目的·利用负染电镜技术分析人源核小体重塑及组蛋白去乙酰化酶复合物(nucleosome remodeling and deacetylase complex,NuRD复合物)结构,获得人源NuRD复合物的轮廓信息。方法·将C端带有3×Flag标签的MBD3(methyl-CpG bind...目的·利用负染电镜技术分析人源核小体重塑及组蛋白去乙酰化酶复合物(nucleosome remodeling and deacetylase complex,NuRD复合物)结构,获得人源NuRD复合物的轮廓信息。方法·将C端带有3×Flag标签的MBD3(methyl-CpG binding domain protein 3)和N端带有10×His标签的GATAD2A(GATA zinc finger domain containing 2A)克隆至pMLink表达载体中,采用聚乙烯亚胺瞬时转染过表达的方式在人源Expi293F悬浮细胞里表达NuRD复合物中的蛋白质组分;依次通过Ni-NTA亲和层析、Flag(DYKDDDDK)标签亲和层析和Superose 6 Increase 5/150凝胶过滤层析分离纯化NuRD复合物;利用蛋白质印迹法(Western blotting)和液相色谱-串联质谱法(liquid chromatography-tandem mass spectrometry,LC-MS/MS)对复合物进行组分鉴定;利用负染电镜技术结合单颗粒重构技术研究NuRD复合物的空间结构;通过UCSF Chimera软件将蛋白质数据库(Protein Data Bank,PDB)中已有亚复合物的原子结构模型(7AO9,5FXY)与生成的结构模型进行自动匹配及比对,预测多个蛋白组分在负染结构模型中的定位。结果·利用两步亲和层析,成功富集了带有纯化标签的MBD3、GATAD2A蛋白及其他内源蛋白组分,通过进一步的凝胶过滤层析分离得到了均一性良好的复合物;通过Western blotting和LC-MS/MS鉴定,确认纯化得到的复合物为组分完整的人源NuRD复合物。利用负染电镜技术及单颗粒重构技术初步解析了NuRD复合物的空间结构,其整体轮廓特征明显,呈现为不对称的长条形;通过进一步的三维优化处理,最终获得了人源NuRD复合物分辨率约为17A(1A=0.1 nm)的初步三维结构模型;已有的亚复合物原子结构模型(PDB:7AO9,5FXY)与NuRD复合物的初步三维结构模型自动匹配后,初步确定了MTA1/2/3(metastasis-associated protein 1/2/3)、HDAC1/2(histone deacetylase 1/2)、RBBP4/7(retinoblastoma-binding protein 4/7)及MBD2/3(methyl-CpG-binding domain protein 2/3)蛋白亚基在NuRD复合物负染结构模型中的定位。结论·利用单颗粒重构技术搭建了人源NuRD复合物的低分辨率负染结构模型。展开更多
文摘目的·利用负染电镜技术分析人源核小体重塑及组蛋白去乙酰化酶复合物(nucleosome remodeling and deacetylase complex,NuRD复合物)结构,获得人源NuRD复合物的轮廓信息。方法·将C端带有3×Flag标签的MBD3(methyl-CpG binding domain protein 3)和N端带有10×His标签的GATAD2A(GATA zinc finger domain containing 2A)克隆至pMLink表达载体中,采用聚乙烯亚胺瞬时转染过表达的方式在人源Expi293F悬浮细胞里表达NuRD复合物中的蛋白质组分;依次通过Ni-NTA亲和层析、Flag(DYKDDDDK)标签亲和层析和Superose 6 Increase 5/150凝胶过滤层析分离纯化NuRD复合物;利用蛋白质印迹法(Western blotting)和液相色谱-串联质谱法(liquid chromatography-tandem mass spectrometry,LC-MS/MS)对复合物进行组分鉴定;利用负染电镜技术结合单颗粒重构技术研究NuRD复合物的空间结构;通过UCSF Chimera软件将蛋白质数据库(Protein Data Bank,PDB)中已有亚复合物的原子结构模型(7AO9,5FXY)与生成的结构模型进行自动匹配及比对,预测多个蛋白组分在负染结构模型中的定位。结果·利用两步亲和层析,成功富集了带有纯化标签的MBD3、GATAD2A蛋白及其他内源蛋白组分,通过进一步的凝胶过滤层析分离得到了均一性良好的复合物;通过Western blotting和LC-MS/MS鉴定,确认纯化得到的复合物为组分完整的人源NuRD复合物。利用负染电镜技术及单颗粒重构技术初步解析了NuRD复合物的空间结构,其整体轮廓特征明显,呈现为不对称的长条形;通过进一步的三维优化处理,最终获得了人源NuRD复合物分辨率约为17A(1A=0.1 nm)的初步三维结构模型;已有的亚复合物原子结构模型(PDB:7AO9,5FXY)与NuRD复合物的初步三维结构模型自动匹配后,初步确定了MTA1/2/3(metastasis-associated protein 1/2/3)、HDAC1/2(histone deacetylase 1/2)、RBBP4/7(retinoblastoma-binding protein 4/7)及MBD2/3(methyl-CpG-binding domain protein 2/3)蛋白亚基在NuRD复合物负染结构模型中的定位。结论·利用单颗粒重构技术搭建了人源NuRD复合物的低分辨率负染结构模型。
