Neuritin毕赤酵母表达系统的构建及其对PC12细胞的影响 被引量：6

1

作者 张树军 赵臣 +4 位作者 狄建军 穆莎茉莉 仙玲玲 于娜 黄瑾 《生物技术通报》 CAS CSCD 北大核心 2013年第10期148-152,共5页

旨在构建Neuritin的毕赤酵母表达系统获得大量有活性的Neuritin蛋白,研究其神经生物学功能。PCR扩增编码neuritin基因cDNA序列,并纯化回收,通过酶切和连接插入穿梭载体pPIC9K中,转化大肠杆菌DH5α,neuritin-pPIC9k重组质粒经PCR与测序... 旨在构建Neuritin的毕赤酵母表达系统获得大量有活性的Neuritin蛋白,研究其神经生物学功能。PCR扩增编码neuritin基因cDNA序列,并纯化回收,通过酶切和连接插入穿梭载体pPIC9K中,转化大肠杆菌DH5α,neuritin-pPIC9k重组质粒经PCR与测序鉴定后,使用SalⅠ酶切使其线性化,电击转化酵母菌GS115,经筛选与鉴定,成功构建了Neuritin的毕赤酵母表达系统。结果表明,使用甲醇诱导其表达,SDS-PAGE和Western blot分析得到11 kD的Neuritin蛋白,纯化的Neuritin蛋白加入PC12细胞培养液中,能促进其突起的生长。 展开更多

关键词 NEURITIN PPIC9K 毕赤酵母表达系统 PC12细胞

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印第安纳型水泡性口炎病毒核衣壳蛋白基因在毕赤酵母表达系统中的表达 被引量：1

2

作者 陈义平 盛祖勋 +2 位作者 赵永刚 王宝安 王志亮 《中国动物检疫》 CAS 北大核心 2006年第9期22-24,共3页

将含有IN型VSV核衣壳蛋白基因的重组质粒pET-32a/N用EcoRI和NotI进行双酶切,目的基因克隆到表达载体pPICZαA,构建重组质粒pPICZαA/N。用SacI酶切线性化,并以电转化方法转化受体酵母菌GS115,PCR证实目的基因整合到重组酵母菌染色体中,... 将含有IN型VSV核衣壳蛋白基因的重组质粒pET-32a/N用EcoRI和NotI进行双酶切,目的基因克隆到表达载体pPICZαA,构建重组质粒pPICZαA/N。用SacI酶切线性化,并以电转化方法转化受体酵母菌GS115,PCR证实目的基因整合到重组酵母菌染色体中,经鉴定所获得的重组酵母菌株为Muts表型。用甲醇对重组酵母进行诱导表达,经SDS-PAGE和Westernblot鉴定,核衣壳蛋白基因在毕赤酵母中获得表达,目的蛋白分子量大小为约75kDa,表达量约占菌体总量的20%,并能够被VSV阳性血清所识别,可用于VSV的血清学检测。 展开更多

关键词 水泡性口炎病毒 核衣壳蛋白基因 毕赤酵母表达系统

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浅析巴斯德毕赤酵母表达系统的研究 被引量：1

3

作者 王艳 《山东畜牧兽医》 2010年第10期86-87,共2页

对于一个有商业潜质和广阔市场前景的兽用蛋白质类药物的研究,主要是要寻找一条稳定的工艺条件和获得较高的工作效率,巴斯德毕赤酵母表达系统就具有这方面的优点,其优越性表现在：分泌性表达,不需要复性,有效率为100%,纯化程序简单,大... 对于一个有商业潜质和广阔市场前景的兽用蛋白质类药物的研究,主要是要寻找一条稳定的工艺条件和获得较高的工作效率,巴斯德毕赤酵母表达系统就具有这方面的优点,其优越性表现在：分泌性表达,不需要复性,有效率为100%,纯化程序简单,大大降低了生产成本,尤其适用于动物干扰素的表达。 展开更多

关键词 毕赤酵母表达系统 巴斯德 分泌性表达 蛋白质类 市场前景 工作效率 工艺条件 生产成本

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黑曲霉葡萄糖氧化酶基因改造及其在毕赤酵母中的表达 被引量：3

4

作者 聂金梅 李阳源 +2 位作者 刘金山 王勇 唐业 《江苏农业科学》 2018年第20期17-21,共5页

为构建并筛选高效表达的葡萄糖氧化酶基因毕赤酵母工程菌株,采用PCR法从黑曲霉基因组中获得葡萄糖氧化酶全长基因(GOD),采用定点突变法和重叠PCR法获得GOD^(mut)基因,将其插入到pPICZαA中,获得重组质粒pPIC-GOD^(mut),经Pme I线性化后... 为构建并筛选高效表达的葡萄糖氧化酶基因毕赤酵母工程菌株,采用PCR法从黑曲霉基因组中获得葡萄糖氧化酶全长基因(GOD),采用定点突变法和重叠PCR法获得GOD^(mut)基因,将其插入到pPICZαA中,获得重组质粒pPIC-GOD^(mut),经Pme I线性化后,用电击法转化毕赤酵母菌株X33,经大量筛选,获得1株高效分泌表达的工程菌株X33-pPIC-GOD^(mut),在此基础上,去除GOD基因的信号肽,用同样的试验方法构建并筛选高效分泌表达的工程菌株X33-pPIC-GODnew,结果表明:X33-pPIC-GOD^(mut)的产酶水平为460. 3 U/mL,X33-pPIC-GODnew的产酶水平为714. 9 U/mL,是前者的1. 52倍,该酶的最适作用温度和最适作用pH值分别为40℃和5. 0,成功获得1株高效稳定表达的葡萄糖氧化酶基因毕赤酵母工程菌株。 展开更多

关键词 葡萄糖氧化酶 黑曲霉 毕赤酵母表达系统 信号肽

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汉坦病毒囊膜糖蛋白G2在毕赤酵母GS115中的表达及鉴定 被引量：1

5

作者 李璞媛 白文涛 +6 位作者 张芳琳 吴兴安 胡刚 刘艳丽 王海涛 张伟 徐志凯 《科学技术与工程》 2007年第8期1577-1581,共5页

构建了编码汉坦病毒囊膜糖蛋白G2基因的重组质粒,在毕赤酵母中表达,为汉坦病毒基因工程疫苗的研究提供实验基础。利用PCR法从含汉滩病毒76-118株M基因的M56质粒中扩增编码糖蛋白G2的基因片段,克隆入酵母分泌表达载体pPICZαA,构建重组质... 构建了编码汉坦病毒囊膜糖蛋白G2基因的重组质粒,在毕赤酵母中表达,为汉坦病毒基因工程疫苗的研究提供实验基础。利用PCR法从含汉滩病毒76-118株M基因的M56质粒中扩增编码糖蛋白G2的基因片段,克隆入酵母分泌表达载体pPICZαA,构建重组质粒pPICZαA-G2。酶切鉴定挑取的阳性克隆,转化入GS115工程菌,在含100μg/mLZeocin的YPD培养基上筛选。挑选单菌落,PCR鉴定阳性克隆,用0.5%甲醇诱导表达,并利用SDS-PAGE及Western-Blot鉴定表达产物。序列分析表明所获得的基因片段与编码汉滩病毒76-118株囊膜糖蛋白G2的基因一致;100μg/mLZeocinYPD培养基上筛选出含pPICZαA-G2转化子,PCR鉴定为阳性克隆;SDS-PAGE可见约70kDa处有目的蛋白表达条带,经Western-Blot证实该条带为汉滩病毒囊膜糖蛋白G2。成功地构建了重组酵母表达载体pPICZαA-G2,并在毕赤酵母中初步表达成功,为今后汉坦病毒囊膜糖蛋白G2表达纯化以及基因工程疫苗的制备奠定了一定基础。 展开更多

关键词 汉坦病毒 囊膜糖蛋白G2 毕赤酵母表达系统 蛋白表达

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外源蛋白在毕赤酵母中的高效表达策略 被引量：9

6

作者 孙玮遥 王向东 林剑 《中国酿造》 CAS 北大核心 2016年第9期11-15,共5页

毕赤酵母(Pichia pastoris)表达系统是目前应用最为广泛的蛋白表达系统之一,已成功表达了数百种外源蛋白。但不同外源蛋白的表达量差异较大,能够实现工业化生产的蛋白表达体系并不多,如何提高目的蛋白在该系统中的表达量有着重要的理论... 毕赤酵母(Pichia pastoris)表达系统是目前应用最为广泛的蛋白表达系统之一,已成功表达了数百种外源蛋白。但不同外源蛋白的表达量差异较大,能够实现工业化生产的蛋白表达体系并不多,如何提高目的蛋白在该系统中的表达量有着重要的理论和现实意义。该文从发酵工艺方面对影响外源蛋白表达的各种因素做了具体阐述,主要包括培养基的选择与优化、发酵过程参数的控制、分泌型蛋白酶的降解抑制以及诱导型毕赤酵母的甲醇流加机制,旨在提高外源蛋白表达量。 展开更多

关键词 毕赤酵母表达系统 外源蛋白 发酵工艺 优化

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抗菌肽牛乳铁蛋白肽衍生肽在毕赤酵母中的表达及活性鉴定 被引量：1

7

作者 李忠清 王亮 《生物技术通报》 CAS CSCD 北大核心 2011年第6期145-149,共5页

利用巴斯德毕赤酵母系统表达抗菌肽牛乳铁蛋白肽衍生肽简称LfcinBD,获得的表达产物具有较强的抗菌活性。将人工设计的用化学合成法合成的以酵母偏爱密码子编码的LfcinBD基因片段克隆到巴斯德毕赤酵母分泌型表达载体pPIC9K中,获得的重组... 利用巴斯德毕赤酵母系统表达抗菌肽牛乳铁蛋白肽衍生肽简称LfcinBD,获得的表达产物具有较强的抗菌活性。将人工设计的用化学合成法合成的以酵母偏爱密码子编码的LfcinBD基因片段克隆到巴斯德毕赤酵母分泌型表达载体pPIC9K中,获得的重组质粒pPIC9K-LfcinBD通过限制性内切酶SacⅠ酶切线性化,电击法转化毕赤酵母GS115宿主菌,G418抗性筛选,得到高拷贝转化子。经PCR检测,LfcinBD基因与毕赤酵母染色体稳定整合。阳性克隆经甲醇诱导表达LfcinBD,诱导表达5 d,每24 h取上清1 mL,进行抑菌试验。结果表明,抗菌肽牛乳铁多肽衍生肽基因已整合到酵母细胞基因组中并获得表达,经0.5%甲醇在30℃诱导48 h可产生较强抗菌活性的抗菌肽,而且对氨苄青霉素抗性的大肠杆菌亦有较强的抑菌作用。 展开更多

关键词 牛乳铁蛋白肽衍生肽(LfcinBD) 毕赤酵母表达系统 抗菌活性

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HPV16 L1在整合型重组毕赤酵母中的表达及病毒样颗粒的纯化

8

作者 田晓娟 冯娟 +2 位作者 张丽芳 李文姝 薛向阳 《中国人兽共患病学报》 CAS CSCD 北大核心 2014年第5期479-483,共5页

目的构建可稳定表达HPV16L1的整合型重组毕赤酵母,并纯化自主组装成的HPV16L1病毒样颗粒(VLPs)。方法根据酵母密码子偏爱性优化HPV16L1基因并克隆到pPIC3.5K表达载体,构建pPIC3.5K/HPV16L1重组质粒;重组质粒经Bgl II酶切线性化后,电转化... 目的构建可稳定表达HPV16L1的整合型重组毕赤酵母,并纯化自主组装成的HPV16L1病毒样颗粒(VLPs)。方法根据酵母密码子偏爱性优化HPV16L1基因并克隆到pPIC3.5K表达载体,构建pPIC3.5K/HPV16L1重组质粒;重组质粒经Bgl II酶切线性化后,电转化至GS115菌株中,筛选HPV16L1重组毕赤酵母。阳性整合菌株甲醇诱导后,以HPV16L1单克隆抗体检测目的蛋白表达;采用肝素亲和层析法纯化HPV16L1VLPs并进行透射电镜观察。结果PCR、酶切和测序分析表明成功构建了pPIC3.5K/HPV16L1重组质粒。成功构建的HPV16L1重组毕赤酵母甲醇诱导后,Western blot证实重组酵母菌裂解产物存在HPV16L1目的蛋白。肝素亲和纯化后,透射电镜观察到了直径大约55nm的VLPs,其形态与HPV16天然病毒颗粒相似。结论利用整合型重组毕赤酵母表达系统成功表达了HPV16L1蛋白,并用肝素亲和纯化可快速获得结构完整的HPV16L1VLPs,为HPV16预防性疫苗的研制奠定基础。 展开更多

关键词 人乳头瘤病毒 主要衣壳蛋白L1 毕赤酵母表达系统 病毒样颗粒

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白藜芦醇合酶基因的克隆及对毕赤酵母的转化 被引量：4

9

作者 郭芝光 尉亚辉 +2 位作者 刘蕾 张儒 朱剑光 《西北大学学报（自然科学版）》 CAS CSCD 北大核心 2006年第2期263-266,共4页

目的建立白藜芦醇合酶基因的毕赤酵母表达系统。方法通过PCR、限制性内切酶消化、连接、电激等方法,构建表达载体,转化毕赤酵母GS115。结果从葡萄基因组DNA中扩增得到了 1 200 bp目的基因,并克隆至pBS-T栽体;成功构建了表达载体pPIC3．5... 目的建立白藜芦醇合酶基因的毕赤酵母表达系统。方法通过PCR、限制性内切酶消化、连接、电激等方法,构建表达载体,转化毕赤酵母GS115。结果从葡萄基因组DNA中扩增得到了 1 200 bp目的基因,并克隆至pBS-T栽体;成功构建了表达载体pPIC3．5K／RS;目的基因成功整合进毕赤酵母GS115基因组中。测序及PCR鉴定证明,白藜芦醇合酶基因的毕赤酵母表达系统建立成功。结论所得方法无需高质量的RNA,从而降低了试验条件,达到了快速简便的目的。 展开更多

关键词 白藜芦醇 白藜芦醇合酶 基因克隆 毕赤酵母表达系统

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华北大黑鳃金龟丝氨酸羧肽酶在不同体系中的表达 被引量：2

10

作者 张雅昆 赵丹 +3 位作者 郭巍 刘小民 徐大庆 孙伟明 《华北农学报》 CSCD 北大核心 2013年第5期44-47,共4页

丝氨酸羧肽酶(Serine carboxypeptidases,SCPs)是一类在酸性pH环境下参与多肽和蛋白质的加工、修饰与降解等多个重要环节的真核生物蛋白水解酶。根据华北大黑鳃金龟丝氨酸羧肽酶(HoSCP)全长基因序列设计引物,利用PCR方法克隆hoscp基因... 丝氨酸羧肽酶(Serine carboxypeptidases,SCPs)是一类在酸性pH环境下参与多肽和蛋白质的加工、修饰与降解等多个重要环节的真核生物蛋白水解酶。根据华北大黑鳃金龟丝氨酸羧肽酶(HoSCP)全长基因序列设计引物,利用PCR方法克隆hoscp基因并分别连接到表达载体pET28b和pPIC9K上,转化大肠杆菌BL21和毕赤酵母GS115,实现了其在原核以及真核体系中的表达。结果显示,HoSCP在原核细胞及酵母细胞中均能稳定表达50 kDa的特异蛋白。HoSCP的成功表达为其在华北大黑鳃金龟体内的活性和生物学功能研究提供了可能。 展开更多

关键词 华北大黑鳃金龟 丝氨酸羧肽酶 HoSCP 原核表达系统 毕赤酵母表达系统

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甜菜夜蛾围食膜几丁质结合蛋白SeCBP66在不同体系中的表达

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作者 刘彬 李瑞军 +4 位作者 郭巍 孙伟明 赵丹 单鸣 徐大庆 《河北农业大学学报》 CAS CSCD 北大核心 2012年第4期80-84,共5页

分析甜菜夜蛾(Spodoptera exigua)围食膜几丁质结合蛋白SeCBP66氨基酸序列,利用PCR技术扩增获得缺失信号肽编码区围食膜几丁质结合蛋白的基因△(s)-secbp66。将△(s)-secbp66克隆到表达载体pET28a和pPIC9K,分别转化大肠杆菌BL21和毕赤酵... 分析甜菜夜蛾(Spodoptera exigua)围食膜几丁质结合蛋白SeCBP66氨基酸序列,利用PCR技术扩增获得缺失信号肽编码区围食膜几丁质结合蛋白的基因△(s)-secbp66。将△(s)-secbp66克隆到表达载体pET28a和pPIC9K,分别转化大肠杆菌BL21和毕赤酵母GS115进行原核及真核表达;将△(s)-secbp66克隆到质粒pFastBacTM,转化大肠杆菌DH10Bac构建重组Bacmid,转染昆虫细胞系Sf9及BTI-TN-5B1-4(HighFive)从而在昆虫细胞系中进行表达。结果表明:SeCBP66在原核细胞中未见表达,在酵母细胞中表达产物呈弥散状,而在昆虫细胞系中则能稳定的表达116kDa的特异蛋白。 展开更多

关键词 甜菜夜蛾 SeCBP66蛋白 原核表达系统 毕赤酵母表达系统 昆虫细胞系

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柞蚕抗菌肽cecropin B的结构和抑菌活性及基因表达分析

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作者 叶博 赵振军 +5 位作者 李佩佩 岳冬梅 张波 王林美 李树英 范琦 《蚕业科学》 CAS CSCD 北大核心 2019年第5期660-668,共9页

抗菌肽对昆虫抵御病原微生物的侵染具有重要作用。使用在线软件分析成熟的柞蚕抗菌肽cecropin B高级结构,并与鳞翅目其他昆虫抗菌肽进行聚类分析。利用巴斯德毕赤酵母体外表达柞蚕cecropin B,并测试重组柞蚕cecropin B的抑菌活性。采用q... 抗菌肽对昆虫抵御病原微生物的侵染具有重要作用。使用在线软件分析成熟的柞蚕抗菌肽cecropin B高级结构,并与鳞翅目其他昆虫抗菌肽进行聚类分析。利用巴斯德毕赤酵母体外表达柞蚕cecropin B,并测试重组柞蚕cecropin B的抑菌活性。采用qRT-PCR方法检测3个不同品种柞蚕蛹在柞蚕肠球菌、柞蚕核型多角体病毒和柞蚕微孢子虫感染情况下,体内cecropinB基因的转录表达情况。结果显示,柞蚕cecropin B成熟肽的N端和C端分别有1个α螺旋结构,聚类分析将柞蚕cecropin B归为昆虫抗菌肽cecropin B亚型;柞蚕cecropin B在巴斯德毕赤酵母工程菌中得到体外表达,重组柞蚕cecropin B具有体外抑菌活性;柞蚕肠球菌感染的不同品种柞蚕蛹的cecropinB基因转录表达水平均上调,柞蚕核型多角体病毒或柞蚕微孢子虫感染的不同品种柞蚕蛹的cecropinB基因转录表达水平有明显差异,提示柞蚕cecropin B在柞蚕抵抗不同病原微生物的感染过程中可能具有不同的作用。 展开更多

关键词 柞蚕 抗菌肽cecropin B 巴斯德毕赤酵母表达系统 病原微生物 实时荧光定量PCR

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牦牛胃溶菌酶抗小鼠腹泻的研究 被引量：1

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作者 杨杜基 袁小迪 +5 位作者 李飙 张雨寒 孙鸿炜 刘益丽 袁国荣 江明锋 《动物营养学报》 CAS CSCD 北大核心 2024年第3期1952-1963,共12页

本研究采用PichiaPink^(TM)毕赤酵母表达系统对牦牛胃溶菌酶进行异源表达,以探索提高重组牦牛胃溶菌酶表达量的方法以及重组牦牛胃溶菌酶对大肠杆菌O111所致小鼠腹泻的治疗作用。试验选取10只体重相近的无特定病原体昆明小鼠,用大肠杆菌... 本研究采用PichiaPink^(TM)毕赤酵母表达系统对牦牛胃溶菌酶进行异源表达,以探索提高重组牦牛胃溶菌酶表达量的方法以及重组牦牛胃溶菌酶对大肠杆菌O111所致小鼠腹泻的治疗作用。试验选取10只体重相近的无特定病原体昆明小鼠,用大肠杆菌O111建立小鼠腹泻模型;建模成功后取30只小鼠随机分为6组,每组5只,设对照组、腹泻模型组、牦牛胃溶菌酶组、重组牦牛胃溶菌酶组、抗生素治疗组、溶菌酶产品治疗组,除对照组和腹泻模型组外其余各组灌胃给药,记录小鼠采食量及体重;第4天采血后全部扑杀,取小鼠十二指肠组织制切片做形态学观察;取肠道内容物进行肠道菌群Alpha和Beta多样性分析。结果表明:重组牦牛胃溶菌酶在诱导96 h时表达量最高,分子质量约为15.6 ku,比活性为1428.58 U/mg。攻毒后腹泻模型组、溶菌酶产品治疗组与对照组相比采食量显著降低(P<0.05);腹泻模型组与对照组相比,白细胞数、淋巴细胞数和中性粒细胞数均有极显著升高(P<0.01);十二指肠病理解剖观察发现,牦牛胃溶菌酶组肠道绒毛有所增长且厚度增加;重组牦牛胃溶菌酶组肠绒毛有所恢复。Alpha多样性分析发现,牦牛胃溶菌酶组的Simpson指数与对照组相比显著增加(P<0.05);腹泻模型组的变形菌门和弯曲杆菌门相对丰度显著增加(P<0.05);重组牦牛胃溶菌酶组和牦牛胃溶菌酶组的厚壁菌门和拟杆菌门相对丰度有所增加。本研究表明,牦牛胃溶菌酶对大肠杆菌引起的腹泻有较好的治疗效果。由于牦牛胃溶菌酶具备较强抗胃蛋白酶能力,其原酶及重组酶在饲料添加剂以及在食品加工和医疗卫生等领域具有一定的应用潜力。 展开更多

关键词 牦牛胃溶菌酶 PichiaPinkTM毕赤酵母表达系统 重组牦牛溶菌酶 肠道菌群 小鼠腹泻

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牛乳铁蛋白多肽的合成及抗菌活性试验 被引量：5

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作者 史芳芳 王亮 +1 位作者 吕自力 王安江 《西北农业学报》 CAS CSCD 北大核心 2009年第1期20-23,共4页

用化学合成法合成了以酵母偏爱密码子编码的抗菌肽LfcinB基因片段。合成片段与酵母表达载体pPICZαA重组,构建胞外分泌表达载体pPICZαA-LfcinB,通过限制性内切酶SacⅠ酶切线性化,电击法转化毕赤酵母X-33宿主菌,Zeocin抗性筛选,经PCR检... 用化学合成法合成了以酵母偏爱密码子编码的抗菌肽LfcinB基因片段。合成片段与酵母表达载体pPICZαA重组,构建胞外分泌表达载体pPICZαA-LfcinB,通过限制性内切酶SacⅠ酶切线性化,电击法转化毕赤酵母X-33宿主菌,Zeocin抗性筛选,经PCR检测LfcinB基因与毕赤酵母染色体稳定整合。阳性克隆经甲醇诱导表达LfcinB,诱导表达6 d,每24 h取上清1 mL,进行抑菌试验。结果表明,抗菌肽牛乳铁多肽基因已整合到酵母细胞基因组中并获得表达,经0.5%甲醇在30℃诱导48 h可产生较高抗菌活性的抗菌肽,表达产物具有较强杀菌作用。 展开更多

关键词 牛乳铁多肽(LfcinB) 毕赤酵母表达系统 抗菌活性

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