本试验旨在制备用于小尾寒羊瘦素长型受体(leptin receptor long form)基因实时荧光定量PCR的标准品质粒和标准曲线。提取初情期前小尾寒羊下丘脑弓状核组织总RNA,进行反转录合成第1链cDNA,然后进行PCR和目的基因片段的回收;通过T-A克...本试验旨在制备用于小尾寒羊瘦素长型受体(leptin receptor long form)基因实时荧光定量PCR的标准品质粒和标准曲线。提取初情期前小尾寒羊下丘脑弓状核组织总RNA,进行反转录合成第1链cDNA,然后进行PCR和目的基因片段的回收;通过T-A克隆将该基因片段插入pMD18-T载体中,构建回收产物的重组质粒;大量提取质粒,定量后进行标准曲线的制作和实时荧光定量PCR。重组质粒经PCR扩增和测序,结果表明,瘦素长型受体基因已成功克隆。提示,所构建的瘦素长型受体基因实时荧光定量标准曲线线性关系好,灵敏度和特异性高,准确可靠,此方法可作为实时荧光定量PCR检测瘦素长型受体基因的标准方法。展开更多
为定量测定瘤胃脂肪分解菌,试验构建了脂肪分解菌实时荧光定量PCR的标准品及标准曲线。提取瘤胃微生物总DNA,以脂肪分解菌16S r DNA特异性引物进行PCR扩增,回收PCR产物,与PMD19-T Vector连接并转化大肠杆菌。阳性重组质粒经PCR和测序鉴...为定量测定瘤胃脂肪分解菌,试验构建了脂肪分解菌实时荧光定量PCR的标准品及标准曲线。提取瘤胃微生物总DNA,以脂肪分解菌16S r DNA特异性引物进行PCR扩增,回收PCR产物,与PMD19-T Vector连接并转化大肠杆菌。阳性重组质粒经PCR和测序鉴定后,将提取的质粒DNA进行梯度稀释并作为模板,利用荧光定量PCR反应做出标准曲线。结果显示:PCR产物与目的基因的相似性大于99%,以不同稀释度的重组质粒为模板获得的荧光定量PCR扩增曲线差异明显,构建了相关系数接近1的标准曲线,且熔解曲线峰值单一。试验建立的实时荧光定量PCR方法可用于瘤胃脂肪分解菌的定量检测,为进一步研究该菌在反刍动物瘤胃发酵中的分子机理奠定了基础。展开更多
文摘本试验旨在制备用于小尾寒羊瘦素长型受体(leptin receptor long form)基因实时荧光定量PCR的标准品质粒和标准曲线。提取初情期前小尾寒羊下丘脑弓状核组织总RNA,进行反转录合成第1链cDNA,然后进行PCR和目的基因片段的回收;通过T-A克隆将该基因片段插入pMD18-T载体中,构建回收产物的重组质粒;大量提取质粒,定量后进行标准曲线的制作和实时荧光定量PCR。重组质粒经PCR扩增和测序,结果表明,瘦素长型受体基因已成功克隆。提示,所构建的瘦素长型受体基因实时荧光定量标准曲线线性关系好,灵敏度和特异性高,准确可靠,此方法可作为实时荧光定量PCR检测瘦素长型受体基因的标准方法。
文摘为定量测定瘤胃脂肪分解菌,试验构建了脂肪分解菌实时荧光定量PCR的标准品及标准曲线。提取瘤胃微生物总DNA,以脂肪分解菌16S r DNA特异性引物进行PCR扩增,回收PCR产物,与PMD19-T Vector连接并转化大肠杆菌。阳性重组质粒经PCR和测序鉴定后,将提取的质粒DNA进行梯度稀释并作为模板,利用荧光定量PCR反应做出标准曲线。结果显示:PCR产物与目的基因的相似性大于99%,以不同稀释度的重组质粒为模板获得的荧光定量PCR扩增曲线差异明显,构建了相关系数接近1的标准曲线,且熔解曲线峰值单一。试验建立的实时荧光定量PCR方法可用于瘤胃脂肪分解菌的定量检测,为进一步研究该菌在反刍动物瘤胃发酵中的分子机理奠定了基础。
