植物转录因子是植物体内调节基因表达的重要蛋白,参与多种生物学功能的调控。研究植物转录因子调控靶基因的常用方法为染色质免疫共沉淀法(chromatin immunoprecipitation,ChIP),但抗体特异性、遗传材料构建的耗时性等因素却大大限制了C...植物转录因子是植物体内调节基因表达的重要蛋白,参与多种生物学功能的调控。研究植物转录因子调控靶基因的常用方法为染色质免疫共沉淀法(chromatin immunoprecipitation,ChIP),但抗体特异性、遗传材料构建的耗时性等因素却大大限制了ChIP技术的应用范围和效果。本文通过对水稻原生质体瞬时转化、甲醛固定、免疫沉淀核酸的超声波破碎等条件的优化,建立了基于水稻原生质体的染色质免疫共沉淀技术体系(chromatin immunoprecipitation system based on rice protoplasts,ChIP-RP);并通过本技术体系验证了水稻转录因子OsNF-YA4蛋白对靶基因序列的富集作用。本技术体系将减少制备特异性抗体或构建稳定遗传材料的局限,有利于水稻转录因子直接调控靶基因的快速筛选和验证,推动水稻转录因子调控功能的分子机制解析。展开更多
染色质免疫共沉淀测序(chromatin immunoprecipitation followed by sequencing,ChIP-seq)是研究目的蛋白与DNA相互作用的重要方法,被广泛应用于转录因子、组蛋白修饰等分布与功能的研究。研究人员通过对细胞分离、染色质片段化以及测...染色质免疫共沉淀测序(chromatin immunoprecipitation followed by sequencing,ChIP-seq)是研究目的蛋白与DNA相互作用的重要方法,被广泛应用于转录因子、组蛋白修饰等分布与功能的研究。研究人员通过对细胞分离、染色质片段化以及测序文库构建等关键步骤不断优化,使ChIP-seq适合少量细胞的分析。近年来发展迅速的CUT&RUN(cleavage under targets and release using nuclease)、CUT&Tag(cleavage under targets and tagmentation)技术,利用特异性抗体使酶“靶向”结合目标蛋白,通过MNase酶切或Tn5转座酶切割染色质,简化了实验操作流程。本文介绍了ChIP-seq的原理及其数据分析方法,比较ChIP-seq优化方法和衍生技术。总结了在植物生长发育过程中,转录因子和组蛋白修饰在生物钟调控、激素信号转导、光信号途径、胁迫响应等方面研究与染色质免疫共沉淀测序技术的应用。展开更多
我们先前曾报道了舌癌耐药相关蛋白1(tongue cancer-resistant protein 1,TCRP1)的cDNA克隆,及其在平阳霉素诱导的舌癌耐药细胞系Tca8113/PYM中高表达,而该细胞同时也对顺铂耐受,提示TCRP1可能参与舌癌细胞对顺铂的耐受,但是具体机制目...我们先前曾报道了舌癌耐药相关蛋白1(tongue cancer-resistant protein 1,TCRP1)的cDNA克隆,及其在平阳霉素诱导的舌癌耐药细胞系Tca8113/PYM中高表达,而该细胞同时也对顺铂耐受,提示TCRP1可能参与舌癌细胞对顺铂的耐受,但是具体机制目前尚不清楚.本研究证明,TCRP1依赖c-myc的激活机制与舌癌细胞对顺铂耐受相关.生物信息学预测显示,TCRP1启动子存在原癌基因c-myc的结合位点;染色质免疫共沉淀(ChIP)技术证实,c-myc能通过其转录因子结合位点(transcription factor binding site,TFBS)与TCRP1启动子结合;利用半定量RT-PCR、蛋白质免疫印迹和MTS实验检测发现,将c-myc质粒导入舌癌细胞Tca8113中过表达,能显著上调TCRP1的mRNA和蛋白表达水平,且细胞对顺铂的耐受性增强;使用c-myc抑制剂或者siRNA沉默Tca8113/PYM细胞中c-myc,TCRP1的mRNA和蛋白表达水平均下降,且细胞对顺铂的敏感性增强.上述结果提示,转录因子c-myc可与TCRP1基因启动子特异性结合,上调TCRP1的表达,且该基因的表达上调与舌癌细胞对顺铂的耐受相关.展开更多
文摘植物转录因子是植物体内调节基因表达的重要蛋白,参与多种生物学功能的调控。研究植物转录因子调控靶基因的常用方法为染色质免疫共沉淀法(chromatin immunoprecipitation,ChIP),但抗体特异性、遗传材料构建的耗时性等因素却大大限制了ChIP技术的应用范围和效果。本文通过对水稻原生质体瞬时转化、甲醛固定、免疫沉淀核酸的超声波破碎等条件的优化,建立了基于水稻原生质体的染色质免疫共沉淀技术体系(chromatin immunoprecipitation system based on rice protoplasts,ChIP-RP);并通过本技术体系验证了水稻转录因子OsNF-YA4蛋白对靶基因序列的富集作用。本技术体系将减少制备特异性抗体或构建稳定遗传材料的局限,有利于水稻转录因子直接调控靶基因的快速筛选和验证,推动水稻转录因子调控功能的分子机制解析。
文摘染色质免疫共沉淀测序(chromatin immunoprecipitation followed by sequencing,ChIP-seq)是研究目的蛋白与DNA相互作用的重要方法,被广泛应用于转录因子、组蛋白修饰等分布与功能的研究。研究人员通过对细胞分离、染色质片段化以及测序文库构建等关键步骤不断优化,使ChIP-seq适合少量细胞的分析。近年来发展迅速的CUT&RUN(cleavage under targets and release using nuclease)、CUT&Tag(cleavage under targets and tagmentation)技术,利用特异性抗体使酶“靶向”结合目标蛋白,通过MNase酶切或Tn5转座酶切割染色质,简化了实验操作流程。本文介绍了ChIP-seq的原理及其数据分析方法,比较ChIP-seq优化方法和衍生技术。总结了在植物生长发育过程中,转录因子和组蛋白修饰在生物钟调控、激素信号转导、光信号途径、胁迫响应等方面研究与染色质免疫共沉淀测序技术的应用。
