目的:研究Kinesin-3家族成员蛋白(Kinesin-3 family member1A,KIF1A)对氧糖剥夺-再灌注诱导的PC12细胞活力、自噬和凋亡的影响,为进一步研究KIF1A在脊髓缺血再灌注损伤治疗方面提供理论依据。方法:PC12细胞(美国ATCC公司)分为四组:A组,...目的:研究Kinesin-3家族成员蛋白(Kinesin-3 family member1A,KIF1A)对氧糖剥夺-再灌注诱导的PC12细胞活力、自噬和凋亡的影响,为进一步研究KIF1A在脊髓缺血再灌注损伤治疗方面提供理论依据。方法:PC12细胞(美国ATCC公司)分为四组:A组,对照组,无处理;B组,氧糖剥夺再灌注(oxygen glucose deprivation/reperfusion,OGD/R)组,PC12细胞用无糖DMEM培养基,于含混合气体(95%N2和5%CO2)的37℃恒温箱内密闭缺氧培养4h;C组,pcDNA3.1空质粒组,PC12细胞转染pcDNA3.1空质粒48h,进行OGD/R处理;D组,pcDNA3.1-KIF1A质粒组,PC12细胞转染pcDNA3.1-KIF1A质粒48h,进行OGD/R处理。B、C、D组经OGD/R处理后,更换常规培养基,正常孵育24h,收集细胞总RNA及蛋白质,进行实时定量PCR(quantitative real-time PCR,qRT PCR)和Western blot检测KIF1A mRNA和蛋白的表达情况;CCK8检测细胞存活率变化;凋亡ELISA及Caspase-3活性检测试剂盒检测细胞凋亡及Caspase-3活性;Western blot检测各组自噬相关基因LC3-Ⅰ、LC3-Ⅱ、P62以及哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin,mTOR)信号通路的蛋白表达变化。结果:与A组(1.00±0.00)相比,B组细胞KIF1A mRNA(0.41±0.05)和蛋白表达水平(0.52±0.07,P<0.05)显著下调;细胞活力[(51.60±7.35)%,P<0.05]显著降低。与B组(1.00±0.00)相比,C组空质粒对KIF1A mRNA(0.91±0.13)及蛋白质(1.08±0.08)表达,细胞活力[(51.60±7.35)%vs(47.30±4.16)%],细胞凋亡(1.95±0.18 vs 2.08±0.16,P>0.05)等无显著影响。而D组KIF1A过表达后能显著上调KIF1A mRNA(2.63±0.16)以及蛋白表达(2.51±0.18,P<0.05),显著缓解OGD/R引起的细胞存活率下降[(51.60±7.35)%vs(86.40±9.03)%]及凋亡[1.95±0.18 vs 1.36±0.12,P<0.05];与B组相比,D组自噬相关蛋白LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ的比值(1.68±0.14 vs 1.19±0.09,P<0.05)及pmTOR的表达(1.00±0.00 vs 1.26±0.02,P<0.05)显著受抑制,P62表达显著升高(0.53±0.05 vs 0.89±0.09,P<0.05)。结论:KIF1A过表达可促进缺血再灌注损伤诱导的PC12细胞存活、抑制细胞自噬与凋亡,其机制可能与抑制mTOR通路相关。展开更多
目的:检测先天性双侧输精管缺如(congenital bilateral absence of the vas deferens,CBAVD)患者中囊性纤维化跨膜转导调节因子(cystic fibrosis transmembrane conductance regulator,CFTR)基因和CBAVD易感基因的突变情况,探讨它们与CB...目的:检测先天性双侧输精管缺如(congenital bilateral absence of the vas deferens,CBAVD)患者中囊性纤维化跨膜转导调节因子(cystic fibrosis transmembrane conductance regulator,CFTR)基因和CBAVD易感基因的突变情况,探讨它们与CBAVD发病风险的相关性。方法:对13例诊断为孤立发生的CBAVD患者的致病基因CFTR及易感基因黏附型G蛋白偶联受体G2(adhesion G protein-coupled receptor G2,ADGRG2)、上皮细胞钠离子通道β亚单位(sodium channel epithelial 1 subunit beta,SCNN1B)和碳酸酐酶12(carbonic anhydrase,CA12)和溶质载体家族9成员3(solute carrier family 9 member A3,SLC9A3)行全外显子测序及Sanger测序验证,针对CFTR基因多态性位点、内含子及侧翼序列行聚合酶链式反应(polymerase chain reaction,PCR)扩增后用Sanger测序,并运用生物信息学方法对CBAVD易感基因新发突变进行保守性分析和有害性预测。对13例CBAVD患者中1例患者的家系进行遗传学分析,评估子代遗传风险。结果:外显子测序发现13例CBAVD患者中,只有6例患者检测到CFTR基因外显子突变,有6种错义突变:c.2684G>A(p.Ser895Asn)、c.4056G>C(p.Gln1352His)、c.2812G>T(p.Val938Leu)、c.3068T>G(p.Ile1023Arg)、c.374T>C(p.Ile125Thr)、c.1666A>G(p.Ile556Val),1种无义突变:c.1657C>T(p.Arg553Ter),这6例患者中有2例患者同时还存在CFTR的纯合p.V470位点,另外7例患者未检测出CFTR基因外显子区域的突变。13例CBAVD患者中,3例患者携带纯合p.V470的多态性位点,4例患者携带5T等位基因,2例患者携带TG13等位基因,10例患者携带c.-966T>G位点。4例CBAVD患者同时携带以上CFTR基因突变位点中的2~3个位点。13例患者中CBAVD易感基因突变情况:1种ADGRG2错义突变c.2312A>G(p.Asn771Ser),2种SLC9A3错义突变c.2395T>C(p.Cys799Arg)、c.493G>A(p.Val165Ile),1种SCNN1B错义突变c.1514G>A(p.Arg505His)和1种CA12错义突变c.1061C>T(p.Ala354Val),其中,SLC9A3基因的c.493G>A(p.Val165Ile)突变位点是首次在CBAVD患者中被发现,以上5种突变位点在gnomAD数据库中的人群变异频率极低,属于罕见突变,用Mutation Taster和Polyphen-2软件预测显示SLC9A3基因的c.493G>A(p.Val165Ile)位点和SCNN1B基因的c.1514G>A(p.Arg505His)位点的有害性等级为致病突变。1例家系遗传分析发现,先证者的c.1657C>T(p.Arg553Ter)突变为新生突变,先证者父亲、母亲均未携带该突变,先证者及其配偶通过辅助生殖技术孕育1女婴,该女婴遗传了先证者的致病性突变c.1657C>T(p.Arg553Ter)。结论:CFTR基因突变仍然是中国CBAVD患者的主要致病原因,但突变的分布与频率与国内外其他研究的数据存在一定差异,需要进一步扩充中国CBAVD患者的CFTR突变谱;ADGRG2、SLC9A3、SCNN1B和CA12易感基因可能解释部分无CFTR突变的CBAVD病例;CBAVD患者多无特殊临床表现,建议临床医生确诊前对患者行进一步的体格检查,并结合其阴囊超声或经直肠超声检查;建议将CFTR基因突变检测应用于辅助生殖前的遗传学筛查,降低子代罹患CBAVD及囊性纤维化的风险。展开更多
目的:探讨甲硫氨酸代谢相关基因在食管鳞状细胞癌(esophageal squamous cell carcinoma,ESCC)中的表达情况,研究甲硫氨酸和溶质载体家族43成员2(solute carrier family 43 member 2,SLC43A2)基因的表达对ESCC细胞迁移和侵袭的影响。方法...目的:探讨甲硫氨酸代谢相关基因在食管鳞状细胞癌(esophageal squamous cell carcinoma,ESCC)中的表达情况,研究甲硫氨酸和溶质载体家族43成员2(solute carrier family 43 member 2,SLC43A2)基因的表达对ESCC细胞迁移和侵袭的影响。方法:利用生物信息学分析ESCC组织与邻近正常组织的甲硫氨酸代谢关键基因的表达情况,Kaplan-Meier生存曲线分析其表达在ESCC患者预后中的价值;聚类分析揭示不同表达模式对ESCC患者总体生存期和肿瘤微环境的影响;富集分析寻找ESCC中与甲硫氨酸和SLC43A2基因紧密关联的生物学进程;免疫组织化学染色检测ESCC组织和邻近正常组织中SLC43A2蛋白的表达情况;RT-qPCR和Western blot法检测干扰ESCC细胞SLC43A2效率;Transwell实验检测甲硫氨酸限制(methionine restriction)或干扰SLC43A2后ESCC细胞迁移和侵袭能力。结果:大部分甲硫氨酸代谢相关通路中的关键酶和SLC43A2基因在ESCC肿瘤组织中高表达(P<0.05),并且这些差异基因的表达对ESCC患者的预后具有显著影响(P<0.05);聚类分析显示高表达SLC43A2基因的A簇患者预后差,肿瘤微环境中免疫细胞种类和数量显著低于B簇;富集分析显示高表达SLC43A2基因组中上皮间充质转化(epithelial-mesenchymal transition,EMT)通路信号分子显著富集(P<0.01)。此外,限制甲硫氨酸或敲减SLC43A2可抑制ESCC细胞的迁移和侵袭(P<0.01)。结论:ESCC组织中甲硫氨酸代谢活跃,SLC43A2基因在ESCC组织中高表达与患者不良预后相关,SLC43A2促进ESCC细胞迁移和侵袭。展开更多
目的:探讨微小RNA-144-3p(microRNA-144-3p,miR-144-3p)在卵巢癌细胞对顺铂耐药中的作用并分析其作用机制与溶质载体家族7成员11(solute carrier family 7 member 11,SLC7A11)和铁死亡是否有关。方法:将miR-144-3p mimic转染入耐顺铂人...目的:探讨微小RNA-144-3p(microRNA-144-3p,miR-144-3p)在卵巢癌细胞对顺铂耐药中的作用并分析其作用机制与溶质载体家族7成员11(solute carrier family 7 member 11,SLC7A11)和铁死亡是否有关。方法:将miR-144-3p mimic转染入耐顺铂人卵巢癌细胞株A2780/DDP和SKOV3/DDP后,RT-qPCR法检测miR-144-3p的表达丰度;CCK-8法检测细胞对顺铂的敏感性;集落形成实验测定细胞增殖情况;试剂盒法评估细胞内丙二醛(malondialdehyde,MDA)和谷胱甘肽(glutathione,GSH)的水平;Fe^(2+)探针及活性氧簇(reactive oxygen species,ROS)荧光探针检测细胞内Fe^(2+)含量及ROS水平;透射电子显微镜观察线粒体形态;双萤光素酶报告基因实验验证miR-144-3p与SLC7A11之间的靶向结合。建立耐药细胞株A2780/DDP异种移植瘤模型,体内评估miR-144-3p对肿瘤生长的影响。结果:耐药细胞株A2780/DDP和SKOV3/DDP中的miR-144-3p表达显著低于亲本细胞株A2780和SKOV3(P<0.05)。转染miR-144-3p mimic可抑制细胞增殖,增强耐药细胞株对顺铂的敏感性(P<0.01)。双萤光素酶报告基因实验结果显示SLC7A11是miR-144-3p的作用靶点。过表达SLC7A11可通过铁死亡途径逆转miR-144-3p对细胞增殖及化疗敏感性的作用(P<0.05)。异种移植瘤实验结果表明miR-144-3p可显著抑制瘤体生长,抑制SLC7A11及谷胱甘肽过氧化物酶4(glutathione peroxidase 4,GPX4)蛋白表达(P<0.01),提高4-羟基壬烯醛(4-hy-droxynonenal,4-HNE)水平(P<0.01)。结论:miR-144-3p通过靶向SLC7A11而增强耐药卵巢癌细胞对顺铂的敏感性,其作用机制可能涉及铁死亡过程。展开更多
目的观察淫黄葛合剂对APP_(swe)/PS1_(dE9)小鼠行为及海马胱氨酸/谷氨酸反向转运体的表达影响。方法6只8月龄雄性C57BL/6J小鼠为正常组,18只8月龄雄性APP_(swe)/PS1_(dE9)小鼠随机分为模型组、合剂组、地拉罗司(deferasirox,DFX)组,每组...目的观察淫黄葛合剂对APP_(swe)/PS1_(dE9)小鼠行为及海马胱氨酸/谷氨酸反向转运体的表达影响。方法6只8月龄雄性C57BL/6J小鼠为正常组,18只8月龄雄性APP_(swe)/PS1_(dE9)小鼠随机分为模型组、合剂组、地拉罗司(deferasirox,DFX)组,每组6只。正常组、模型组给予蒸馏水灌胃,合剂组灌胃淫黄葛合剂(淫羊藿苷120 mg·kg^(-1)、黄芪甲苷80 mg·kg^(-1)、葛根素80 mg·kg^(-1)),DFX组灌胃DFX(100 mg·kg^(-1)),每日1次,干预2个月。利用八臂迷宫实验检测各组小鼠空间、学习记忆能力;免疫荧光观察正常组、模型组小鼠海马CA3区溶质载体家族7成员11(solute carrier family 7 member 11,SLC7A11)与溶质载体家族3成员2(solute carrier family 3 member 2,SLC3A2)的表达水平;Western blot和real time q-PCR检测各组小鼠海马SLC7A11、SLC3A2蛋白及mRNA表达水平。结果与正常组相比,模型组小鼠空间学习记忆能力下降,海马CA3区SLC7A11、SLC3A2表达下降(P<0.05),海马SLC7A11、SLC3A2蛋白及mRNA表达下降(P<0.05);与模型组相比,合剂组、DFX组空间学习记忆能力提升,海马SLC7A11、SLC3A2蛋白及mRNA表达上升(P<0.05);合剂组与DFX组各项指标差异无统计学意义(P>0.05)。结论淫黄葛合剂可以改善APP_(swe)/PS1_(dE9)小鼠的行为障碍,其机制与促进海马SLC7A11、SLC3A2的表达有关。展开更多
文摘目的:研究Kinesin-3家族成员蛋白(Kinesin-3 family member1A,KIF1A)对氧糖剥夺-再灌注诱导的PC12细胞活力、自噬和凋亡的影响,为进一步研究KIF1A在脊髓缺血再灌注损伤治疗方面提供理论依据。方法:PC12细胞(美国ATCC公司)分为四组:A组,对照组,无处理;B组,氧糖剥夺再灌注(oxygen glucose deprivation/reperfusion,OGD/R)组,PC12细胞用无糖DMEM培养基,于含混合气体(95%N2和5%CO2)的37℃恒温箱内密闭缺氧培养4h;C组,pcDNA3.1空质粒组,PC12细胞转染pcDNA3.1空质粒48h,进行OGD/R处理;D组,pcDNA3.1-KIF1A质粒组,PC12细胞转染pcDNA3.1-KIF1A质粒48h,进行OGD/R处理。B、C、D组经OGD/R处理后,更换常规培养基,正常孵育24h,收集细胞总RNA及蛋白质,进行实时定量PCR(quantitative real-time PCR,qRT PCR)和Western blot检测KIF1A mRNA和蛋白的表达情况;CCK8检测细胞存活率变化;凋亡ELISA及Caspase-3活性检测试剂盒检测细胞凋亡及Caspase-3活性;Western blot检测各组自噬相关基因LC3-Ⅰ、LC3-Ⅱ、P62以及哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin,mTOR)信号通路的蛋白表达变化。结果:与A组(1.00±0.00)相比,B组细胞KIF1A mRNA(0.41±0.05)和蛋白表达水平(0.52±0.07,P<0.05)显著下调;细胞活力[(51.60±7.35)%,P<0.05]显著降低。与B组(1.00±0.00)相比,C组空质粒对KIF1A mRNA(0.91±0.13)及蛋白质(1.08±0.08)表达,细胞活力[(51.60±7.35)%vs(47.30±4.16)%],细胞凋亡(1.95±0.18 vs 2.08±0.16,P>0.05)等无显著影响。而D组KIF1A过表达后能显著上调KIF1A mRNA(2.63±0.16)以及蛋白表达(2.51±0.18,P<0.05),显著缓解OGD/R引起的细胞存活率下降[(51.60±7.35)%vs(86.40±9.03)%]及凋亡[1.95±0.18 vs 1.36±0.12,P<0.05];与B组相比,D组自噬相关蛋白LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ的比值(1.68±0.14 vs 1.19±0.09,P<0.05)及pmTOR的表达(1.00±0.00 vs 1.26±0.02,P<0.05)显著受抑制,P62表达显著升高(0.53±0.05 vs 0.89±0.09,P<0.05)。结论:KIF1A过表达可促进缺血再灌注损伤诱导的PC12细胞存活、抑制细胞自噬与凋亡,其机制可能与抑制mTOR通路相关。
文摘目的:检测先天性双侧输精管缺如(congenital bilateral absence of the vas deferens,CBAVD)患者中囊性纤维化跨膜转导调节因子(cystic fibrosis transmembrane conductance regulator,CFTR)基因和CBAVD易感基因的突变情况,探讨它们与CBAVD发病风险的相关性。方法:对13例诊断为孤立发生的CBAVD患者的致病基因CFTR及易感基因黏附型G蛋白偶联受体G2(adhesion G protein-coupled receptor G2,ADGRG2)、上皮细胞钠离子通道β亚单位(sodium channel epithelial 1 subunit beta,SCNN1B)和碳酸酐酶12(carbonic anhydrase,CA12)和溶质载体家族9成员3(solute carrier family 9 member A3,SLC9A3)行全外显子测序及Sanger测序验证,针对CFTR基因多态性位点、内含子及侧翼序列行聚合酶链式反应(polymerase chain reaction,PCR)扩增后用Sanger测序,并运用生物信息学方法对CBAVD易感基因新发突变进行保守性分析和有害性预测。对13例CBAVD患者中1例患者的家系进行遗传学分析,评估子代遗传风险。结果:外显子测序发现13例CBAVD患者中,只有6例患者检测到CFTR基因外显子突变,有6种错义突变:c.2684G>A(p.Ser895Asn)、c.4056G>C(p.Gln1352His)、c.2812G>T(p.Val938Leu)、c.3068T>G(p.Ile1023Arg)、c.374T>C(p.Ile125Thr)、c.1666A>G(p.Ile556Val),1种无义突变:c.1657C>T(p.Arg553Ter),这6例患者中有2例患者同时还存在CFTR的纯合p.V470位点,另外7例患者未检测出CFTR基因外显子区域的突变。13例CBAVD患者中,3例患者携带纯合p.V470的多态性位点,4例患者携带5T等位基因,2例患者携带TG13等位基因,10例患者携带c.-966T>G位点。4例CBAVD患者同时携带以上CFTR基因突变位点中的2~3个位点。13例患者中CBAVD易感基因突变情况:1种ADGRG2错义突变c.2312A>G(p.Asn771Ser),2种SLC9A3错义突变c.2395T>C(p.Cys799Arg)、c.493G>A(p.Val165Ile),1种SCNN1B错义突变c.1514G>A(p.Arg505His)和1种CA12错义突变c.1061C>T(p.Ala354Val),其中,SLC9A3基因的c.493G>A(p.Val165Ile)突变位点是首次在CBAVD患者中被发现,以上5种突变位点在gnomAD数据库中的人群变异频率极低,属于罕见突变,用Mutation Taster和Polyphen-2软件预测显示SLC9A3基因的c.493G>A(p.Val165Ile)位点和SCNN1B基因的c.1514G>A(p.Arg505His)位点的有害性等级为致病突变。1例家系遗传分析发现,先证者的c.1657C>T(p.Arg553Ter)突变为新生突变,先证者父亲、母亲均未携带该突变,先证者及其配偶通过辅助生殖技术孕育1女婴,该女婴遗传了先证者的致病性突变c.1657C>T(p.Arg553Ter)。结论:CFTR基因突变仍然是中国CBAVD患者的主要致病原因,但突变的分布与频率与国内外其他研究的数据存在一定差异,需要进一步扩充中国CBAVD患者的CFTR突变谱;ADGRG2、SLC9A3、SCNN1B和CA12易感基因可能解释部分无CFTR突变的CBAVD病例;CBAVD患者多无特殊临床表现,建议临床医生确诊前对患者行进一步的体格检查,并结合其阴囊超声或经直肠超声检查;建议将CFTR基因突变检测应用于辅助生殖前的遗传学筛查,降低子代罹患CBAVD及囊性纤维化的风险。
文摘目的观察淫黄葛合剂对APP_(swe)/PS1_(dE9)小鼠行为及海马胱氨酸/谷氨酸反向转运体的表达影响。方法6只8月龄雄性C57BL/6J小鼠为正常组,18只8月龄雄性APP_(swe)/PS1_(dE9)小鼠随机分为模型组、合剂组、地拉罗司(deferasirox,DFX)组,每组6只。正常组、模型组给予蒸馏水灌胃,合剂组灌胃淫黄葛合剂(淫羊藿苷120 mg·kg^(-1)、黄芪甲苷80 mg·kg^(-1)、葛根素80 mg·kg^(-1)),DFX组灌胃DFX(100 mg·kg^(-1)),每日1次,干预2个月。利用八臂迷宫实验检测各组小鼠空间、学习记忆能力;免疫荧光观察正常组、模型组小鼠海马CA3区溶质载体家族7成员11(solute carrier family 7 member 11,SLC7A11)与溶质载体家族3成员2(solute carrier family 3 member 2,SLC3A2)的表达水平;Western blot和real time q-PCR检测各组小鼠海马SLC7A11、SLC3A2蛋白及mRNA表达水平。结果与正常组相比,模型组小鼠空间学习记忆能力下降,海马CA3区SLC7A11、SLC3A2表达下降(P<0.05),海马SLC7A11、SLC3A2蛋白及mRNA表达下降(P<0.05);与模型组相比,合剂组、DFX组空间学习记忆能力提升,海马SLC7A11、SLC3A2蛋白及mRNA表达上升(P<0.05);合剂组与DFX组各项指标差异无统计学意义(P>0.05)。结论淫黄葛合剂可以改善APP_(swe)/PS1_(dE9)小鼠的行为障碍,其机制与促进海马SLC7A11、SLC3A2的表达有关。
