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逆转录环介导等温扩增联合横向流动试纸条快速检测草鱼(Ctenopharyngodon idellus)呼肠孤病毒(GCRV)的研究 被引量：1
1
作者 郝贵杰 林锋 +6 位作者 陈智慧 黄小红 潘晓艺 袁雪梅 徐洋 姚嘉赟 沈锦玉 《海洋与湖沼》 CAS CSCD 北大核心 2018年第1期183-191,共9页
草鱼呼肠孤病毒(grass carp reovirus,GCRV)是一种双链分节段RNA病毒,是引起草鱼出血病的(hemorrhage of grass carp)的病原,目前临床上较为流行的为基因I型和II型GCRV。本研究利用逆转录环介导等温扩增技术(reverse transcription loop... 草鱼呼肠孤病毒(grass carp reovirus,GCRV)是一种双链分节段RNA病毒,是引起草鱼出血病的(hemorrhage of grass carp)的病原,目前临床上较为流行的为基因I型和II型GCRV。本研究利用逆转录环介导等温扩增技术(reverse transcription loop-mediated isothermal amplification,RT-LAMP)进行核酸扩增,通过横向流动试纸条方法(lateral flow dipstick,LFD)进行可视化检测,分别建立了可应用于基因I型和II型GCRV快速检测的RT-LAMP-LFD技术。该技术以基因I型和II型GCRV第六基因为检测靶标,分别设计了2对特异性引物(其中,上游内引物由生物素biotin标记)和1条异硫氰酸荧光素(fluorescein isothiocyanate,FITC)标记的探针。结果表明,RT-LAMP最适反应温度为63oC,扩增时间为40min,从核酸扩增到LFD结果判读仅需50min。利用RT-LAMP-LFD可特异性检出基因I型和II型GCRV,而对鲤疱疹病毒II型(Cy HV-2)、鲤春病毒血症病毒(SVCV)、嗜水气单胞菌等鱼类常见病原的核酸检测结果为阴性,而且两种基因型RT-LAMP-LFD方法只能检测本基因型GCRV,特异性良好。该方法最低可检测到1.19pg的基因I型GCRV的RNA,1.88pg基因II型GCRV的RNA,其灵敏度分别比相应的RT-PCR方法高2个数量级和1个数量级。对实际样品的检测结果表明,两种基因型RT-LAMP-LFD方法检测GCRV与普通RT-PCR扩增并测序的结果一致。因此,该方法可快速、特异地检测出GCRV,而且操作简单,费用低且耗时短,不需特殊仪器设备,有望成为GCRV现场检测的常规技术手段。 展开更多
关键词 草鱼呼肠孤病毒 逆转录环介导等温扩增(RT-LAMP) 横向流动试纸条(lfd) 特异性 灵敏度
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香鱼格留虫(Glugea plecoglossi)环介导等温扩增联合横向流动试纸条检测方法的建立 被引量：3
2
作者 康晋伟 金晶磊 +4 位作者 段丽君 周燕 苗亮 周前进 陈炯 《海洋与湖沼》 CAS CSCD 北大核心 2020年第6期1501-1512,共12页
我国的养殖香鱼正面临着严重的香鱼格留虫(Glugea plecoglossi)感染。本研究联合运用环介导等温扩增技术(LAMP)和横向流动试纸条(LFD)的检测技术,建立了快速便捷地检测G.plecoglossi的LAMP-LFD方法。该方法以G.plecoglossi的β微管蛋白... 我国的养殖香鱼正面临着严重的香鱼格留虫(Glugea plecoglossi)感染。本研究联合运用环介导等温扩增技术(LAMP)和横向流动试纸条(LFD)的检测技术,建立了快速便捷地检测G.plecoglossi的LAMP-LFD方法。该方法以G.plecoglossi的β微管蛋白基因为检测靶标,在其保守区域设计并筛得6条特异性引物(其中上游内引物用生物素标记),进行LAMP反应,产物再与异硫氰酸荧光素(FITC)标记的特异性探针杂交,在LFD上进行结果判断。结果表明,LAMP-LFD方法能够特异性地检出G.plecoglossi,对梅氏新贝尼登虫、刺激隐核虫、肝肠胞虫阳性的虾组织、派氏异尖线虫、内弯宫脂线虫、鳗弧菌香鱼分离株、杀香鱼假单胞菌,以及香鱼组织等的检测均呈阴性。优化后,LAMP的反应条件为65℃反应45min,与探针杂交的条件为65℃反应5min,加之5min的显色时间,整个检测时程为55min。利用该方法能够检测到2.0fg/μL的含β微管蛋白的质粒DNA,针对G.plecoglossi基因组DNA的检测灵敏度为14.0pg/μL;能够从感染强度达到100个虫体/克的香鱼肝组织中稳定地检测到虫体。该方法可在简单的恒温加热设备(如水浴锅)中完成核酸扩增和探针杂交,无需昂贵的仪器装置。综上,香鱼格留虫LAMP-LFD方法操作便捷、灵敏度高、特异性好、检测快速,而且设备依赖性低,完全适合于基层检测的需求。 展开更多
关键词 香鱼格留虫(Glugea plecoglossi) β微管蛋白 环介导等温扩增技术(LAMP) 横向流动试纸条(lfd) 检测
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基于烟草属特异性基因Ntsp051的RPA-LFD检测方法的建立及应用
3
作者 张轲 龙杰 +7 位作者 董杏梅 徐世斌 范昱明 普麒 万岳莹 李昌威 林金水 童治军 《西南农业学报》 北大核心 2025年第9期1914-1923,共10页
【目的】探索高效、快速、简便的类烟产品现场鉴别检验方法,增强烟草专卖执法的科学性和时效性。【方法】以烟草属特异性基因Nstp051为检测靶标,设计特异性引物与探针,优化反应的时间和温度,建立基于重组酶聚合酶扩增技术结合横向流动... 【目的】探索高效、快速、简便的类烟产品现场鉴别检验方法,增强烟草专卖执法的科学性和时效性。【方法】以烟草属特异性基因Nstp051为检测靶标,设计特异性引物与探针,优化反应的时间和温度,建立基于重组酶聚合酶扩增技术结合横向流动试纸条(RPA-LFD)的类烟产品中植物源烟草成分的鉴别检验方法,并对该方法的灵敏度和特异性进行测试。【结果】建立的RPA-LFD检测方法对植物源烟草成分具有特异性,在42℃下反应20 min效果最好,对Ntsp051重组质粒的最低检测限为1.0×10^(2)copies/μL,对K326基因组DNA的最低检测限为50 pg/μL。该方法对不同的植物源烟草成分的灵敏度不同,当烟草与非烟混合基因组DNA浓度为10 ng/μL时,能从混合基因组DNA中检测出最低添加比例为0.5%的烟草基因组DNA。在模拟类烟产品添加试验中,最低可以检测到烟草与非烟草混合材料中添加比例仅为0.05%的植物源烟草成分。【结论】RPA-LFD检测方法简单快速,特异性好,灵敏度高,结果可肉眼判读,可用于类烟产品中植物源烟草成分的快速检测。 展开更多
关键词 类烟产品 Nstp051 重组酶聚合酶扩增技术(RPA) 快速检测 横向流动试纸条(lfd)
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