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富硒海洋球石藻(Emiliania huxleyi)的培养及其硒蛋白的初步分离纯化 被引量：7
1
作者 刘静雯 张稚兰 +1 位作者 杜翠红 黄志勇 《海洋与湖沼》 CAS CSCD 北大核心 2010年第6期879-884,共6页
在不同浓度亚硒酸钠(Na2SeO3)条件下培养海洋球石藻,分析其生长和富集硒情况,并采用(NH4)2SO4分级盐析、DEAE-Sepharose离子交换柱层析和SephacrylS-200凝胶过滤层析方法,对球石藻硒蛋白进行了初步分离纯化。结果表明,在本实验条件下,... 在不同浓度亚硒酸钠(Na2SeO3)条件下培养海洋球石藻,分析其生长和富集硒情况,并采用(NH4)2SO4分级盐析、DEAE-Sepharose离子交换柱层析和SephacrylS-200凝胶过滤层析方法,对球石藻硒蛋白进行了初步分离纯化。结果表明,在本实验条件下,不添加外源硒的f/2培养基本底硒浓度(约3.2nmol/L)为海洋球石藻最佳生长和富硒的硒浓度,其细胞内硒含量可达到6475?g/g干重。离子交换和凝胶层析分离的含硒蛋白结合的最高硒含量分别达到392.3ng/mg和663.5ng/mg蛋白。SDS-PAGE纯度鉴定显示,在分子量分别约为41.3kDa和30.1kDa处各有单一电泳条带。结果提示,海洋球石藻能在环境硒浓度极低的条件下大量吸收硒并将大部分无机硒转化为硒蛋白。富硒能力较强的海洋球石藻有望作为一种新的有机硒资源,对开发含硒安全性食品具有很大的应用潜力。 展开更多
关键词 海洋球石藻 富硒培养 硒蛋白分离纯化
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海洋球石藻Emiliania huxleyi(Prymnesiophyceae)病毒主要外壳蛋白基因的克隆与序列分析 被引量：4
2
作者 张稚兰 刘静雯 +2 位作者 董双林 苏国成 张彦锋 《海洋与湖沼》 CAS CSCD 北大核心 2009年第2期152-158,共7页
在实验室纯培养条件下,用过滤的海洋球石藻特异性病毒(Emiliania huxleyi virus,EhV)EhV-99B1株感染球石藻(E. huxleyi,Eh),建立病毒与宿主之间稳定的感染体系,病毒裂解滤液经卷式切向流超滤和PEG8000浓缩、CsCl密度梯度离心,获得足量... 在实验室纯培养条件下,用过滤的海洋球石藻特异性病毒(Emiliania huxleyi virus,EhV)EhV-99B1株感染球石藻(E. huxleyi,Eh),建立病毒与宿主之间稳定的感染体系,病毒裂解滤液经卷式切向流超滤和PEG8000浓缩、CsCl密度梯度离心,获得足量高纯度的病毒颗粒。根据已报道的其它EhV株系主要外壳蛋白(MCP)基因内保守片段设计合成一对特异引物,从EhV-99B1病毒基因组中克隆到了长度约为300bp的病毒外壳蛋白基因保守片段。该片段与pBS-T载体连接后转化Escherichia coli DH5α,对筛选到的阳性克隆进行序列测定与分析。结果表明,该克隆片段与GenBank中EhV163(AF453851)分离株的同源性最高,该区域内的核苷酸与对应推导的氨基酸序列同源性均为100%,证实获得的DNA片段是EhV-99B1的外壳蛋白基因;与EhV203(AF453855)分离株的核苷酸及氨基酸序列的同源性较低,分别为93%和100%。表明该病毒在自然海域中分布广泛并具有一定的多态性,同时在进化上也存在相当的复杂性。因此,MCP基因可以作为一种新的分子遗传标记以区分自然群落中EhV的不同基因型,对于理解海洋球石藻类病毒与宿主之间复杂的相互作用关系将是一个十分有价值的工具。 展开更多
关键词 海洋球石藻病毒(EhV) 病毒主要外壳蛋白(MCP) 基因克隆与序列分析
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海洋球石藻(Emiliania huxleyi)病毒硫氧还蛋白(TRX)基因的克隆及生物信息学分析 被引量：5
3
作者 张彦锋 刘静雯 +1 位作者 张稚兰 董双林 《海洋与湖沼》 CAS CSCD 北大核心 2010年第2期293-300,共8页
首次从海洋球石藻病毒(Emiliania huxleyi virus-EhV99B1)中克隆了硫氧还蛋白(Trx)基因(该序列已提交GenBank,登录号:GU109280)。系统进化关系分析表明:EhV99B1-Trx与GenBank中已报道的EhV86-Trx(NC_007346)有很高的同源性,核酸及其推... 首次从海洋球石藻病毒(Emiliania huxleyi virus-EhV99B1)中克隆了硫氧还蛋白(Trx)基因(该序列已提交GenBank,登录号:GU109280)。系统进化关系分析表明:EhV99B1-Trx与GenBank中已报道的EhV86-Trx(NC_007346)有很高的同源性,核酸及其推导的氨基酸序列的同源性分别为98%和100%,而与其它物种的Trx序列同源性仅为9.8%-18.8%。采用生物信息学方法和工具分析了EhV99B1-Trx的生化参数,预测了该蛋白的高级结构。结果表明:(1)EhV99B1-Trx基因的开放阅读框全长591bp,编码196个氨基酸,蛋白的相对分子量为22.1kDa,理论等电点为5.27;(2)EhV-99B1-Trx N端蛋白结构域具有保守的Cys-Gly-Pro-Cys(CGPC)硫氧还蛋白氧化还原活性位点氨基酸基序;(3)对该蛋白二、三级结构分析预测结果进一步证实EhV99B1-Trx基因编码的为一种新型的硫氧还蛋白家族成员。 展开更多
关键词 海洋球石藻病毒(EhV) 硫氧还蛋白(Trx) 基因克隆及生物信息学分析
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海洋球石藻(Emiliania huxleyi)活性物质分离鉴定及其抗菌抗氧化性能研究 被引量：4
4
作者 刘静雯 吴书燕 +3 位作者 马亚瑞 张恩权 李桂玲 李健 《海洋与湖沼》 CAS CSCD 北大核心 2021年第5期1180-1190,共11页
以海洋球石藻Emiliania huxleyi为原料,提取分离生物活性物质,为该藻活性物质的研究与开发提供理论基础。通过对球石藻75%乙醇浸提物采用乙酸乙酯进行萃取,进一步利用薄层色谱、硅胶色谱、Sephadex LH-20凝胶色谱及高效液相色谱(HPLC)... 以海洋球石藻Emiliania huxleyi为原料,提取分离生物活性物质,为该藻活性物质的研究与开发提供理论基础。通过对球石藻75%乙醇浸提物采用乙酸乙酯进行萃取,进一步利用薄层色谱、硅胶色谱、Sephadex LH-20凝胶色谱及高效液相色谱(HPLC)等方法,对化合物成分进行逐步分离纯化,获得纯度大于95%的单体化合物;通过^(1)HNMR、^(13)CNMR及HRMS等波谱分析技术鉴定化合物的结构,并对其抗菌、抗氧化性能进行初步分析。结果分离鉴定出3种单体化合物,分别为叶绿醇(C_(20)H_(40)O)、棕榈酸(C_(16)H_(32)O_(2))和肉豆蔻酸(C_(14)H_(28)O_(2)),这些化合物均为首次从海洋球石藻中分离获得。其中叶绿醇具有较强的抗氧化能力,且对肝癌细胞Hep G2的增殖有较强的抑制作用,其他两种化合物对金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌及副溶血性弧菌均有不同程度的抗菌活性。另外,海洋球石藻中这些化合物除了具有一定的抗菌抗氧化性能外,可能在球石藻响应胁迫(如病毒感染)过程中也具有重要作用。 展开更多
关键词 海洋球石藻Emiliania huxleyi 化学成分 结构鉴定 抗菌抗氧化活性
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海洋球石藻病毒(Coccolithovirus)硫氧还蛋白(Trx)在毕赤酵母(Pichia pastoris)中的表达及其活性分析 被引量：1
5
作者 蔡艺钦 张稚兰 +1 位作者 罗邦彬 刘静雯 《海洋与湖沼》 CAS CSCD 北大核心 2012年第5期905-910,共6页
从实验室保存的pBS-Trx重组质粒中克隆球石藻病毒EhV-Trx基因,构建毕赤酵母重组表达载体pPIC9K-EhV-Trx,将重组质粒电转化毕赤酵母GS115,诱导分泌表达并对重组蛋白进行二硫键还原酶活性分析。结果表明,EhV-Trx基因开放阅读框为591bp,编... 从实验室保存的pBS-Trx重组质粒中克隆球石藻病毒EhV-Trx基因,构建毕赤酵母重组表达载体pPIC9K-EhV-Trx,将重组质粒电转化毕赤酵母GS115,诱导分泌表达并对重组蛋白进行二硫键还原酶活性分析。结果表明,EhV-Trx基因开放阅读框为591bp,编码197个氨基酸;在毕赤酵母GS115中成功诱导表达重组EhV-Trx,经SDS-PAGE分析目的蛋白分子量约为27.8kDa;重组EhV-Trx具有二硫键还原酶的活性,能有效打开胰岛素A、B两条链的二硫键,有望开发成一种新型的硫氧还蛋白脱敏制剂应用于食品安全领域。 展开更多
关键词 海洋球石藻病毒(EhV) 硫氧还蛋白 毕赤酵母 分泌表达 活性分析
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海洋球石藻(Emiliania huxleyi)通用表达载体的构建与电转化
6
作者 王薛婷 郭强强 +3 位作者 蔡艺钦 陈志福 李健 刘静雯 《海洋学报》 CAS CSCD 北大核心 2016年第8期103-114,共12页
海洋球石藻Emiliania huxleyi是一种全球广泛分布的真核浮游植物,该种不仅是海洋碳、硫循环和全球气候变化的重要指示物种,而且能够产生丰富的次级代谢生物活性物质,在生物技术领域也具有很好的应用前景。本文通过分析氨苄青霉素、卡那... 海洋球石藻Emiliania huxleyi是一种全球广泛分布的真核浮游植物,该种不仅是海洋碳、硫循环和全球气候变化的重要指示物种,而且能够产生丰富的次级代谢生物活性物质,在生物技术领域也具有很好的应用前景。本文通过分析氨苄青霉素、卡那霉素、G418、氯霉素、链霉素、新生霉素及嘌呤霉素等7种常用抗生素对海洋球石藻生长的影响,确定G418可作为该藻阳性转化藻株的抗性筛选试剂,其对应的抗性基因neo则作为该藻表达载体构建中的抗性筛选标记。在此基础上克隆了绿色荧光蛋白基因gfp、抗性标记基因neo及E.huxleyi BOF92内源性岩藻黄素-叶绿素a/c结合蛋白基因的启动子fcp,以pUC18为基础载体,构建了pUC18-fcp-gfp和pUC18-fcp-neo两个重组表达载体,以电转化方法共转化球石藻细胞并结合选择性固体培养基筛选,成功获得了被转化的球石藻细胞。海洋球石藻遗传转化系统的建立为进一步开展该种相关的基础生物学研究及其在生物技术领域的应用奠定了基础。 展开更多
关键词 海洋球石藻 通用表达载体 riCO标记基因 电转化
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病毒感染海洋球石藻Emiliania huxleyi的转录组分析 被引量：2
7
作者 田雪 蔡伟聪 +2 位作者 苏金净 吴书燕 刘静雯 《海洋学报》 CAS CSCD 北大核心 2019年第12期103-112,共10页
海洋球石藻Emiliania huxleyi及其特异性裂解病毒E.huxleyi virus(EhVs)在调节海洋碳、硫循环及全球气候变化中起着重要作用,也是开展真核生物病毒–宿主相互作用研究的良好模型系统之一。为了探究病毒感染条件下E.huxleyi基因表达水平... 海洋球石藻Emiliania huxleyi及其特异性裂解病毒E.huxleyi virus(EhVs)在调节海洋碳、硫循环及全球气候变化中起着重要作用,也是开展真核生物病毒–宿主相互作用研究的良好模型系统之一。为了探究病毒感染条件下E.huxleyi基因表达水平的变化,以海洋球石藻E.huxley–BOF 92及其专一性裂解病毒EhV-99B1为研究对象,利用Illumina HiSeq 2000高通量测序技术,分别对E.huxleyi病毒感染组(Exp)和非感染对照组(Con)6 h和45 h的藻细胞样品进行转录组测序分析。共得到32909条平均长度为1153 bp的基因。病毒感染6 h和45 h分别得到2617和5229个差异表达基因,其中共差异表达基因465个。随机选取10条差异表达基因,采用qRT-PCR进行实验验证,结果证实转录组分析可靠。GO功能注释和KEGG通路富集,发现大量基因与氧化应激反应、脂类代谢、碳水化合物代谢及信号转导等代谢过程相关,其中变化最显著的是谷胱甘肽代谢途径。从病毒感染球石藻转录组中筛选出部分与氧化应激反应相关的基因,其中9个基因显著上调,11个基因显著下调,表明宿主能够通过体内的氧化应激反应响应病毒胁迫。 展开更多
关键词 海洋球石藻Emiliania huxleyi 病毒感染 转录组 差异表达基因 QRT-PCR 氧化应激反应
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海洋球石藻(Emiliania huxleyi)磷脂酶C的结构特点及系统进化分析 被引量：1
8
作者 郭强强 蔡伟聪 +3 位作者 李桂玲 曾珺 李健 刘静雯 《海洋与湖沼》 CAS CSCD 北大核心 2018年第1期106-116,共11页
磷脂酶C(phospholipase C,PLC)作为一种重要的细胞信号分子,是G蛋白信号转导过程中的重要调节因子之一,在动、植物环境胁迫应答及病原菌致病过程中发挥重要作用。海洋浮游植物生长代谢与环境因子之间的相互作用涉及细胞内复杂的信号通路... 磷脂酶C(phospholipase C,PLC)作为一种重要的细胞信号分子,是G蛋白信号转导过程中的重要调节因子之一,在动、植物环境胁迫应答及病原菌致病过程中发挥重要作用。海洋浮游植物生长代谢与环境因子之间的相互作用涉及细胞内复杂的信号通路,并最终通过调节细胞分裂过程控制浮游植物的增殖、种群生长动力及初级生产力。但对浮游植物PLC及其参与的信号通路的了解却非常少。通过NCBI基因数据库的关键词搜索、比对,发现海洋球石藻(Emiliania huxleyi)中含有30种PLC蛋白,利用SMART程序预测其结构保守域,以此将30种PLC分为四大类;对其氨基酸序列的信号肽、跨膜结构域、一级结构、二级结构、三级结构及其细胞定位等进行了生物信息学分析和预测。结果表明,海洋球石藻PLC具有丰富的多样性,它们在信号肽、跨膜区等方面均有一定的差别,其一级结构中存在多个可能的磷酸化修饰位点。二级结构中都含有α螺旋,β折叠,无规则卷曲,且都定位于线粒体,而三级结构相似度不高。从亲缘关系上看,海洋球石藻PLC与低等动物更接近。该研究补充和完善了对植物PLC信号转导网络系统的认识,并为进一步开展海洋球石藻PLC细胞定位及其参与的信号通路与环境胁迫之间关系的研究提供了重要的理论指导。 展开更多
关键词 海洋球石藻 磷脂酶C结构 系统进化 信号转导 生物信息学
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一种新的海洋微藻病毒丝氨酸蛋白酶基因的克隆表达及其活性分析 被引量：1
9
作者 李丽华 邱健健 +2 位作者 蔡艺钦 于鹏 刘静雯 《海洋学报》 CAS CSCD 北大核心 2014年第8期101-110,共10页
从海洋球石藻 Emiliania huxleyi 病毒 EhV99B1的基因组中克隆了丝氨酸蛋白酶（Sp）基因（GenBank 登录号：KC161207），对该基因的开放阅读框（ORF）进行系统的生物信息学分析，并在大肠杆菌中融合表达，通过亲和层析法获得了纯化的重... 从海洋球石藻 Emiliania huxleyi 病毒 EhV99B1的基因组中克隆了丝氨酸蛋白酶（Sp）基因（GenBank 登录号：KC161207），对该基因的开放阅读框（ORF）进行系统的生物信息学分析，并在大肠杆菌中融合表达，通过亲和层析法获得了纯化的重组 Sp。结果表明：EhV99B1-Sp 基因的 ORF 为1110 bp，编码368个氨基酸，蛋白相对分子质量为39．5 kDa；该基因片段与 GenBank 中 EhV86-Sp 的同源性很高，核苷酸及其对应的氨基酸序列同源性分别为95％和97％，而与其他物种 Sp 序列的同源性仅为28％～32％，说明其可能是丝氨酸蛋白酶家族中的一个新成员；预测的二级结构特征显示EhV99B1-Sp 的蛋白结构域中具有典型的 LTAGHC （组氨酸活性位点区域）和 AICNGDSGGPLF（丝氨酸活性位点区域）两个丝氨酸蛋白酶催化活性位点的氨基酸基序，是一个两次跨膜蛋白；将该基因在大肠杆菌中进行低温诱导表达，得到分子量为60 kDa 的重组蛋白，经鲤鱼肌肉丝氨酸蛋白酶（MB-SP）抗体检测证实为 Sp，且重组蛋白在大肠杆菌细胞中具有明显的生物学活性。本研究结果为进一步探讨 EhV99B1-Sp 在病毒与宿主相互作用过程中的调节作用及其功能与应用奠定基础。 展开更多
关键词 海洋球石藻病毒 丝氨酸蛋白酶 基因克隆 重组表达 活性分析
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