流行性乙型脑炎病毒、西尼罗病毒、黄热病毒和寨卡病毒四重LuminexxTAG检测方法的建立与应用 被引量：1

1

作者 孙俊颖 伍绮文 +4 位作者 李吉初 李春红 郭鹏举 黄艺 尹飞飞 《广东农业科学》 CAS 2024年第10期78-87,共10页

【目的】黄病毒科虫媒病毒引起的人畜共患传染病对我国畜牧业及公共卫生造成严重影响。虫媒病毒种类多且感染症状相似,临床监测工作繁重,建立4种危害严重的黄病毒科虫媒病毒快速、高通量检测技术为其诊断和流行病学监测提供技术支撑。... 【目的】黄病毒科虫媒病毒引起的人畜共患传染病对我国畜牧业及公共卫生造成严重影响。虫媒病毒种类多且感染症状相似,临床监测工作繁重,建立4种危害严重的黄病毒科虫媒病毒快速、高通量检测技术为其诊断和流行病学监测提供技术支撑。【方法】利用Luminex xTAG技术,针对流行性乙型脑炎病毒(JEV)5'UTR、西尼罗病毒(WNV)5'UTR及部分C基因、黄热病毒(YFV)5'UTR和寨卡病毒(ZIKV)NS5基因保守区,设计4对特异性引物并对引物进行TAG和Biotin修饰,以标准毒株为模板,进行多重PCR扩增;将扩增产物与带有反向TAG序列的不同编号荧光MagTAG磁珠、链霉亲和素R-藻红蛋白进行核酸杂交反应,利用Luminex 200系统检测磁珠荧光信号和藻红蛋白荧光信号,对病原进行分类和定量检测。【结果】建立了能特异性检测JEV、WNV、YFV和ZIKV的四重Luminex xTAG方法,其最优引物工作浓度为0.5、0.5、0.75、0.5µmol/L;杂交工作体系为磁珠工作液20μL、PCR扩增产物5μL、SAPE报告缓冲液75μL;杂交温度为37℃,杂交时间为30 min,pH值为8.0;该检测方法特异性好且不与登革病毒等其他虫媒病毒发生交叉反应。重复性试验结果表明,Luminex xTAG方法的批内变异系数为2.50%~5.63%,批间变异系数为3.61%~12.50%。四重Luminex xTAG方法对JEV和ZIKV的检测限为1×10^(4) copies/μL,对WNV和YFV的检测限为1×10^(3)copies/μL,其检测WNV、YFV和ZIKV的灵敏度较常规PCR高10~100倍。用Luminex xTAG方法和RT-qPCR方法检测209份临床样品和模拟样品,JEV、WNV、YFV、ZIKV符合率为100%。【结论】建立的四重Luminex xTAG方法具有高通量、高特异性和灵敏度、成本效益高的优点,可为虫媒病毒临床诊断和流行病学监测提供一种高通量技术手段。 展开更多

关键词 虫媒病毒 流行性乙型脑炎病毒 西尼罗病毒 黄热病毒 寨卡病毒 液相芯片 LuminexxTAG技术

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猪流行性乙型脑炎病毒种猪精液分离株的鉴定及进化分析 被引量：10

2

作者 王兴涛 罗俊 +5 位作者 滕蔓 樊剑鸣 鄂巍 禹斌 刘力 张改平 《河南农业科学》 CSCD 北大核心 2011年第5期152-157,共6页

利用RT-PCR技术对河南省某规模化猪场乙脑疑似病例的种猪精液进行分析,从部分样本中扩增出与流行性乙型脑炎病毒(JEV)M基因和E基因具有高度同源性的预期产物。在3日龄乳鼠脑内接种种猪精液上清,10 d左右即出现典型神经症状,并且病死鼠... 利用RT-PCR技术对河南省某规模化猪场乙脑疑似病例的种猪精液进行分析,从部分样本中扩增出与流行性乙型脑炎病毒(JEV)M基因和E基因具有高度同源性的预期产物。在3日龄乳鼠脑内接种种猪精液上清,10 d左右即出现典型神经症状,并且病死鼠脑组织RT-PCR结果均为阳性。用病死鼠脑组织研磨上清接种BHK-21细胞,感染60 h后用JEV单抗进行间接免疫荧光鉴定均为阳性,这表明分离毒株均为JEV流行毒株,分别命名为BSF.ZZ-1和BSF.ZZ-3。对新分离毒株进行体外细胞培养,BSF.ZZ-1和BSF.ZZ-3连续传代3次后病毒量均获得明显增加,最高分别可达104.5±0.1TCID50/mL和104.2±0.2TCID50/mL。用生物学软件MEGA 4.0分别构建JEV基因的系统进化树,发现BSF.ZZ-1和BSF.ZZ-3处于同一进化分支,均属于基因Ⅲ型。 展开更多

关键词 流行性乙型脑炎病毒 分离鉴定 M基因 E基因 系统进化树 基因Ⅲ型

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三种ELISA试剂盒检测猪流行性乙型脑炎病毒血清IgG抗体比较 被引量：7

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作者 马淑娟 熊益权 +7 位作者 张琼花 周军华 李杏 郑雪燕 蒋丽娜 钟雪珊 陈少威 陈清 《中国人兽共患病学报》 CAS CSCD 北大核心 2015年第5期423-426,共4页

目的比较国内常用商品化ELISA试剂盒检测猪流行性乙型脑炎病毒血清IgG抗体的诊断效果。方法选用3种猪乙脑病毒血清IgG抗体ELISA检测试剂盒(Keqian,Lvshiyuan,Tianchen),以微量中和试验为金标准,对90份猪血清进行检测分析。结果中和试验... 目的比较国内常用商品化ELISA试剂盒检测猪流行性乙型脑炎病毒血清IgG抗体的诊断效果。方法选用3种猪乙脑病毒血清IgG抗体ELISA检测试剂盒(Keqian,Lvshiyuan,Tianchen),以微量中和试验为金标准,对90份猪血清进行检测分析。结果中和试验的阳性检出率为34.4%(31/90),Keqian,Lvshiyuan和Tianchen阳性检出率分别为50.0%(45/90),47.8%(43/90)和38.9%(35/90)。灵敏度最高的是Keqian,为90.32%,但其特异度只有71.19%;Tianchen的灵敏度和特异度分别为83.87%和79.66%;Lvshiyuan的灵敏度和特异度分别仅为41.94%和16.95%。与中和试验比较,Tianchen试剂盒的κ系数最高为0.63,其次是Keqian为0.57,Lvshiyuan仅为0.04。显示3种试剂盒具稳定性。结论目前国内商品化猪乙脑病毒血清IgG抗体ELISA检测试剂盒诊断结果差异较大,与中和试验相比存在较高的假阴性,质量有待提高。 展开更多

关键词 猪 血清 流行性乙型脑炎病毒抗体 酶联免疫吸附试验 试剂盒

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中国首次分离的二株基因Ⅰ型流行性乙型脑炎病毒全基因组序列分析（英文） 被引量：6

4

作者 冯云 李灿委 +2 位作者 章域震 杨卫红 张海林 《中国人兽共患病学报》 CAS CSCD 北大核心 2013年第9期829-835,共7页

目的分析中国首次分离的基因Ⅰ型流行性乙型脑炎病毒(JEV)全基因组的基因组特征。方法设计JEV全基因组扩增引物,RT-PCR扩增片断,PCR产物直接测序,拼接后获得全基因组序列。采用生物学软件进行同源性和系统进化分析。结果 1977和1982年... 目的分析中国首次分离的基因Ⅰ型流行性乙型脑炎病毒(JEV)全基因组的基因组特征。方法设计JEV全基因组扩增引物,RT-PCR扩增片断,PCR产物直接测序,拼接后获得全基因组序列。采用生物学软件进行同源性和系统进化分析。结果 1977和1982年分离自云南蚊虫的M28和BN82215病毒株基因组全长分别为10 969bp和10 970bp,5′非编码区均含有96个核苷酸,3′非编码区含有573和574个核苷酸。它们的开放阅读框(ORF)都从97到10 396位,共10 299个核苷酸,编码3 433个氨基酸。M28和BN82215株与来自GenBank的5个基因型JEV株的全基因组核苷酸和氨基酸同源性分别为78.4%~96.3%和91.4%~99.6%,与近几年国内外基因Ⅰ型流行株的同源性最高,进化关系最接近,都属于基因Ⅰ型。这两株病毒与JEV疫苗株SA14-14-2相比,有56个氨基酸差异,其中E基因有11个氨基酸差异,但都不属抗原关键位点。结论本研究阐明了中国首次分离的基因Ⅰ型JEV的全基因组分子特征,决定病毒抗原和毒力的E蛋白关键位点无明显变化。证实20世纪70和80年代云南省就有基因Ⅰ型JEV流行。 展开更多

关键词 流行性乙型脑炎病毒 基因Ⅰ型 全基因组 同源性分析 系统进化分析

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蝙蝠作为流行性乙型脑炎病毒宿主的研究 被引量：16

5

作者 张海林 张云智 +11 位作者 黄文丽 米竹青 龚鹤琴 杨卫红 施华芳 自登云 李兆祥 王静林 章域震 龚正达 袁庆虹 冯锡光 《动物医学进展》 CSCD 2002年第5期58-61,共4页

于 1 98 6、1 988、1 990和 1 997年的 7-8月 ,在云南省共捕获 653只蝙蝠 ,其中棕果蝠( Rousettus leschenaulti) 593只 ,金管鼻蝠( Murina aurata) 60只 ,采集血清及剖取脑组织作病毒分离和抗体检查。用细胞法和乳鼠法分离到 6株病毒 ... 于 1 98 6、1 988、1 990和 1 997年的 7-8月 ,在云南省共捕获 653只蝙蝠 ,其中棕果蝠( Rousettus leschenaulti) 593只 ,金管鼻蝠( Murina aurata) 60只 ,采集血清及剖取脑组织作病毒分离和抗体检查。用细胞法和乳鼠法分离到 6株病毒 ,带毒率为 0 .96% ,其中从捕自景洪的棕果蝠脑组织中分离到 3株 ,从河口的棕果蝠血清中分离到 2株 ,从捕自耿马的金管鼻蝠脑组织中分离出 1株。棕果蝠和金管鼻蝠的带毒率分别为 0 .84%和 1 .67%。这 6株病毒能引起 C6/ 3 6和 BHK2 1细胞病变和导致乳小白鼠或 3～ 4周龄小白鼠发病和死亡 ,并具有典型的嗜神经病毒感染症状。经血凝抑制、补体结合、免疫荧光和中和试验鉴定 ,新分离的 6株病毒均为乙脑病毒 ( JE virus)。同期用血凝抑制试验对采获的 42 5份棕果蝠血清作乙脑病毒抗体检查 ,阳性 1 53份 ,阳性率为 3 6% ,具有较高的感染率。本次从棕果蝠和金管鼻蝠体内分离出乙脑病毒属具有重要流行病学意义。 展开更多

关键词 蝙蝠 流行性乙型脑炎病毒 宿主

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流行性乙型脑炎病毒SA14-14-2株E蛋白基因在原核细胞中的高效表达及其表达产物的抗原性分析 被引量：6

6

作者 杨耀武 齐香荣 +3 位作者 陈德胜 何孔旺 陈溥言 沈国顺 《中国人兽共患病杂志》 CSCD 北大核心 2003年第5期31-35,共5页

目的　获得JEVE蛋白基因并使其在E coli中高效表达 ,以研究其抗原活性 ,为进一步研制ELISA早期诊断试剂盒奠定基础。方法　根据已发表的JEVSA - 14 - 14 - 2减毒株序列 ,设计一对特异性引物 ,通过RT -PCR扩增出E蛋白基因的cDNA片段 ,并... 目的　获得JEVE蛋白基因并使其在E coli中高效表达 ,以研究其抗原活性 ,为进一步研制ELISA早期诊断试剂盒奠定基础。方法　根据已发表的JEVSA - 14 - 14 - 2减毒株序列 ,设计一对特异性引物 ,通过RT -PCR扩增出E蛋白基因的cDNA片段 ,并将其克隆入 pET - 32a(+)表达载体中 ,构建重组融合表达载体pET -E ,转化大肠杆菌BL2 1(DE3)后 ,利用IPTG诱导获得高效表达。结果　扩增的E蛋白基因片段长 1113bp ,编码 371个氨基酸残基 ,该基因片段与国内发表的减毒株SA14 - 14 - 2碱基序列同源性为 10 0 %。表达产物分子量约为 6 2kD ,经Westernblotting分析表明表达产物具有较好的抗原性。结论　通过序列分析表明 ,我国的JEVSA - 14 - 14 - 2减毒株未发生基因突变。表达产物的稳定高效表达及其抗原特异性分析为今后ELISA早期诊断试剂盒的研制提供了依据。 展开更多

关键词 流行性乙型脑炎病毒 SA14-14-2株 E蛋白 基因表达 原核细胞 抗原性 基因克隆

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流行性乙型脑炎病毒E蛋白多表位肽在毕赤酵母中分泌表达及其免疫原性研究 被引量：3

7

作者 钟登科 黄艺珠 +4 位作者 魏建超 康乐 曹瑞兵 周斌 陈溥言 《中国预防兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2017年第4期296-300,507,共5页

为构建流行性乙型脑炎病毒（JEV） E蛋白多表位疫苗，本研究将人工合成的优化后E蛋白多表位肽（MP）序列克隆于酵母表达载体pPICZα-A中，构建分泌型重组酵母表达质粒pPICZ-MP后电转化导于毕赤酵母X-33中，重组酵母菌组子经甲醇诱导表... 为构建流行性乙型脑炎病毒（JEV） E蛋白多表位疫苗，本研究将人工合成的优化后E蛋白多表位肽（MP）序列克隆于酵母表达载体pPICZα-A中，构建分泌型重组酵母表达质粒pPICZ-MP后电转化导于毕赤酵母X-33中，重组酵母菌组子经甲醇诱导表达重组蛋白（rMP）。将其免疫小鼠后，通过测定rMP免疫小鼠的抗体水平、抗体亚型、中和抗体和CTL，以评价该多表位疫苗在小鼠模型的免疫原性。结果显示正确构建了表达JEV E蛋白多表位抗原的重组酵母菌株X33 （pPICZ -MP），并分泌表达多表位肽rMP ；纯化后的rMP免疫小鼠产生了较强的体液免疫和细胞免疫反应，其中和抗体水平、CTL活性均与活病毒疫苗组无显著差异（p〉0.05），而且能保护小鼠免受致死量JEV的攻击。上述结果表明本研究以酵母菌表达的JEV E蛋白多表位疫苗具有良好的的免疫原性，能够刺激小鼠产生特异性的细胞免疫和体液免疫应答反应，为流行性乙型脑炎多表位疫苗研制提供了新的思路。 展开更多

关键词 流行性乙型脑炎病毒 多表位疫苗 毕赤酵母 免疫原性

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流行性乙型脑炎病毒一步法RT-LAMP检测方法的建立 被引量：8

8

作者 杜鹃 宋永 +1 位作者 刘立科 华荣虹 《中国预防兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2010年第10期773-776,共4页

为建立一种简便、快速、灵敏、特异的乙型脑炎病毒(JEV)检测方法,本研究根据GenBank中登录的25株流行性JEV基因组序列,设计3对特异性的环介导等温扩增(LAMP)引物,优化反应体系,建立了一步法反转录-LAMP(RT-LAMP)检测方法。该方法检测时... 为建立一种简便、快速、灵敏、特异的乙型脑炎病毒(JEV)检测方法,本研究根据GenBank中登录的25株流行性JEV基因组序列,设计3对特异性的环介导等温扩增(LAMP)引物,优化反应体系,建立了一步法反转录-LAMP(RT-LAMP)检测方法。该方法检测时间短,灵敏度比常规RT-PCR方法高,可检测出103TCID50/0.2mL JEV;特异性强,对猪细小病毒、猪圆环病毒、伪狂犬病毒、猪瘟病毒等常见猪病毒均无交叉反应。结果判定时只需要在扩增产物中加入SYBR GreenⅠ染料,就可以直接在可见光或紫外光下观察颜色变化。该方法简便快捷,省时省力,是一种适用于基层实验室快速、准确检测流行性JEV的方法。 展开更多

关键词 流行性乙型脑炎病毒 反转录环介导等温扩增技术

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流行性乙型脑炎病毒GI型毒株SD12在C57BL/6小鼠体内的动态分布研究 被引量：3

9

作者 王欣 郭爽 +9 位作者 张俊杰 庞琳琳 李蓓蓓 刘珂 邵东华 邱亚峰 马志永 钟登科 李鹏 魏建超 《中国动物传染病学报》 CAS 北大核心 2022年第1期150-156,共7页

为了解流行性乙型脑炎病毒基因I型毒株SD12在感染C57BL/6小鼠体内的病毒分布,应用qRT-PCR方法检测该毒株在小鼠体内各组织的动态分布情况。结果显示腹腔感染组中2 dpi仅能在心脏和脾脏检测出病毒核酸,5~7 dpi能够在心脏、肝脏、脑部、... 为了解流行性乙型脑炎病毒基因I型毒株SD12在感染C57BL/6小鼠体内的病毒分布,应用qRT-PCR方法检测该毒株在小鼠体内各组织的动态分布情况。结果显示腹腔感染组中2 dpi仅能在心脏和脾脏检测出病毒核酸,5~7 dpi能够在心脏、肝脏、脑部、盲肠和扁桃体检测到病毒核酸。血脑屏障受损的腹腔感染组中最早2 dpi在肠系膜淋巴结中检测到病毒核酸,3 dpi基本能在各组织中检测到病毒核酸,5~7 dpi在大脑中检测到大量病毒核酸。所有对照组没有检测到病毒阳性核酸。本研究表明基因I型流行性乙型脑炎病毒感染血脑屏障受损的C57BL/6小鼠后能迅速入侵各组织脏器,主要浸染肝脏、肺脏、肾脏、盲肠和大脑。拥有完整血脑屏障的小鼠对病毒具有一定抵抗能力,病毒在各组织中的含量相对比较低。 展开更多

关键词 流行性乙型脑炎病毒 血脑屏障 QRT-PCR 动态分布

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流行性乙型脑炎病毒E蛋白多表位肽在毕赤酵母中分泌表达及其免疫原性研究 被引量：2

10

作者 钟登科 黄艺珠 +4 位作者 魏建超 康乐 曹瑞兵 周斌 陈溥言 《中国预防兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2017年第6期485-489,507,共6页

为构建流行性乙型脑炎病毒(JEV)E蛋白多表位疫苗,本研究将人工合成的优化后的E蛋白多表位肽(MP)序列克隆入酵母表达载体p PICZα-A,构建分泌型重组酵母表达质粒p PICZ-MP,经SacⅠ酶切线性化后电转化导入毕赤酵母X-33,阳性重组子经甲醇... 为构建流行性乙型脑炎病毒(JEV)E蛋白多表位疫苗,本研究将人工合成的优化后的E蛋白多表位肽(MP)序列克隆入酵母表达载体p PICZα-A,构建分泌型重组酵母表达质粒p PICZ-MP,经SacⅠ酶切线性化后电转化导入毕赤酵母X-33,阳性重组子经甲醇诱导表达,亲和层析纯化重组蛋白(rMP)。通过测定rMP免疫小鼠的抗体水平、抗体亚型、中和抗体和CTL,以评价该多表位疫苗在小鼠模型上的免疫原性。结果表明:成功构建了表达JEV E蛋白多表位抗原的重组酵母菌株X33(pPICZ-MP),能分泌表达多表位肽r MP。纯化后的r MP免疫小鼠产生了较强的体液免疫和细胞免疫反应,其中和抗体水平、CTL活性均与活病毒疫苗组差异不显著(p>0.05),且能保护小鼠免受致死量JEV的攻击。构建的JEV E蛋白多表位疫苗具有良好的免疫原性,能够刺激小鼠产生特异性的细胞免疫和体液免疫应答反应,为流行性乙型脑炎多表位疫苗研制提供新的思路。 展开更多

关键词 流行性乙型脑炎病毒 多表位疫苗 毕赤酵母 免疫原性

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流行性乙型脑炎病毒NS1基因克隆及其蛋白表达纯化 被引量：7

11

作者 张孝忠 刘一凡 +3 位作者 谷思颖 余娜 段彦祥 李有文 《中国畜牧兽医》 CAS 北大核心 2018年第8期2320-2326,共7页

为了表达流行性乙型脑炎(epidemic encephalitis type B)非结构蛋白NS1,本研究通过PCR扩增了日本乙脑病毒(Japanese encephalitis virus,JEV)P3株NS1基因,并分别构建了其融合表达His和GST标签的原核表达载体,经PCR、酶切和测序鉴定正确... 为了表达流行性乙型脑炎(epidemic encephalitis type B)非结构蛋白NS1,本研究通过PCR扩增了日本乙脑病毒(Japanese encephalitis virus,JEV)P3株NS1基因,并分别构建了其融合表达His和GST标签的原核表达载体,经PCR、酶切和测序鉴定正确后转化大肠杆菌BL21感受态细胞,用IPTG诱导表达了NS1融合蛋白,通过SDS-PAGE电泳和Western blotting进行鉴定,并用尿素变性复性和镍亲合层析法纯化目的蛋白。结果显示,试验成功构建了NS1的两个原核表达载体pET-42b-NS1和pGEX-KG-NS1,P3株NS1基因全长1 056bp,以包涵体的形式表达约40ku的蛋白,尿素变性复性效果较好,镍亲合层析纯化得到纯度和浓度均较高的NS1蛋白。JEV NS1基因可以通过原核表达系统高效表达蛋白并纯化得到高纯度产物,为后期生物学功能研究奠定基础。 展开更多

关键词 流行性乙型脑炎病毒(JEV) NS1基因 克隆 蛋白表达 蛋白纯化

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流行性乙型脑炎病毒结构蛋白编码基因的重组构建 被引量：1

12

作者 冯国和 王玉梅 +3 位作者 刘宁 刘沛 王占英 竹上勉 《中国医科大学学报》 CAS CSCD 北大核心 2005年第5期385-387,共3页

目的:建立流行性乙型脑炎病毒(JEV)C、prME,E等结构蛋白编码基因克隆。方法:病毒感染C6/36细胞,RT-PCR法依次获取该病毒结构蛋白基因并进行DNA测序分析,PCR克隆法将PCR产物分别构建于真核表达载体pcDNA 3.1的BamH I与EcoR I酶切位点并... 目的:建立流行性乙型脑炎病毒(JEV)C、prME,E等结构蛋白编码基因克隆。方法:病毒感染C6/36细胞,RT-PCR法依次获取该病毒结构蛋白基因并进行DNA测序分析,PCR克隆法将PCR产物分别构建于真核表达载体pcDNA 3.1的BamH I与EcoR I酶切位点并依次命名为pJC、pJME与pJE,通过DNA测序、电泳以及限制性内切酶分析加以鉴定。结果:JEV C、prME与E基因片段分别为380、2 001以及1 500 bp,各基因测序结果与发表的JEV JaGAr-01株相对应序列相一致,从重组质粒释出的插入子分别与各基因大小相符合。结论:pJC、pJME与pJE重组质粒分别含有C、prME与E蛋白编码基因。 展开更多

关键词 流行性乙型脑炎病毒 重组质粒 DNA测序 限制性内切酶分析

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流行性乙型脑炎病毒NS4A蛋白基因的克隆及其在大肠埃希菌的表达

13

作者 冯国和 王玉梅 +3 位作者 刘宁 王占英 刘沛 竹上勉 《中国医科大学学报》 CAS CSCD 北大核心 2005年第6期497-499,共3页

目的:克隆及表达流行性乙型脑炎病毒(JEV)NS4A蛋白基因。方法:JEV JaGAr-01株感染C6/36细胞,RT-PCR法获取JEV NS4A蛋白基因并采用AB I PRSMTM310 Genetic Analyzer进行DNA测序分析,PCR克隆方法将RT-PCR产物构建于原核表达载体PET-3 a的B... 目的:克隆及表达流行性乙型脑炎病毒(JEV)NS4A蛋白基因。方法:JEV JaGAr-01株感染C6/36细胞,RT-PCR法获取JEV NS4A蛋白基因并采用AB I PRSMTM310 Genetic Analyzer进行DNA测序分析,PCR克隆方法将RT-PCR产物构建于原核表达载体PET-3 a的BamH I与EcoR I酶切位点并命名为pNS4A,电泳进行限制性内切酶分析。结果:JEV NS4A蛋白基因大小为446 bp,DNA测序与发表的JEV JaGAr-01株相对应的DNA序列相符合,酶切后从重组质粒释出的插入子与JEV NS4A蛋白基因大小相一致。pNS4A在原核细胞内表达的特异蛋白分子量约16 kDa,与JEV NS4A蛋白理论计算相一致。结论:获取的JEV NS4A蛋白基因来自于JaGAr-01野生株,pNS4A在大肠埃希菌中表达的蛋白产物为JEV NS4A蛋白。 展开更多

关键词 流行性乙型脑炎病毒 pNS4A DNA测序 限制性内切酶分析 蛋白表达

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猪流行性乙型脑炎病毒TaqMan荧光定量PCR方法的建立 被引量：4

14

作者 霍红 李业南 +4 位作者 薛遥 郭立平 王晓磊 步志高 华荣虹 《中国预防兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2014年第7期547-550,共4页

为建立猪流行性乙型脑炎病毒(JEV)的定量检测方法,本实验根据JEV的E基因保守序列设计一对特异性引物及探针,并以E基因重组质粒作为标准品,建立检测JEV的TaqMan荧光定量PCR方法。结果显示,该方法的灵敏度可达到10个拷贝,是常规PCR灵敏度... 为建立猪流行性乙型脑炎病毒(JEV)的定量检测方法,本实验根据JEV的E基因保守序列设计一对特异性引物及探针,并以E基因重组质粒作为标准品,建立检测JEV的TaqMan荧光定量PCR方法。结果显示,该方法的灵敏度可达到10个拷贝,是常规PCR灵敏度的100倍。该方法对其它相关猪病病毒的检测显示均为阴性。重复性试验表明该方法的组间和组内的变异系数均小于2%。通过检测未免疫猪和免疫减毒活疫苗猪在感染JEV后的病毒血症样品,将该方法与JEV传统病毒分离方法进行比较,结果表明该方法与乳鼠脑内接种方法灵敏度相同,比细胞分离方法灵敏度高。该方法可以作为临床检测JEV及评价疫苗保护效力的检测方法。 展开更多

关键词 流行性乙型脑炎病毒 TaqMan荧光定量PCR 检测

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猪流行性乙型脑炎病毒prM-E抗原捕获ELISA检测方法的建立 被引量：2

15

作者 王晓磊 霍红 +3 位作者 郭立平 李伟 步志高 华荣虹 《中国预防兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2015年第6期465-468,485,共5页

为建立猪流行性乙型脑炎病毒(JEV)的检测方法,本研究以pr M-E结构蛋白特异性单克隆抗体(MAb)5B10和5E7分别作为捕获抗体和辣根过氧化酶标记的检测抗体,对反应条件进行优化,建立了抗原捕获ELISA(AC-ELISA)方法。该方法与其它常见猪病病... 为建立猪流行性乙型脑炎病毒(JEV)的检测方法,本研究以pr M-E结构蛋白特异性单克隆抗体(MAb)5B10和5E7分别作为捕获抗体和辣根过氧化酶标记的检测抗体,对反应条件进行优化,建立了抗原捕获ELISA(AC-ELISA)方法。该方法与其它常见猪病病原无交叉反应,特异性强。该方法可以检出1.25×105 pfu/m L的病毒和48.44 ng/m L pr M-E重组蛋白,最佳线性检测范围为0.05μg/m L^1.00μg/m L,线性相关系数(R2)为0.996。组装的试剂盒批内和批间重复性试验的变异系数均小于10%,具有良好的重复性。试剂盒4℃保存12个月稳定。该研究为JEV亚单位疫苗的研制与生产提供了技术支持。 展开更多

关键词 流行性乙型脑炎病毒 prM-E 抗原捕获ELISA 检测

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不同激活状态的巨噬细胞对流行性乙型脑炎病毒感染的影响 被引量：2

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作者 徐晓伟 魏建超 +7 位作者 刘珂 邵东华 李蓓蓓 曹瑞兵 陈溥言 马志永 胡敬东 邱亚峰 《中国动物传染病学报》 CAS 北大核心 2019年第2期1-5,共5页

为了研究不同激活状态的巨噬细胞对流行性乙型脑炎病毒(Japanese encephalitis virus,JEV)感染的影响,并明确NO的产生在此过程中的作用,利用细胞因子将小鼠巨噬细胞系RAW264.7诱导成不同激活状态的巨噬细细胞,通过TCID_(50)、免疫荧光... 为了研究不同激活状态的巨噬细胞对流行性乙型脑炎病毒(Japanese encephalitis virus,JEV)感染的影响,并明确NO的产生在此过程中的作用,利用细胞因子将小鼠巨噬细胞系RAW264.7诱导成不同激活状态的巨噬细细胞,通过TCID_(50)、免疫荧光技术和实时荧光定量PCR方法比较JEV强毒株NJ2008在不同激活状态的巨噬细胞上的感染情况,并利用实时荧光定量PCR方法分析了调控NO产生的关键分子(iNOS和Agr1)的变化。结果显示,相对于PBS处理组,M1型巨噬细胞显著地抑制JEV的感染并伴随明显增加的iNOS/Arg1比值;而M2型巨噬细胞虽伴随有显著降低的iNOS/Arg1比值,但JEV在M2型巨噬细胞上的感染与PBS组差异无显著统计学意义。结果表明NO的上调表达在M1型巨噬细胞抑制JEV感染中起着主导作用。本研究为进一步揭示巨噬细胞在JEV感染中作用奠定基础。 展开更多

关键词 流行性乙型脑炎病毒 巨噬细胞 M1型巨噬细胞 M2型巨噬细胞

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猪流行性乙型脑炎RT-LAMP方法的建立与初步应用 被引量：3

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作者 卢冰霞 刘磊 +10 位作者 秦毅斌 赵武 梁家幸 郭旋 黎木兰 李斌 何颖 苏乾莲 梁保忠 闭炳芬 黄伟坚 《安徽农业科学》 CAS 2013年第12期5359-5361,5365,共4页

[目的]建立1种快速、灵敏、特异的检测猪流行性乙型脑炎病毒(JEV)逆转录环介导等温扩增(RT-LAMP)检测方法。[方法]根据JEV E基因序列的保守区6个位点设计了4条特异性LAMP引物,以JEV阳性样品RNA为模板进行一步法扩增,并对反应条件和反应... [目的]建立1种快速、灵敏、特异的检测猪流行性乙型脑炎病毒(JEV)逆转录环介导等温扩增(RT-LAMP)检测方法。[方法]根据JEV E基因序列的保守区6个位点设计了4条特异性LAMP引物,以JEV阳性样品RNA为模板进行一步法扩增,并对反应条件和反应体系进行了优化。[结果]该方法具有较高的灵敏度,其检测极限为0.5 pg;特异性试验表明其具有较高的特异性,对其他病毒性病原体均无扩增反应。与RT-Nested-PCR相比,2种方法检出率的符合率为90.9%。反应结束后可以通过添加化学发光剂进行可视化观察,大大缩短了检测时间。该方法无需特殊仪器,只需在水浴锅中进行,是一种适于基层的简便、灵敏、快速的猪JE的检测方法。[结论]成功建立了猪流行性乙型脑炎RT-LAMP方法,并在临床上进行了初步应用。 展开更多

关键词 猪流行性乙型脑炎病毒 RT-LAMP 敏感性 特异性

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猪流行性乙型脑炎的诊断与防制 被引量：1

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作者 吕茂杰 郁宏伟 +1 位作者 王娟 杨保收 《养猪》 2011年第6期102-104,共3页

猪乙型脑炎是由乙型脑炎病毒引起的一种动物和人共患的蚊媒病毒性疾病。该病不仅给人类健康带来巨大威胁,也给作为农业支柱产业的畜牧业造成巨大的经济损失。本文主要从乙型脑炎流行病学特点、发病后引起的临床症状、病理变化特征及其... 猪乙型脑炎是由乙型脑炎病毒引起的一种动物和人共患的蚊媒病毒性疾病。该病不仅给人类健康带来巨大威胁,也给作为农业支柱产业的畜牧业造成巨大的经济损失。本文主要从乙型脑炎流行病学特点、发病后引起的临床症状、病理变化特征及其诊断方法和防制措施方面进行阐述总结。 展开更多

关键词 流行性乙型脑炎病毒 流行病学 临床病理变化 诊断 防制

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猪流行性乙型脑炎及防治 被引量：1

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作者 林太明 李圣元 《畜禽业》 2008年第9期81-82,共2页

流行性乙型脑炎．又叫日本脑炎，是由流行性乙型脑炎病毒引起的一种中枢神经系统疾病为主要特征的人畜共患性疾病。这是一种严重危害人畜健康的蚊媒传染病。在流行性乙型脑炎的流行中蚊虫是重要的传播媒介。猪是乙脑的危害对象，同时猪... 流行性乙型脑炎．又叫日本脑炎，是由流行性乙型脑炎病毒引起的一种中枢神经系统疾病为主要特征的人畜共患性疾病。这是一种严重危害人畜健康的蚊媒传染病。在流行性乙型脑炎的流行中蚊虫是重要的传播媒介。猪是乙脑的危害对象，同时猪也是流行性乙型脑炎病毒最重要的自然增殖动物（扩增器）。在猪中该病毒流行环节是猪一蚊一猪或蚊一猪一蚊。猪发生1次本病后当年可以再发．第二年还可再感染．但症状一次比一次轻，最后成为无症状的隐性感染。感染的公猪精液也可作为媒介感染猪。目前本病多为隐性感染或呈散发性。 展开更多

关键词 流行性乙型脑炎病毒 公猪精液 中枢神经系统疾病 隐性感染 防治 传播媒介 危害对象 日本脑炎

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流行性乙型脑炎prM蛋白剪切位点突变的prM-E蛋白表达细胞系的建立 被引量：1

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作者 李业南 陈振师 +1 位作者 步志高 华荣虹 《中国预防兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2013年第3期189-192,201,共5页

为建立稳定共表达乙型脑炎病毒(JEV)完整M前体蛋白(prM)和E蛋白的BHK-21细胞系,本研究在prM蛋白furin蛋白酶剪切位点编码基因中引入突变,将突变后的prM基因克隆于质粒中构建重组表达质粒pCAG-JEV-prM(R89A)E。将重组质粒转染BHK-21细胞... 为建立稳定共表达乙型脑炎病毒(JEV)完整M前体蛋白(prM)和E蛋白的BHK-21细胞系,本研究在prM蛋白furin蛋白酶剪切位点编码基因中引入突变,将突变后的prM基因克隆于质粒中构建重组表达质粒pCAG-JEV-prM(R89A)E。将重组质粒转染BHK-21细胞,转染48 h后细胞用含G418的选择性培养基选择培养,进一步经细胞克隆纯化制备表达剪切位点突变的JEV prM-E蛋白的稳定细胞系。经IFA和western blot鉴定表明,该细胞系能表达JEV prM与E蛋白,所表达的prM蛋白未发生剪切;细胞经多次传代后仍能够稳定地共表达prM与E蛋白。该细胞系的建立为研究prM蛋白剪切对JEV粒子形成的影响以及亚单位疫苗的制备奠定了基础。 展开更多

关键词 流行性乙型脑炎病毒 prM蛋白 蛋白剪切 细胞系

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