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水貂阿留申病毒的微滴式数字PCR方法的建立及初步应用 被引量：1
1
作者 蔡晓庆 姜世金 +2 位作者 张金叶 孙圣福 王贵升 《中国预防兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2024年第2期164-170,共7页
为建立水貂阿留申病毒(AMDV)微滴式数字PCR (ddPCR)检测方法,本研究根据AMDV VP2基因的保守区设计特异性引物和探针,通过PCR扩增AMDV VP2基因并克隆至p MD19-T载体,构建重组质粒p MD19-T-AMDV,并经PCR和测序鉴定后利用该质粒标准品作为... 为建立水貂阿留申病毒(AMDV)微滴式数字PCR (ddPCR)检测方法,本研究根据AMDV VP2基因的保守区设计特异性引物和探针,通过PCR扩增AMDV VP2基因并克隆至p MD19-T载体,构建重组质粒p MD19-T-AMDV,并经PCR和测序鉴定后利用该质粒标准品作为模板,通过各反应条件的优化,初步建立了检测AMDV的ddPCR方法。分别以AMDV、水貂肠炎细小病毒、犬瘟热病毒、犬细小病毒、水貂流感病毒基因组为模板,按照本研究建立的ddPCR方法检测,评估其特异性;将1.43×10^(7)拷贝/μL~1.43×10^(0)拷贝/μL的重组质粒标准品作为模板,采用优化后的ddPCR和文献中的荧光定量PCR (qPCR)检测,评估该方法的敏感性;分别以不同浓度的重组质粒标准品作为模板,采用优化后的ddPCR分别进行批内和批间重复性试验,以变异系数(CV)评估该方法的重复性。优化结果显示,该方法的最佳引物终浓度为400 nmol/L (1.2μL)、探针终浓度为200 nmol/L (0.6μL)、退火温度为60℃。特异性试验结果显示,该方法仅可检测到AMDV和质粒标准品,而其他相关病毒均为阴性结果。敏感性试验结果显示,该方法对重组质粒标准品的检测限为1.43拷贝/μL,qPCR对质粒标准品的检测限为1.43×10^(2)拷贝/μL,前者比后者的敏感性高100倍。重复性试验结果,批内和批间重复性试验的变异系数均小于3%。对采集的70份病貂肝脏、脾、肾脏、环境拭子、肛拭子样品进行ddPCR和qPCR检测,结果显示,ddPCR对AMDV的检出率为24.28%(17/70);qPCR的检出率为15.7%(11/70),二者的阳性符合率为64.7%,阴性符合率为89.83%,总符合率为91.42%。上述结果表明,本研究建立的ddPCR方法特异性强、敏感性高和重复性好,可以检测各种临床样品及含量极低样品中的AMDV,为AMDV早期感染的检测、流行病学调查及AMD的防控提供有力技术手段。 展开更多
关键词 微滴式数字PCR 检测 水貂阿留申病毒
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水貂阿留申病毒微滴式数字PCR检测方法的建立与应用
2
作者 王春霞 商金源 +10 位作者 吴顺 闫曼平 冯二凯 罗国良 易立 赵宗正 高华 于清平 朱先鹏 程悦宁 王振军 《中国预防兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2024年第9期931-937,共7页
为建立一种准确且灵敏的水貂阿留申病毒(AMDV)微滴式数字PCR检测方法(dd PCR),本研究根据AMDV-G基因保守区,设计特异性引物及探针,并对反应条件进行优化,初步建立检测AMDV的dd PCR方法。同时对该方法的特异性、敏感性和重复性进行分析... 为建立一种准确且灵敏的水貂阿留申病毒(AMDV)微滴式数字PCR检测方法(dd PCR),本研究根据AMDV-G基因保守区,设计特异性引物及探针,并对反应条件进行优化,初步建立检测AMDV的dd PCR方法。同时对该方法的特异性、敏感性和重复性进行分析。结果显示,dd PCR的退火温度为55℃,最佳引物和探针终浓度均为10μmol/μL。绘制的标准曲线结果显示,核酸标准物质稀释倍数的对数与对应检出拷贝数的对数之间呈良好的线性关系(R^(2)=0.9945>0.99)。建立的dd PCR方法的特异性强,除能检测到AMDV以外,对相关病原如水貂犬瘟热病毒、犬细小病毒、貂肠炎病毒、犬冠状病毒、犬腺病毒I型、狂犬病毒的检测结果均为阴性。对AMDV核酸标准物质的检测限为6.2拷贝/μL,敏感性高,比荧光定量PCR(q PCR)敏感性高10倍。对不同稀释度AMDV核酸标准物质的批内和批间重复性试验的变异系数均<5%,重复性好。采用建立的dd PCR方法和荧光定量PCR方法对貂场采集的40份水貂脏器组织样品进行检测,两种检测结果基本一致,但dd PCR敏感性更高。上述结果表明,本研究建立了一种特异性强、灵敏度高、重复性好的AMDV定量检测方法,为水貂阿留申病毒的有效防控提供技术支持。 展开更多
关键词 水貂阿留申病毒 微滴式数字PCR 定量检测
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水貂阿留申病毒结构蛋白与非结构蛋白在疾病诊断与疫苗研发中的应用 被引量：8
3
作者 杨莘 易立 +2 位作者 王建科 罗彬 程世鹏 《动物医学进展》 CSCD 北大核心 2011年第1期69-72,共4页
水貂阿留申病是由水貂阿留申病毒引起的一种持续感染性疾病,危害毛皮动物养殖业的发展。水貂阿留申病毒的致病特点、免疫机制等与其他细小病毒不同,存在自身的复杂性。目前,众多研究者寻求新的疫苗来预防水貂阿留申病的发生,但没有取得... 水貂阿留申病是由水貂阿留申病毒引起的一种持续感染性疾病,危害毛皮动物养殖业的发展。水貂阿留申病毒的致病特点、免疫机制等与其他细小病毒不同,存在自身的复杂性。目前,众多研究者寻求新的疫苗来预防水貂阿留申病的发生,但没有取得理想的效果。疾病诊断及疫苗研发对防控水貂阿留申病具有积极的意义。水貂阿留申病毒结构蛋白在病毒感染、机体免疫过程中发挥关键作用,而非结构蛋白在病毒转录与复制过程中有着重要作用,疾病的诊断和疫苗的研发均在二者的基础上展开。应用水貂阿留申病毒结构蛋白与非结构蛋白建立新的水貂阿留申病毒诊断方法,研发新型基因工程疫苗,对控制水貂阿留申病的发生与传播,具有重要的意义。 展开更多
关键词 水貂阿留申病毒 结构蛋白 非结构蛋白 诊断 疫苗研发
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水貂阿留申病毒荧光定量PCR检测方法的建立及初步应用 被引量：8
4
作者 张秀丽 于慧娟 +5 位作者 徐超 张桉潮 宋兴超 郝俊伟 赵家平 杜锐 《中国畜牧兽医》 CAS 北大核心 2014年第9期1-5,共5页
根据水貂阿留申病毒(Aleutian mink disease virus,AMDV)基因序列(GenBank登录号:NC_001662.1)设计1对特异性引物,通过对荧光定量PCR反应条件的优化,建立了检测AMDV的SYBR GreenⅠ荧光定量PCR方法,该方法的灵敏度达10拷贝/μL,≥102拷贝... 根据水貂阿留申病毒(Aleutian mink disease virus,AMDV)基因序列(GenBank登录号:NC_001662.1)设计1对特异性引物,通过对荧光定量PCR反应条件的优化,建立了检测AMDV的SYBR GreenⅠ荧光定量PCR方法,该方法的灵敏度达10拷贝/μL,≥102拷贝/μL具有良好的特异性和重复性。同时利用该方法对8份疑似AMDV血清进行检测,结果6份阳性,阳性率为75%。本研究为水貂阿留申病的鉴别诊断及净群根除奠定了技术基础。 展开更多
关键词 水貂阿留申病毒 SYBR GreenⅠ 荧光定量PCR 标准曲线
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水貂阿留申病毒纳米PCR检测方法的建立与初步应用 被引量：6
5
作者 杨瑞梅 张传美 +1 位作者 张洪亮 单虎 《畜牧兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2016年第11期2288-2293,共6页
为建立便捷、灵敏的水貂阿留申病病毒（AMDV）纳米PCR检测方法,根据AMDV NS1基因的保守序列设计一对特异性引物,对纳米PCR反应的退火温度、胶体金浓度进行了优化;测序检测扩增基因是否发生变异;对特异性和灵敏度进行了评估。结果表明,... 为建立便捷、灵敏的水貂阿留申病病毒（AMDV）纳米PCR检测方法,根据AMDV NS1基因的保守序列设计一对特异性引物,对纳米PCR反应的退火温度、胶体金浓度进行了优化;测序检测扩增基因是否发生变异;对特异性和灵敏度进行了评估。结果表明,此纳米PCR的最佳退火温度为51℃,普通PCR为55℃;加入胶体金最佳浓度在0.2~0.8nmol·L-1,纳米PCR与普通PCR产物测序相似性大于99%。特异性检测表明该纳米PCR方法只扩增AMDV而不能扩增犬瘟热病毒和水貂肠炎细小病毒。在粪尿样品检测中该纳米PCR敏感性比普通PCR高10倍。检测40份临床样品,结果表明该方法比对流免疫电泳检测敏感性提高,从而为用粪、尿等低病毒样品检测水貂阿留申病提供了一种新的有效方法。 展开更多
关键词 水貂阿留申病病毒 纳米PCR 检测
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水貂阿留申病毒VP2基因主要抗原表位区的原核表达 被引量：8
6
作者 梁冬莹 华育平 曾祥伟 《东北林业大学学报》 CAS CSCD 北大核心 2007年第6期39-41,共3页
根据GenBank中已发表的水貂阿留申病毒(ADV)VP2基因核苷酸序列分别设计合成两对引物,用PCR方法扩增ADV国内分离株VP2基因中主要抗原表位区的两个片段,分别将其克隆到原核表达载体pMAL-c2的多克隆位点中。经酶切、PCR扩增和测序分析证实... 根据GenBank中已发表的水貂阿留申病毒(ADV)VP2基因核苷酸序列分别设计合成两对引物,用PCR方法扩增ADV国内分离株VP2基因中主要抗原表位区的两个片段,分别将其克隆到原核表达载体pMAL-c2的多克隆位点中。经酶切、PCR扩增和测序分析证实其已正确插入到表达载体中,且阅读框是正确的,构建原核表达载体pMAL-VPa和pMAL-VPb。阳性重组质粒转化宿主菌TB1,用IPTG进行诱导表达,对表达产物进行SDS-PAGE检测和免疫印迹分析。结果表明两段蛋白均获得了表达,表达产物的分子质量分别约为63、65kD,与理论推测的分子质量一致;并在终浓度为1mmol/L的IPTG诱导下,4h时其表达量达到高峰;Western blot分析表明表达蛋白能被兔抗MBP抗体所识别,具有一定的抗原性。 展开更多
关键词 水貂阿留申病毒 VP2基因 抗原表位 原核表达
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水貂阿留申病毒VP2蛋白Dot-ELISA检测方法的建立 被引量：4
7
作者 李晶 时坤 +4 位作者 曾范利 张妍 孙凡婷 刘杨 杜锐 《中国预防兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2015年第8期619-622,共4页
为建立一种适合于基层快速检测水貂阿留申病毒(ADV)的检测方法,本研究将ADV的VP2基因经重叠延伸PCR法进行扩增后克隆至表达载体p GEX-4T-1中进行原核表达,将纯化的重组蛋白作为包被抗原建立了ADV的Dot-ELISA检测方法,并与对流免疫电泳(C... 为建立一种适合于基层快速检测水貂阿留申病毒(ADV)的检测方法,本研究将ADV的VP2基因经重叠延伸PCR法进行扩增后克隆至表达载体p GEX-4T-1中进行原核表达,将纯化的重组蛋白作为包被抗原建立了ADV的Dot-ELISA检测方法,并与对流免疫电泳(CIEP)作对照试验。结果表明,抗原最适包被浓度为20μg/m L,最适血清稀释度为1∶200,酶标二抗最适工作浓度为1∶2 000,血清和酶标抗体最适反应温度为37℃,反应时间为45 min^60 min。阻断试验和交叉试验显示与常见的貂病毒性肠炎和貂犬瘟热阳性血清无交叉反应,表明其具有良好的特异性。采用建立的Dot-ELISA和CIEP对78份临床血清样品进行检测,结果显示Dot-ELISA阳性检出率为84.6%,CIEP的阳性检出率为80.8%,敏感性高于CIEP,两者符合率为96.2%。本研究建立的Dot-ELISA检测方法简便、快速、灵敏、特异、重复性好,适合基层单位用于水貂阿留申病快速诊断和疫病普查。 展开更多
关键词 水貂阿留申病毒 VP2基因 原核表达 DOT-ELISA检测
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水貂阿留申病毒环介导等温扩增(LAMP)检测方法的建立 被引量：8
8
作者 田国宁 张金玲 +2 位作者 李凯 田国华 丁葵英 《中国动物检疫》 CAS 2015年第6期79-82,共4页
为建立一种简便、快速、特异的水貂阿留申病毒(ADV)检测方法,根据Gen Bank中已登录的ADV基因组序列,选择水貂阿留申病毒VP2基因作为靶基因,设计并合成5套环介导等温扩增(LAMP)反应所需的引物,通过试验筛选出最佳引物,并进行最佳引物的... 为建立一种简便、快速、特异的水貂阿留申病毒(ADV)检测方法,根据Gen Bank中已登录的ADV基因组序列,选择水貂阿留申病毒VP2基因作为靶基因,设计并合成5套环介导等温扩增(LAMP)反应所需的引物,通过试验筛选出最佳引物,并进行最佳引物的特异性及敏感性试验,建立了LAMP快速检测方法。试验结果表明,该方法比普通PCR方法灵敏性高10倍,与其他的水貂源病毒不发生非特异性反应,并且具有良好的重复性。利用建立的LAMP检测方法对30份临床样品的阳性检出率为6.7%。该方法简便快速,为水貂阿留申病的检测提供了新的发展方向,有望成为简易的常规检测手段,尤其适用于基层应用。 展开更多
关键词 水貂 阿留申病毒 环介导等温扩增(LAMP) 检测 VP2基因
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水貂阿留申病病毒分子生物学研究进展 被引量：7
9
作者 李艳伍 张瑞 +1 位作者 姜平 贾赟 《动物医学进展》 CSCD 北大核心 2009年第9期100-104,共5页
水貂阿留申病病毒是一种在水貂中广泛存在的重要病原体。该病毒属阿留申病毒属,主要编码4种蛋白(结构蛋白VP1、VP2和非结构蛋白NS1、NS2)。VP1蛋白在协助病毒产生感染性方面起着重要作用;VP2蛋白是该病毒的主要免疫原性抗原,能体外中和... 水貂阿留申病病毒是一种在水貂中广泛存在的重要病原体。该病毒属阿留申病毒属,主要编码4种蛋白(结构蛋白VP1、VP2和非结构蛋白NS1、NS2)。VP1蛋白在协助病毒产生感染性方面起着重要作用;VP2蛋白是该病毒的主要免疫原性抗原,能体外中和病毒;NS1和NS2对病毒在宿主细胞中的复制起重要的调节作用。该病毒的分子生物学诊断技术主要有核酸杂交技术、PCR和基因芯片检测技术。 展开更多
关键词 水貂阿留申病病毒 结构蛋白 非结构蛋白 分子生物学诊断技术
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水貂阿留申病毒结构蛋白和非结构蛋白研究进展 被引量：4
10
作者 张瑞 李艳伍 +1 位作者 贾赟 许兰菊 《江西农业学报》 CAS 2009年第7期162-164,共3页
水貂阿留神病毒是一种在水貂中广泛存在的重要病原体。该病毒属阿留申病毒属,主要编码4种蛋白(VP1、VP2、NS1、NS2)。VP1蛋白在协助病毒产生感染性方面起着重要作用;VP2蛋白是该病毒的主要免疫原性抗原,能体外中和病毒;NS1和NS2对病毒... 水貂阿留神病毒是一种在水貂中广泛存在的重要病原体。该病毒属阿留申病毒属,主要编码4种蛋白(VP1、VP2、NS1、NS2)。VP1蛋白在协助病毒产生感染性方面起着重要作用;VP2蛋白是该病毒的主要免疫原性抗原,能体外中和病毒;NS1和NS2对病毒在宿主细胞中的复制起重要的调节作用。为此,综述了国内外关于水貂阿留申病毒结构蛋白和非结构蛋白的研究情况,以期为该病的进一步研究提供参考。 展开更多
关键词 水貂阿留申病毒 基因 结构蛋白 非结构蛋白 研究进展
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水貂阿留申病毒、肠炎病毒与犬瘟热病毒多重PCR检测方法的建立与应用 被引量：5
11
作者 马芹 王元智 +3 位作者 闫文卓 赵丽丽 陈洪岩 陆涛峰 《中国比较医学杂志》 北大核心 2017年第12期97-101,共5页
目的水貂阿留申病、病毒性肠炎与犬瘟热并称影响水貂健康的三大疫病,拟建立一种可同时检测三种病毒的多重PCR检测方法。方法针对三种病毒基因保守区分别设计了3对特异性引物,对貂阿留申病毒(ADV)和水貂肠炎病毒(MEV)的DNA模板和犬瘟热病... 目的水貂阿留申病、病毒性肠炎与犬瘟热并称影响水貂健康的三大疫病,拟建立一种可同时检测三种病毒的多重PCR检测方法。方法针对三种病毒基因保守区分别设计了3对特异性引物,对貂阿留申病毒(ADV)和水貂肠炎病毒(MEV)的DNA模板和犬瘟热病毒(CDV)的RNA模板进行了多重PCR扩增和扩增条件优化。结果 PCR可同时扩增出601 bp(ADV)、205 bp(MEV)和451 bp(CDV)的特异性目的条带,敏感性试验表明最低核酸检出量为ADV每微升2.67×10~4拷贝、MEV每微升3.02×10~4拷贝和CDV每微升1.72×10~5拷贝。临床样品检测结果表明多重PCR和单一PCR检测结果一致。结论建立的多重PCR检测方法可快速地检测ADV、MEV和CDV单一或混合感染的临床样品。 展开更多
关键词 多重PCR 水貂阿留申病毒 水貂肠炎病毒 犬瘟热病毒
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检测动物产品中水貂阿留申病毒和犬细小病毒复合PCR方法的建立和应用 被引量：3
12
作者 杜雄伟 李叶 胡传伟 《中国动物检疫》 CAS 2012年第8期43-45,共3页
水貂阿留申病(AD)和犬细小病毒病(CP)是危害经济动物健康的重要疫病,可造成巨大的经济损失。本研究建立了水貂阿留申病毒(ADV)、犬细小病毒(CPV)复合PCR检测方法,并对临床样品进行了大量检测,结果表明本方法特异、敏感、简便、快速,非... 水貂阿留申病(AD)和犬细小病毒病(CP)是危害经济动物健康的重要疫病,可造成巨大的经济损失。本研究建立了水貂阿留申病毒(ADV)、犬细小病毒(CPV)复合PCR检测方法,并对临床样品进行了大量检测,结果表明本方法特异、敏感、简便、快速,非常适宜临床样品的大量筛选检测,对经济动物疫情的快速诊断与控制、加强经济动物及其产品进出境的检验检疫工作,御疫情于国门之外有重要的意义。 展开更多
关键词 水貂阿留申病毒(ADV) 犬细小病毒(CPV) 复合PCR
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两种检测水貂阿留申病毒抗体方法敏感性的比较研究 被引量：1
13
作者 王振军 罗国良 +4 位作者 易立 郭利 冯二凯 程世鹏 程悦宁 《特产研究》 2019年第4期57-63,共7页
本研究对胶体金试纸条检测法与对流免疫电泳检测法检测水貂阿留申病毒抗体的敏感性进行对比研究。试验采用实验室制备的检验合格的试纸条,分别对20份不同效价的水貂阿留申病毒阳性质控血清和100份自然感染的田间血清进行检测,分析不同... 本研究对胶体金试纸条检测法与对流免疫电泳检测法检测水貂阿留申病毒抗体的敏感性进行对比研究。试验采用实验室制备的检验合格的试纸条,分别对20份不同效价的水貂阿留申病毒阳性质控血清和100份自然感染的田间血清进行检测,分析不同稀释度的阳性血清检出数量和阳性检出率,从而对两种检测方法的敏感性进行评估。结果显示,阳性质控血清在1:64倍以下稀释时,试纸条对阳性血清和弱阳性血清的检出率均为100%,对100份自然感染阳性血清检出率为96%,表明该试纸条的检测具有较高的敏感性。 展开更多
关键词 胶体金试纸条 对流免疫电泳 水貂阿留申病毒抗体 敏感性
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水貂阿留申病毒地方强毒株ADV-LN的分离鉴定
14
作者 贾赟 李艳伍 +6 位作者 孙铭英 张雪 张岩岩 宋大贺 刘钊 王全凯 孙颖杰 《中国畜牧兽医》 CAS 北大核心 2016年第6期1597-1603,共7页
本研究采用对流免疫电泳方法(CIEP)检测辽宁水貂养殖场疑似水貂阿留申病毒(aleutian mink disease virus,ADV)水貂血清抗体,采集抗体阳性水貂的肝脏、脾脏、肾脏和肠系膜淋巴结组织,电镜观察存在细小病毒样颗粒。组织液研磨无菌处理后,... 本研究采用对流免疫电泳方法(CIEP)检测辽宁水貂养殖场疑似水貂阿留申病毒(aleutian mink disease virus,ADV)水貂血清抗体,采集抗体阳性水貂的肝脏、脾脏、肾脏和肠系膜淋巴结组织,电镜观察存在细小病毒样颗粒。组织液研磨无菌处理后,接种CRFK细胞,盲传6代,取病毒细胞分离液用PCR方法检测,呈ADV阳性。将病毒分离液纯化后接种健康水貂,隔离观察,接种后3d即出现食欲减退,贫血,被毛无光泽,后期出现拒食、狂饮、死亡,个别水貂出现神经症状,表现抽搐、痉挛、步态蹒跚、共济失调,证明分离获得的病毒为ADV强毒株,命名为ADV-LN株。 展开更多
关键词 水貂阿留申病毒 分离 鉴定
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水貂阿留申病病毒VP2截短基因的原核表达
15
作者 李晶 时坤 +2 位作者 曾范利 宋继伟 杜锐 《动物医学进展》 北大核心 2015年第4期15-18,共4页
为获得水貂阿留申病病毒G株(ADV-G株)VP2截短基因表达的蛋白,将ADV-G株VP2基因的主要抗原区片段克隆至原核表达载体pGEX-4T-1中,通过不同浓度的IPTG,不同诱导时间以及加入不同的化学分子伴侣(甘油、葡萄糖、蔗糖、二甲基亚砜、乙醇)进... 为获得水貂阿留申病病毒G株(ADV-G株)VP2截短基因表达的蛋白,将ADV-G株VP2基因的主要抗原区片段克隆至原核表达载体pGEX-4T-1中,通过不同浓度的IPTG,不同诱导时间以及加入不同的化学分子伴侣(甘油、葡萄糖、蔗糖、二甲基亚砜、乙醇)进行诱导表达,确定目的蛋白表达的最佳条件。经SDS-PAGE和Western blot分析,表明终浓度为1mmol/L的IPTG诱导6h目的蛋白的表达量最高,分子质量约为53ku。SDS-PAGE分析表明,葡萄糖和乙醇抑制了目的蛋白的表达,而蔗糖、甘油和二甲基亚砜提高了目的蛋白的表达量,获得的目的蛋白具有良好的反应原性。 展开更多
关键词 水貂阿留申病病毒 VP2截短基因 原核表达
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水貂阿留申病毒NS1基因在大肠杆菌中的分段表达
16
作者 刘红娜 王文玉 +5 位作者 张云 杨宇航 郝俊伟 时坤 李健明 杜锐 《中国畜牧兽医》 CAS 北大核心 2014年第4期32-36,共5页
利用DNAStar Protean模块预测分析水貂阿留申病毒(aleutian disease virus,ADV)NS1基因后,设计3对特异性引物,以吉林农业大学经济动物实验室保存的NS1全长克隆质粒NS1-pMD18-T为模板扩增NS1基因的3个截短片段,分别命名为L1 N1、L2 N2、L... 利用DNAStar Protean模块预测分析水貂阿留申病毒(aleutian disease virus,ADV)NS1基因后,设计3对特异性引物,以吉林农业大学经济动物实验室保存的NS1全长克隆质粒NS1-pMD18-T为模板扩增NS1基因的3个截短片段,分别命名为L1 N1、L2 N2、L3 N3基因,构建克隆质粒pMD18-T-L1N1、pGEM-T-L2N2及pMD18-T-L3N3。经测序鉴定正确后,将经EcoRⅠ、SalⅠ双酶切的3个NS1基因片段连接至经相同双酶切的pGEX-4T-1原核表达载体,并转化入表达宿主菌BL21(DE3)感受态细胞,利用IPTG进行诱导表达。采用SDS-PAGE和Western blotting检测重组菌在大肠杆菌中的表达情况。结果表明,成功构建了3段重组原核表达质粒pGEX-4T-L1N1、pGEX-4T-L2N2、pGEX-4T-L3N3,SDS-PAGE结果显示分别表达出大小约57、51、44ku的目的条带,与预期相符。Western blotting进一步证实获得的3种蛋白能被ADV阳性血清识别,具有反应原性。本试验首次对ADV NS1基因在大肠杆菌中进行分段表达,为后续研制ADV的亚单位疫苗奠定基础。 展开更多
关键词 水貂阿留申病毒NS1基因 大肠杆菌 分段表达
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水貂阿留申病毒VP2蛋白单克隆抗体的制备
17
作者 姜亦飞 于可响 +2 位作者 林树乾 张世栋 李峰 《山东农业科学》 2013年第9期5-8,共4页
本研究利用PCR方法从水貂阿留申病毒相关病料中扩增出VP2蛋白部分基因,并进行原核表达,成功获得VP2重组蛋白;利用纯化的VP2重组蛋白免疫BALB/c小鼠,取其脾细胞与骨髓瘤细胞融合,成功获得3株杂交瘤细胞:1F4F7D9、3E9G3D4和4B8B3F8;分别... 本研究利用PCR方法从水貂阿留申病毒相关病料中扩增出VP2蛋白部分基因,并进行原核表达,成功获得VP2重组蛋白;利用纯化的VP2重组蛋白免疫BALB/c小鼠,取其脾细胞与骨髓瘤细胞融合,成功获得3株杂交瘤细胞:1F4F7D9、3E9G3D4和4B8B3F8;分别接种小鼠,间接ELISA检测结果表明,3组实验小鼠腹水的单克隆抗体效价均在106以上。 展开更多
关键词 水貂阿留申病毒 VP2重组蛋白 单克隆抗体
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水貂阿留申病毒TaqMan-MGB荧光定量PCR检测方法的建立与应用 被引量：4
18
作者 贾赟 刘钊 +5 位作者 宋大贺 李艳伍 张岩岩 栾慎顺 王全凯 孙颖杰 《中国预防兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2016年第11期898-902,共5页
为建立一种快速、敏感检测水貂阿留申病毒(AMDV)的方法,本研究根据AMDV的VP2基因保守区设计特异性引物和MGB探针,并优化检测反应条件,建立了AMDV的TaqMan荧光定量PCR检测方法。结果显示,以重组质粒为标准品建立的标准曲线在1.0×10~... 为建立一种快速、敏感检测水貂阿留申病毒(AMDV)的方法,本研究根据AMDV的VP2基因保守区设计特异性引物和MGB探针,并优化检测反应条件,建立了AMDV的TaqMan荧光定量PCR检测方法。结果显示,以重组质粒为标准品建立的标准曲线在1.0×10~2拷贝/μL^1.0×10~8拷贝/μL内具有良好的线性关系,相关系数(R^2)为0.998。该方法仅对AMDV的靶基因扩增呈阳性,而对猪细小病毒、犬细小病毒、水貂肠炎细小病毒等相关病毒检测结果均为阴性,特异性良好。该方法对AMDV检测的灵敏度为10拷贝/μL,为普通PCR灵敏度的100倍;组内和组间重复性试验表明该方法的组内和组间变异系数均小于2%,具有良好的重复性。应用建立方法和普通PCR方法分别对40份疑似临床组织病料样品进行检测,该方法检出率比普通PCR高约7.5%。本研究结果表明建立的AMDV TaqMan-MGB荧光定量PCR方法灵敏、快速、特异性强、重复性好,适用于对AMDV的快速定量检测。 展开更多
关键词 水貂阿留申病毒 TAQMAN-MGB探针 荧光定量PCR
全文增补中
水貂阿留申病病毒单克隆抗体的研制和初步应用
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作者 华育平 王金生 《中国畜禽传染病》 CSCD 1990年第6期49-52,共4页
以 Sp2/0骨髓瘤细胞与以水貂阿留申病病毒抗原免疫的 BALB/C 鼠脾细胞融合,建立了 FA_2和 SD_3二个杂交瘤细胞株.其分泌的单克隆抗体(McAb),用 ELISA 和IF 方法测定证明,具有抗水貂阿留申病病毒的特异性.聚丙烯酰胺凝胶电泳仅出现一条带... 以 Sp2/0骨髓瘤细胞与以水貂阿留申病病毒抗原免疫的 BALB/C 鼠脾细胞融合,建立了 FA_2和 SD_3二个杂交瘤细胞株.其分泌的单克隆抗体(McAb),用 ELISA 和IF 方法测定证明,具有抗水貂阿留申病病毒的特异性.聚丙烯酰胺凝胶电泳仅出现一条带.用兔抗鼠免疫球蛋白标准血清做免疫双扩散试验,均属 IgG_1亚类.染色体计数、克隆培养及抗体分泌的动力学变化结果都表明,其遗传特性稳定,具有分泌较高滴度抗体能力.以酶联 McAb 做ELISA,对17份貂血清进行检测,其结果与 PPA-ELISA结果基本一致.初步证明.此 McAb 具有实际应用价值. 展开更多
关键词 水貂 阿留申病 单克隆抗体 病毒
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水貂阿留申病病毒研究进展 被引量：1
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作者 汪婷婷 马青霞 +7 位作者 刘宏莹 许立慧 刘莹玉 宫庆龙 李健明 时坤 冷雪 杜锐 《中国畜牧兽医》 CAS CSCD 北大核心 2023年第8期3354-3363,共10页
水貂阿留申病(Aleutian mink disease,AMD)是由水貂阿留申病病毒(Aleutian mink disease virus,AMDV)引起的水貂的重要传染性疾病之一,深入开展对AMDV的研究对于该病的防控有重要意义。AMDV基因组全长约为4.8 kb,主要编码2种结构蛋白和... 水貂阿留申病(Aleutian mink disease,AMD)是由水貂阿留申病病毒(Aleutian mink disease virus,AMDV)引起的水貂的重要传染性疾病之一,深入开展对AMDV的研究对于该病的防控有重要意义。AMDV基因组全长约为4.8 kb,主要编码2种结构蛋白和3种非结构蛋白,它们在病毒复制、增殖及致病过程中发挥重要作用。AMDV的复制依赖于代谢活跃的细胞,对于幼貂,病毒感染肺泡Ⅱ型细胞会造成急性致死性肺炎,感染巨噬细胞则会引起成年水貂患高丙种球蛋白血症和免疫复合物介导的肾小球肾炎等慢性进行性疾病。笔者从AMDV侵入细胞的受体途径、诱导细胞凋亡途径及病毒复制等方面对其致病机理进行阐述。AMDV在全世界范围内广泛流行,现有的检测方法主要分为血清学诊断方法和分子生物学诊断方法。目前,尚未开发出安全有效的针对AMDV的商品化疫苗,随着生物学技术的快速发展,在灭活疫苗、DNA疫苗和亚单位疫苗的研制上有所进展;抗病毒的新方法,如筛选AMDV耐受貂,提高水貂免疫力和靶向适配体技术为AMD的防控提供了新思路。文章从AMDV编码蛋白功能、病毒细胞嗜性与复制、临床表现与致病机制、诊断方法及防治措施等方面对近年来国内外AMDV的研究进展进行总结,旨在为AMDV安全有效疫苗和防治药物的研发提供参考。 展开更多
关键词 水貂阿留申病病毒(amdv) 分子蛋白 细胞嗜性 致病机制 防治措施
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