,ExoⅠ)和阳离子共轭聚合物(Cationic conjugated polymer,CCP)荧光共振能量转移(fluorescence reso-nance energy transfer,FRET)技术,建立了一种特异、灵敏的均相检测microRNA(miRNA)的新方法.该方法应用荧光标记探针与RCA扩增的长链DNA产物杂交,当加入CCP时,其与杂交的标记探针通过静电力结合,发生高效的FRET.未杂交的标记探针利用ExoⅠ水解成单核苷酸,其与CCP相互作用力弱,不能发生有效的FRET.基于此,无需分离和洗涤步骤,实现了RCA扩增miRNA的均相检测.方法特异性好,灵敏度高,线性为0.5～20pmol/L,检出限为0.2pmol/L.方法为miRNA均相检测和原位成像分析以及临床诊断提供了新策略.展开更多
依据对虾黄头病毒（Yellow head virus,YHV）的非结构蛋白N基因序列,设计特异的锁式探针（Padlock probe,PLP）、检测探针及引物,建立YHV超分支滚环扩增（Hyper-branched rolling circle amplification,HRCA）检测试纸。灵敏度实验显示,...依据对虾黄头病毒（Yellow head virus,YHV）的非结构蛋白N基因序列,设计特异的锁式探针（Padlock probe,PLP）、检测探针及引物,建立YHV超分支滚环扩增（Hyper-branched rolling circle amplification,HRCA）检测试纸。灵敏度实验显示,YHV HRCA检测试纸能检测出的最低模板量为101拷贝,是RT-PCR灵敏度的100倍。特异性实验结果表明,该试纸能够特异性地对YHV进行检测。利用该检测试纸对进出口80批次虾样本进行检测,并将检测结果与常规RT-PCR相比较,结果显示,YHV HRCA检测试纸灵敏度方面优于常规RT-PCR方法,且操作简便、结果直观易读。展开更多
目的:基于滚环扩增技术(rolling circle amplification,RCA)结合免疫反应建立一种蛋白质的高灵敏检测方法。方法:根据双抗体夹心法原理,以链酶亲和素为桥梁,生物素修饰的单链寡核苷酸引物可以高亲和力地链接到生物素标记的免疫复合物上...目的:基于滚环扩增技术(rolling circle amplification,RCA)结合免疫反应建立一种蛋白质的高灵敏检测方法。方法:根据双抗体夹心法原理,以链酶亲和素为桥梁,生物素修饰的单链寡核苷酸引物可以高亲和力地链接到生物素标记的免疫复合物上,建立蛋白质的滚环扩增技术检测平台,并将其用于血管内皮细胞生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)的检测。结果:在优化实验条件下,对VEGF检测的灵敏度达到10fM。结论:与常规的酶标二抗体系ELISA法相比,本方法具有更高的灵敏度,适于低丰度蛋白质的检测,此方法的进一步完善将为疾病新的蛋白标志物的筛选以及临床诊断提供有力的工具。展开更多
目的探讨双循环线性滚环扩增(rolling circle amplification,RCA)检测HBV替诺福韦耐药基因突变位点的可行性。方法以HBV替诺福韦耐药基因突变位点为检测靶点,设计该位点的锁式探针以及包括该位点的HBV野生型、突变性模板。锁式探针与野...目的探讨双循环线性滚环扩增(rolling circle amplification,RCA)检测HBV替诺福韦耐药基因突变位点的可行性。方法以HBV替诺福韦耐药基因突变位点为检测靶点,设计该位点的锁式探针以及包括该位点的HBV野生型、突变性模板。锁式探针与野生型模板特异识别并结合,通过E.coli连接酶连接为闭合环形结构,加入引物启动第1轮RCA;扩增产物用HpaⅠ酶切游离出检测模板,重复上述过程进行第2轮RCA,琼脂糖凝胶电泳检测扩增产物;并对该方法的特异性、检测限及连接效率的影响因素进行初步探讨。结果探针与模板的杂交温度为45℃时,探针的环化连接效率最高、特异性最好。通过对不同浓度野生型模板的检测,单循环RCA的检测限为50pmol/L,双循环RCA的检测限为5pmol/L,检测灵敏度提高了10倍。结论初步建立了检测HBV替诺福韦基因耐药位点突变的双循环RCA方法。展开更多
文摘化疗药物普遍缺乏特异性,开发一种可主动靶向递送化疗药物、对生物体无免疫原性的载体越来越受到人们的关注。本研究通过滚环扩增技术(rolling circle amplification,RCA)将合成的具有串联重复序列的DNA长单链与几条包含适配体AS1411的短链DNA杂交来构筑含有多价适配体的核酸载体(multivalent aptamer,Multi-Apt),利用其双螺旋结构大量负载抗肿瘤药物阿霉素(doxorubicin,Dox),用于靶向治疗小鼠黑色素瘤细胞(B16细胞)。通过琼脂糖凝胶电泳优化了RCA产物与短链的结合比例,利用酶标仪探究了Dox的负载及释放,并采用荧光显微镜、流式细胞术、酶标仪、CCK-8法和划痕实验考察了Multi-Apt-Dox对B16细胞的靶向性和生长抑制情况。实验结果显示,RCA产物与3条短链的最佳物质的量比为1∶50。荧光显微镜照片、流式细胞术和酶标仪实验结果表明,每个Multi-Apt可负载约200个Dox分子,而且其对B16细胞的亲和性是单价适配体的46倍。细胞实验表明,Multi-Apt在细胞内降解并释放药物后诱导产生选择性细胞毒性,从而极大降低Dox对正常细胞的毒性,为肿瘤治疗的靶向给药提供一种新的策略。
文摘滚环扩增(rolling circle amplification,RCA)是新近发展起来的一种恒温核酸扩增方法。这种方法不仅可以直接扩增DNA和RNA,还可以实现对靶核酸的信号放大,灵敏度达到一个拷贝的核酸分子,因此在核酸检测中具有很大的应用价值和潜力。本文结合了滚环扩增技术在医药领域中的最新研究进展,介绍了滚环扩增的原理及其在医药领域中的应用。
文摘目的应用滚环扩增(rolling circle amplification)技术建立对结核分枝杆菌耐药基因单碱基突变的快速检测方法。方法以结核分枝杆菌利福平耐药rpoB基因为研究对象,设计针对该基因常见突变位点的锁式探针。通过对突变型模板、野生型模板、非结核分枝杆菌基因序列模板及不同比例的突变型模板和野生型模板混合样本的检测,研究本实验方法的特异性和灵敏度。建立特异性地检测rpoB基因单碱基突变的滚环扩增方法。通过对临床样本的检测并与测序结果比较,评价该方法的临床应用价值。结果通过优化反应条件,应用滚环扩增技术能特异性的检测出结核分枝杆菌耐利福平rpoB基因的单碱基突变。通过对含有不同比例突变型模板的混合样本检测,最低能检测出1%突变型/野生型模板的样本。80株临床样本的检测与测序结果一致。结论滚环扩增技术特异性高、灵敏度高,无需特殊昂贵仪器且简单易操作,能够快速有效的检测出耐药结核的单碱基突变,是具有临床应用前景的方法。
文摘结合恒温滚环扩增(rolling circle amlification,RCA)、单链特异性核酸外切酶Ⅰ(exonucleaseⅠ,ExoⅠ)和阳离子共轭聚合物(Cationic conjugated polymer,CCP)荧光共振能量转移(fluorescence reso-nance energy transfer,FRET)技术,建立了一种特异、灵敏的均相检测microRNA(miRNA)的新方法.该方法应用荧光标记探针与RCA扩增的长链DNA产物杂交,当加入CCP时,其与杂交的标记探针通过静电力结合,发生高效的FRET.未杂交的标记探针利用ExoⅠ水解成单核苷酸,其与CCP相互作用力弱,不能发生有效的FRET.基于此,无需分离和洗涤步骤,实现了RCA扩增miRNA的均相检测.方法特异性好,灵敏度高,线性为0.5～20pmol/L,检出限为0.2pmol/L.方法为miRNA均相检测和原位成像分析以及临床诊断提供了新策略.
文摘依据对虾黄头病毒（Yellow head virus,YHV）的非结构蛋白N基因序列,设计特异的锁式探针（Padlock probe,PLP）、检测探针及引物,建立YHV超分支滚环扩增（Hyper-branched rolling circle amplification,HRCA）检测试纸。灵敏度实验显示,YHV HRCA检测试纸能检测出的最低模板量为101拷贝,是RT-PCR灵敏度的100倍。特异性实验结果表明,该试纸能够特异性地对YHV进行检测。利用该检测试纸对进出口80批次虾样本进行检测,并将检测结果与常规RT-PCR相比较,结果显示,YHV HRCA检测试纸灵敏度方面优于常规RT-PCR方法,且操作简便、结果直观易读。
文摘目的探讨双循环线性滚环扩增(rolling circle amplification,RCA)检测HBV替诺福韦耐药基因突变位点的可行性。方法以HBV替诺福韦耐药基因突变位点为检测靶点,设计该位点的锁式探针以及包括该位点的HBV野生型、突变性模板。锁式探针与野生型模板特异识别并结合,通过E.coli连接酶连接为闭合环形结构,加入引物启动第1轮RCA;扩增产物用HpaⅠ酶切游离出检测模板,重复上述过程进行第2轮RCA,琼脂糖凝胶电泳检测扩增产物;并对该方法的特异性、检测限及连接效率的影响因素进行初步探讨。结果探针与模板的杂交温度为45℃时,探针的环化连接效率最高、特异性最好。通过对不同浓度野生型模板的检测,单循环RCA的检测限为50pmol/L,双循环RCA的检测限为5pmol/L,检测灵敏度提高了10倍。结论初步建立了检测HBV替诺福韦基因耐药位点突变的双循环RCA方法。
