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小鼠树突状细胞相关C型凝集素-1基因重组腺病毒载体的构建及鉴定 被引量:3
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作者 夏迪 钱倩 +5 位作者 刘志成 谭鸣鸣 丁媛 苏欣 孙文逵 施毅 《医学研究生学报》 CAS 北大核心 2015年第4期341-345,共5页
目的树突状细胞相关C型凝集素-1(dendritic cell-associated C-type lectin-1,Dectin-1)是介导抗真菌天然免疫的重要受体之一。文中旨在构建表达小鼠Dectin-1基因的重组腺病毒载体,扩增、纯化获得高浓度的重组腺病毒。方法将PCR扩增的... 目的树突状细胞相关C型凝集素-1(dendritic cell-associated C-type lectin-1,Dectin-1)是介导抗真菌天然免疫的重要受体之一。文中旨在构建表达小鼠Dectin-1基因的重组腺病毒载体,扩增、纯化获得高浓度的重组腺病毒。方法将PCR扩增的目的片段CLEC7A-p IRES2-EGFP重组到中间载体p DONR221上,再与腺病毒骨架质粒p AD/CMV/V5-DEST重组,获得重组腺病毒质粒p AD-CLEC7A-p IRES2-EGFP,经Pac I线性化后转染人胚肾293(HEK293)细胞,收获重组腺病毒p AD-CLEC7A-p IRES2-EGFP;利用HEK293细胞大量扩增腺病毒;并进行重组腺病毒的滴度测定;用荧光显微镜和实时荧光定量PCR鉴定转染重组腺病毒组(Dectin-1基因重组腺病毒转染HEK293细胞)和转染空病毒组(空病毒转染HEK293细胞)中Dectin-1基因的表达。结果菌落PCR鉴定、酶切鉴定及测序结果均显示重组腺病毒含有Dectin-1基因,腺病毒滴度为5×1011IU/m L,荧光显微镜下可见绿色荧光,PCR检测到转染重组腺病毒组Dectin-1表达量是转染空病毒组的8677.25倍。结论成功构建并获得了较高浓度的Dectin-1基因重组腺病毒载体,为下一步体内外研究Dectin-1高表达在宿主抗真菌天然免疫中的作用奠定基础。 展开更多
关键词 树突状细胞相关C型凝集-1 CLEC7A基因 腺病毒载体 模式识别受体
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血管紧张素Ⅱ对人单核细胞源树突状细胞免疫功能的影响
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作者 黄东 陆浩 +3 位作者 姚康 孙爱军 邹云增 葛均波 《中国病理生理杂志》 CAS CSCD 北大核心 2014年第4期681-685,共5页
目的:探讨血管紧张素II(Ang II)对人单核细胞源树突状细胞(DCs)免疫成熟进程及摄取氧化低密度脂蛋白(Ox-LDL)功能的影响。方法:采用密度梯度离心结合免疫磁珠法分离人外周血CD14+单核细胞,经含100μg/L重组人粒细胞-巨噬细胞集落刺激因... 目的:探讨血管紧张素II(Ang II)对人单核细胞源树突状细胞(DCs)免疫成熟进程及摄取氧化低密度脂蛋白(Ox-LDL)功能的影响。方法:采用密度梯度离心结合免疫磁珠法分离人外周血CD14+单核细胞,经含100μg/L重组人粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(rhGM-CSF)和50μg/L重组人IL-4(rhIL-4)的RPMI-1640培养液培养,诱导分化为未成熟DCs。经不同浓度的Ang II干预24 h,另用10μmol/L血管紧张素II受体1拮抗剂洛沙坦预处理后再加入Ang II干预,采用流式细胞术检测细胞免疫表型(CD83和HLA-DR),酶联免疫吸附试验(ELISA)法检测细胞培养上清液中细胞因子(IL-12和IFN-γ)的浓度;通过加入10 mg/L的荧光DiI标记的Ox-LDL,用流式细胞仪检测DiI-Ox-LDL的摄取分数;采用real-time PCR法检测清道夫受体A(SR-A)、CD36和凝集素样氧化低密度脂蛋白受体1(LOX-1)mRNA的表达。结果:(1)Ang II干预可上调DCs表面成熟标志物CD83和HLA-DR的表达,且分泌细胞因子IL-12和IFN-γ水平升高,10μmol/L洛沙坦预处理可明显抑制Ang II诱导的DCs成熟。(2)Ang II干预可促进DCs对DiI-Ox-LDL的摄取,洛沙坦预处理可部分抑制DCs对DiI-Ox-LDL的摄取。(3)Ang II干预可上调LOX-1 mRNA的表达,但对SR-A和CD36的表达无明显影响,洛沙坦预处理可明显抑制LOX-1mRNA的表达,但SR-A和CD36的表达无明显变化。结论:Ang II可促进DCs的免疫成熟,并且可能通过上调LOX-1的表达,促进DCs对Ox-LDL的摄取,这可能是Ang II促动脉粥样硬化的新机制。 展开更多
关键词 树突状细胞 氧化低密度脂蛋白 血管紧张II 洛沙坦 凝集样氧化低密度脂蛋白受体1
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C型凝集素9家族A成员的研究进展
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作者 姚文荣 杨贵波 《细胞与分子免疫学杂志》 CAS CSCD 北大核心 2016年第6期849-853,共5页
C型凝集素9家族A成员(CLEC9A),又称为树突状细胞-NK细胞凝集素群受体1(DNGR-1),属于非经典的2型跨膜C型凝集素样受体,其表达具有高度的树突状细胞(DC)限制性。小鼠CLEC9A主要表达在CD8α^+DC和CD103^+DC表面,人CLEC9A主要表达在血液树... C型凝集素9家族A成员(CLEC9A),又称为树突状细胞-NK细胞凝集素群受体1(DNGR-1),属于非经典的2型跨膜C型凝集素样受体,其表达具有高度的树突状细胞(DC)限制性。小鼠CLEC9A主要表达在CD8α^+DC和CD103^+DC表面,人CLEC9A主要表达在血液树突状细胞抗原3阳性DC(BDCA3^+DC)表面。在表型和功能方面,人的同时表达CLEC9A和BDCA3(CLEC9A^+BDCA3^+)的DC与小鼠的CD8α^+DC具有相似性。CLEC9A能够与坏死或受损细胞的纤维状肌动蛋白结合,经细胞质区的免疫受体酪氨酸活化基序结构启动细胞内信号的转导。CLEC9A能介导内吞作用,参与交叉提呈抗原等作用,在抗病毒感染、肿瘤预防与治疗和疫苗的研究中具有潜在的应用前景。本文阐述了CLEC9A分子的研究进展。 展开更多
关键词 树突状细胞-nk细胞凝集素家族受体1 C型凝集9家族A成员 血液树突状细胞抗原3 树突状细胞 内吞作用 交叉提呈 纤维状肌动蛋白 综述
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中国恒河猴DNGR-1分子C型凝集素样结构域在大肠杆菌系统表达 被引量:2
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作者 姚文荣 杨贵波 《细胞与分子免疫学杂志》 CAS CSCD 北大核心 2014年第5期489-492,共4页
目的获得恒河猴C型凝集素结构域家族9的A成员(Clec9A)基因编码区序列;体外表达CLEC9A的C型凝集素样结构域(CTLD)。方法利用Clec9A基因特异引物,反转录PCR扩增中国恒河猴Clec9A基因编码区,亚克隆至pGEM-T载体,获得pGEM-T-DNGR质粒并进行... 目的获得恒河猴C型凝集素结构域家族9的A成员(Clec9A)基因编码区序列;体外表达CLEC9A的C型凝集素样结构域(CTLD)。方法利用Clec9A基因特异引物,反转录PCR扩增中国恒河猴Clec9A基因编码区,亚克隆至pGEM-T载体,获得pGEM-T-DNGR质粒并进行测序。构建CLEC9A分子的CTLD区原核表达质粒pET-32a-CTLD,转化BL21(DE3),IPTG诱导重组蛋白表达,并用SDS-PAGE和Western blot法对目的蛋白进行鉴定。结果 PCR扩增得到726 bp的Clec9A编码区全长,测序和序列比对发现恒河猴CLEC9A编码区的核苷酸序列与人和小鼠的同源性分别为95.0%和73.1%,推测的氨基酸同源性分别为91.7%和57.3%。体外表达获得相对分子质量(Mr)约32 000的CTLD融合蛋白,Western blot方法鉴定发现其与人DNGR-1分子具有相似的抗原性。结论中国恒河猴Clec9A基因与人的高度相似并能编码与人CTLD抗原性相似的蛋白。 展开更多
关键词 中国恒河猴 C型凝集9家族A成员 树突状细胞自然杀伤细胞凝集受体1 树突状细胞 C型凝集样结构域
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