目的构建SF3B1突变等位基因敲除的人葡萄膜黑色素瘤细胞模型,筛选靶向抑制SF3B1突变型葡萄膜黑色素瘤的药物。方法通过主成分分析法对来自TCGA数据库的葡萄膜黑色素瘤患者分成SF3B1野生型和突变型两组进行转录组可变剪接分析,研究SF3B1...目的构建SF3B1突变等位基因敲除的人葡萄膜黑色素瘤细胞模型,筛选靶向抑制SF3B1突变型葡萄膜黑色素瘤的药物。方法通过主成分分析法对来自TCGA数据库的葡萄膜黑色素瘤患者分成SF3B1野生型和突变型两组进行转录组可变剪接分析,研究SF3B1突变对可变剪接的影响。通过CRISPR-Cas9技术敲除Mel202细胞株的SF3B1突变等位基因,Sanger测序明确基因编辑的序列。MTT法和克隆形成实验检测Mel202细胞株和基因敲除mut-KO细胞株的增殖,RT-PCR琼脂糖电泳结合Sanger测序检测Mel202细胞株和基因敲除mut-KO细胞株的可变剪接事件。MTT法从上市药物库和生物活性化合物库筛选对SF3B1突变细胞具有选择性抑制活性的药物。结果选择性敲除Mel202细胞SF3B1突变等位基因促进了细胞的增殖(5.47±0.32 vs 10.17±0.27),改变了ZDHHC16和DYNLL1转录本的可变剪接。化合物库筛选结果显示13个化合物对SF3B1突变的Mel202细胞具有选择性的抑制活性(Fold change≥2),其中上市药物tetrandrine和lapatinib显示了较好的量效曲线。结论本研究为SF3B1突变的葡萄膜黑色素瘤患者提供了细胞筛选模型和潜在的个体化治疗药物。展开更多
文摘目的构建SF3B1突变等位基因敲除的人葡萄膜黑色素瘤细胞模型,筛选靶向抑制SF3B1突变型葡萄膜黑色素瘤的药物。方法通过主成分分析法对来自TCGA数据库的葡萄膜黑色素瘤患者分成SF3B1野生型和突变型两组进行转录组可变剪接分析,研究SF3B1突变对可变剪接的影响。通过CRISPR-Cas9技术敲除Mel202细胞株的SF3B1突变等位基因,Sanger测序明确基因编辑的序列。MTT法和克隆形成实验检测Mel202细胞株和基因敲除mut-KO细胞株的增殖,RT-PCR琼脂糖电泳结合Sanger测序检测Mel202细胞株和基因敲除mut-KO细胞株的可变剪接事件。MTT法从上市药物库和生物活性化合物库筛选对SF3B1突变细胞具有选择性抑制活性的药物。结果选择性敲除Mel202细胞SF3B1突变等位基因促进了细胞的增殖(5.47±0.32 vs 10.17±0.27),改变了ZDHHC16和DYNLL1转录本的可变剪接。化合物库筛选结果显示13个化合物对SF3B1突变的Mel202细胞具有选择性的抑制活性(Fold change≥2),其中上市药物tetrandrine和lapatinib显示了较好的量效曲线。结论本研究为SF3B1突变的葡萄膜黑色素瘤患者提供了细胞筛选模型和潜在的个体化治疗药物。
文摘目的本研究采用对大鼠急性及慢性水杨酸盐腹腔注射建立耳鸣动物模型,通过检测大鼠耳蜗核中肿瘤坏死因子α(TNF-α),白介素-1β(IL-1β),白介素6(IL-6)以及NMDA受体亚基(NR2B)m RNA及其蛋白的表达,了解慢性水杨酸盐诱导的耳鸣动物耳蜗核中是否出现炎症因子表达的改变,以探讨炎症因子在耳鸣中的作用。方法实验动物随机分为4组,按给药时间分别为:正常对照组、急性注射2小时组、慢性注射14天组、停药后恢复14天组。各组大鼠断头处死后迅速分离出耳蜗核;采用SYBR Green实时荧光定量PCR(real-time reverse transcriptase polymerase chain reaction,real-time RT-PCR)及Western blot(蛋白质印迹)方法,检测各组大鼠耳蜗核TNF-α,IL-1β,IL-6及NR2B基因m RNA及其蛋白的表达,观察各组间的差异。结果(1)在慢性注射14天组,TNF-α和NR2B m RNA及其蛋白表达水平较正常对照组、急性注射2小时组、停药后恢复14天组高,且差异有统计学意义(p<0.05);急性注射2小时组、慢性注射14天组、停药后恢复14天组IL-1βm RNA水平较正常组高,慢性注射14天组、停药后恢复14天组IL-1β蛋白水平较正常组高,差异有统计学意义(p<0.05);IL-6 m RNA及其蛋白表达水平在四组之间无明显差异;(2)TNF-α和NR2B m RNA表达具有明显的正相关(p<0.01);IL-1β和NR2B m RNA表达无明显正相关(p>0.05)。结论(1)长期注射水杨酸盐可能通过上调耳蜗核中TNF-α,IL-1β和NR2B基因表达导致大鼠耳鸣;(2)TNF-α和NR2B可能在水杨酸盐诱发耳鸣的过程中起协同作用。
文摘目的探讨水杨酸钠诱导耳鸣大鼠海马中肿瘤坏死因子α(TNF-α)、白介素1β(IL-1β)和N-甲基-D-天冬氨酸受体2B亚基(N-methyl-D-aspartate receptor 2B,NMDAR2B)的表达变化与大鼠耳鸣之间的联系。方法将18只健康成年SD大鼠随机分为三组:对照组(腹腔注射生理盐水)、腹腔注射水杨酸钠14天组(S14组)和腹腔注射水杨酸钠14天后停药恢复7天组(R7组),每组6只。检测各组大鼠造模前和造模结束后的惊跳反射前脉冲抑制(prepulse inhibition,PPI)和听性脑干反应(auditory brainstem response,ABR);检测后处死大鼠并迅速分离出海马组织,采用荧光定量PCR(quantitative PCR,qPCR)和Western Blot检测各组大鼠海马中TNF-α、IL-1β和NMDAR2B的表达。结果①S14组大鼠前脉冲抑制率较对照组显著增加(P<0.001),提示耳鸣模型建立成功;②S14组大鼠的ABR反应阈为51±1.87 dB SPL,较对照组(36.67±1.05 dB SPL)显著升高(P<0.01);R7组大鼠的ABR反应阈为35±1.29 dB SPL,与对照组差异无统计学意义(P>0.05);③S14组大鼠海马TNF-α、IL-1β和NMDAR2B的表达水平较对照组显著升高(P<0.01);与对照组相比,R7组大鼠海马IL-1β的表达水平显著升高(P<0.05),TNF-α和NMDAR2B的表达水平与对照组相比差异无统计学意义(P>0.05)。结论腹腔注射水杨酸钠可诱导大鼠产生耳鸣,并可能通过上调大鼠海马区TNF-α、IL-1β和NMDAR2B的表达水平参与耳鸣的发生发展。
