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牛、果蝇DHX36解旋酶的表达纯化及活性比较
1
作者 李康 郭海磊 奚绪光 《西北农林科技大学学报（自然科学版）》 CSCD 北大核心 2020年第5期49-56,共8页
【目的】探索牛和果蝇DHX36解旋酶的表达纯化条件及底物结合活性,为深入研究DEAH-box解旋酶提供理论参考。【方法】以较高等动物牛(Bos taurus)和较低等动物黑腹果蝇(Drosophila melanogaster)RNA解旋酶BtDHX36和DmDHX36为研究对象,首先... 【目的】探索牛和果蝇DHX36解旋酶的表达纯化条件及底物结合活性,为深入研究DEAH-box解旋酶提供理论参考。【方法】以较高等动物牛(Bos taurus)和较低等动物黑腹果蝇(Drosophila melanogaster)RNA解旋酶BtDHX36和DmDHX36为研究对象,首先,构建重组表达载体pET15b-sumo-BtDHX36和pET15b-sumo-DmDHX36,将2种质粒分别转入表达菌株BL21(DE3)中,诱导表达2种目的蛋白,利用Ni-NTA层析柱、HisTrap SP HP柱纯化得到目的蛋白。然后,采用荧光各向异性法(FA)研究溶液和温度条件对2种蛋白底物结合活性的影响,以及二者的底物结合偏好性。最后利用快速停流-荧光共振能量转移(FRET)技术对2种DHX36的双链底物解旋活性进行比较。【结果】获得了纯度大于95%的全长BtDHX36和DmDHX36蛋白,2种DHX36解旋酶的最佳底物结合条件为:20 mmol/L Tris-HCl(pH 7.5)、50 mmol/L NaCl、2 mmol/L MgCl2、反应温度37℃。在此条件下,2种同源DHX36均可结合多种类型核酸底物(ssRNA、ssDNA、parallel G4、anti-parallel G4),且BtDHX36结合平行结构G4底物(parallel G4)的倾向更明显,DmDHX36无此趋势;2种DHX36解旋酶结合不同长度ssDNA的能力不同,BtDHX36更倾向于结合较长的单链DNA底物,而DmDHX36更倾向于结合较短的单链DNA底物;二者均能高效解旋dsRNA和dsDNA底物,DmDHX36更倾向于解旋dsDNA,而BtDHX36无明显倾向性。【结论】成功表达并纯化了BtDHX36和DmDHX36蛋白,确定了其最适结合条件,比较了2种DHX36解旋酶对不同底物的结合及解旋偏好。 展开更多
关键词 牛dhx36解旋酶 果蝇dhx36解旋酶 蛋白表达纯化 底物结合 底物解旋
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牛DHX36解旋酶及其突变体底物结合与解旋活性研究
2
作者 郭青青 郭海磊 +1 位作者 刘娜女 奚绪光 《西北农林科技大学学报（自然科学版）》 CSCD 北大核心 2021年第5期8-15,23,共9页
【目的】研究牛(Bos taurus)解旋酶DHX36(BtDHX36)及其突变体蛋白对含有G4结构底物结合和解旋活性的差异,为深入研究牛DHX36酶学特征和结构提供理论参考。【方法】制备底物16nt-ssDNA、Telomere G4和Telomere G4-16T,构建重组质粒pET15b... 【目的】研究牛(Bos taurus)解旋酶DHX36(BtDHX36)及其突变体蛋白对含有G4结构底物结合和解旋活性的差异,为深入研究牛DHX36酶学特征和结构提供理论参考。【方法】制备底物16nt-ssDNA、Telomere G4和Telomere G4-16T,构建重组质粒pET15b-sumo-BtDHX36,通过Overlap PCR引入点突变,构建位于RSM区和OB域的突变重组质粒,分别将质粒导入大肠杆菌BL21(DE3)菌株中诱导表达;经过Ni-NTA和Hi Trap SP HP柱纯化得到目的蛋白。以解离平衡常数为判定指标,利用荧光各向异性法(FA)对酶蛋白与底物结合时的KCl浓度(0,50和100 mmol/L)、反应温度(25,30和37℃)、MgCl 2浓度(0,2和5 mmol/L)、pH(6.5,7.5和8.5)进行优化,确定BtDHX36的体外最佳底物结合条件,比较野生型BtDHX36及其突变体对含有G4结构底物结合活性的差异。以解旋比例和速率常数为判定指标,利用快速停流-荧光共振能量转移(FRET)技术,比较野生型BtDHX36及其突变体对G4结构的解旋活性差异。【结果】成功构建了野生型BtDHX36重组质粒pET15b-sumo-BtDHX36及其RSM区突变体BtDHX36 R63AI65A、BtDHX36 Y69A、BtDHX36 K76AN77AK78A和OB域突变体BtDHX36 Y862A的重组质粒,诱导表达纯化后得到了纯度大于95%的酶蛋白。确定了野生型BtDHX36的体外最佳底物结合条件为:KCl 50 mmol/L、MgCl 22 mmol/L、20 mmol/L Tris-HCl pH=7.5、反应温度37℃。各突变位点均可降低酶蛋白与Telomere G4的结合活性。OB域的Y862A突变和RSM区K76AN77AK78A突变对酶蛋白解旋Telomere G4-16T活性均无明显影响;RSM区的R63AI65A和Y69A突变对酶蛋白解旋Telomere G4-16T均有较大影响。【结论】获得了高纯度的野生型BtDHX36及突变体酶蛋白,明晰了其体外最佳底物结合条件;RSM区的R63AI65A和Y69A突变均可明显降低酶蛋白解旋Telomere G4-16T的活性。 展开更多
关键词 牛解旋酶 dhx36解旋酶 解旋酶突变体 G4底物
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野猪DHX36解旋酶酶学特性及保守性分析
3
作者 徐思颖 郭海磊 奚绪光 《中国生物化学与分子生物学报》 CAS CSCD 北大核心 2022年第12期1681-1693,共13页
DHX36解旋酶(DEAH-box helicase 36)在生物体内广泛存在,可作为外源核酸传感器广泛参与机体免疫反应,因其对G-四链体具有高度亲和性和解旋活性而备受关注。目前已报道了3个物种DHX36解旋酶的三维结构,但其酶学活性的保守性研究鲜见报道... DHX36解旋酶(DEAH-box helicase 36)在生物体内广泛存在,可作为外源核酸传感器广泛参与机体免疫反应,因其对G-四链体具有高度亲和性和解旋活性而备受关注。目前已报道了3个物种DHX36解旋酶的三维结构,但其酶学活性的保守性研究鲜见报道。本文以哺乳动物野猪(Sus scrofa)DHX36解旋酶(SsDHX36)为研究对象,通过生物化学与生物物理研究技术系统研究了其酶学性质,并对比其与低等无脊椎动物黑腹果蝇(Drosophila melanogaster)DHX36解旋酶(DmDHX36)的活性,探究DHX36在物种间的功能保守性。本研究通过原核表达系统,分离纯化得到了纯度大于95%的SsDHX36解旋酶;利用荧光偏振和快速停留技术得到SsDHX36的最佳酶学反应条件,发现SsDHX36对G4 DNA具有平行构型的亲和选择性,对富含鸟嘌呤的ssDNA具有结合和解旋的底物偏好性;结合单分子荧光共振能量转移技术对SsDHX36和DmDHX36进行活性比较,发现两者与G4 DNA结合的构型选择性和对富含鸟嘌呤DNA的底物偏好性是保守的。但两者对不同序列长度ssDNA的亲和性差异显著,SsDHX36受序列长度影响较大且亲和力随序列长度的增加而增强,而DmDHX36则完全相反。本文克隆纯化了SsDHX36解旋酶并研究了其酶学活性,着重分析了SsDHX36和DmDHX36的功能保守性,为理解DHX36的保守功能机制,探究基于DHX36与富含鸟嘌呤序列互作的免疫反应酶学活性基础和靶向药物设计提供了理论与实验基础。 展开更多
关键词 野猪dhx36解旋酶 G-四链体 酶学活性 底物偏好性 功能保守性
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