染色质域解旋酶DNA结合蛋白5(chromodomain helicase DNA binding protein 5,CHD5)是人类肿瘤中一个重要的抑癌基因,是肿瘤抑制网络的控制开关,但是它在前列腺癌发生发展中的作用却少有研究。本研究利用CRISPR/Cas9技术敲除前列腺癌细胞...染色质域解旋酶DNA结合蛋白5(chromodomain helicase DNA binding protein 5,CHD5)是人类肿瘤中一个重要的抑癌基因,是肿瘤抑制网络的控制开关,但是它在前列腺癌发生发展中的作用却少有研究。本研究利用CRISPR/Cas9技术敲除前列腺癌细胞PC-3中CHD5基因,探索敲除CHD5基因对PC-3细胞增殖能力的影响。研究根据CRISPR/Cas9靶点设计规则设计了3组特异性sgRNA,连接到pLenti-U6-sgRNA-SFFV-Cas9-2A-Puro质粒构建表达载体。测序鉴定后将重组表达载体转染293T细胞包装慢病毒。包装慢病毒滴度分别为CHD5-sgRNA-17.84×10^9 TU/mL,CHD5-sgRNA-25.83×10^9 TU/mL,CHD5-sgRNA-35.23×10^9 TU/mL。用CHD5-sgRNA慢病毒感染PC-3细胞,嘌呤霉素筛选阳性细胞,Western印迹检测CHD5蛋白的表达水平,CCK-8、克隆形成实验以及细胞周期检测对PC-3细胞增值能力的影响。Western印迹结果显示,CHD5-sgRNA-1组CHD5蛋白质水平无明显变化,CHD5-sgRNA-2组和CHD5-sgRNA-3组CHD5蛋白质表达水平显著低于空白组和阴性对照组,成功获得稳定敲除CHD5基因的PC-3细胞系,其中感染CHD5-sgRNA-2的PC-3细胞中CHD5蛋白水平最低,用于后续研究。CCK-8结果显示,敲除CHD5促进PC-3细胞的增殖能力。空白组、阴性对照组以及CHD5-gRNA-2组的克隆数分别为(32.50±1.50)、(35.33±2.02)和(50.83±4.25)。细胞周期分析结果显示,G2/M期细胞分别为(7.56±0.59)%、(8.33±0.61)%和(27.21±1.04)%,差异均有统计学意义(P<0.01)。Western印迹证实,CHD5敲除后,G2/M期周期相关蛋白质细胞周期蛋白B1、cdc25C和cdc2的表达量增加,phospho-cdc25C、phospho-cdc2以及p21的表达水平下降(P<0.05)。以上结果表明,CHD5敲除的PC-3细胞系构建成功,CHD5表达缺失通过上调细胞周期蛋白B1、去磷酸化cdc25C、cdc2以及下调p21表达促进前列腺癌PC-3细胞增殖。展开更多
文摘染色质域解旋酶DNA结合蛋白5(chromodomain helicase DNA binding protein 5,CHD5)是人类肿瘤中一个重要的抑癌基因,是肿瘤抑制网络的控制开关,但是它在前列腺癌发生发展中的作用却少有研究。本研究利用CRISPR/Cas9技术敲除前列腺癌细胞PC-3中CHD5基因,探索敲除CHD5基因对PC-3细胞增殖能力的影响。研究根据CRISPR/Cas9靶点设计规则设计了3组特异性sgRNA,连接到pLenti-U6-sgRNA-SFFV-Cas9-2A-Puro质粒构建表达载体。测序鉴定后将重组表达载体转染293T细胞包装慢病毒。包装慢病毒滴度分别为CHD5-sgRNA-17.84×10^9 TU/mL,CHD5-sgRNA-25.83×10^9 TU/mL,CHD5-sgRNA-35.23×10^9 TU/mL。用CHD5-sgRNA慢病毒感染PC-3细胞,嘌呤霉素筛选阳性细胞,Western印迹检测CHD5蛋白的表达水平,CCK-8、克隆形成实验以及细胞周期检测对PC-3细胞增值能力的影响。Western印迹结果显示,CHD5-sgRNA-1组CHD5蛋白质水平无明显变化,CHD5-sgRNA-2组和CHD5-sgRNA-3组CHD5蛋白质表达水平显著低于空白组和阴性对照组,成功获得稳定敲除CHD5基因的PC-3细胞系,其中感染CHD5-sgRNA-2的PC-3细胞中CHD5蛋白水平最低,用于后续研究。CCK-8结果显示,敲除CHD5促进PC-3细胞的增殖能力。空白组、阴性对照组以及CHD5-gRNA-2组的克隆数分别为(32.50±1.50)、(35.33±2.02)和(50.83±4.25)。细胞周期分析结果显示,G2/M期细胞分别为(7.56±0.59)%、(8.33±0.61)%和(27.21±1.04)%,差异均有统计学意义(P<0.01)。Western印迹证实,CHD5敲除后,G2/M期周期相关蛋白质细胞周期蛋白B1、cdc25C和cdc2的表达量增加,phospho-cdc25C、phospho-cdc2以及p21的表达水平下降(P<0.05)。以上结果表明,CHD5敲除的PC-3细胞系构建成功,CHD5表达缺失通过上调细胞周期蛋白B1、去磷酸化cdc25C、cdc2以及下调p21表达促进前列腺癌PC-3细胞增殖。
