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携带TRAIL基因的条件复制型腺病毒载体的构建及其辐射诱导表达 被引量：3
1
作者 王宏芳 吴嘉慧 +5 位作者 刘纯岩 刘威武 孙延红 龚守良 王志成 刘扬 《吉林大学学报（医学版）》 CAS CSCD 北大核心 2014年第4期699-704,共6页
目的:构建携带早期生长反应基因-1(Egr-1)启动子和肿瘤坏死因子相关的凋亡诱导配体(TRAIL)基因的条件复制型腺病毒载体pAd-Egr1-TRAIL-hTERT-E1A-E1Bp-E1B55K,观察其联合2.0Gy X射线照射对人乳腺癌MDA-MB-231细胞TRAIL表达的影响。方法:... 目的:构建携带早期生长反应基因-1(Egr-1)启动子和肿瘤坏死因子相关的凋亡诱导配体(TRAIL)基因的条件复制型腺病毒载体pAd-Egr1-TRAIL-hTERT-E1A-E1Bp-E1B55K,观察其联合2.0Gy X射线照射对人乳腺癌MDA-MB-231细胞TRAIL表达的影响。方法:以pMD18T-Egr1为模板,成功克隆Egr-1序列,将TRAIL基因置于下游,构建条件复制型腺病毒载体pShuttle-Egr1-TRAIL-hTERT-E1A-E1BpE1B55K(CRAd.pEgr1-TRAIL),病毒包装后感染细胞,给予X线照射,利用Real time PCR法检测TRAIL mRNA表达水平,ELISA法检测TRAIL蛋白表达水平。实验设对照(control)组、2Gy组、空病毒(CRAd.p)组、CRAd.p+2Gy组、CRAd.p-Egr1-TRAIL组和CRAd.p-Egr1-TRAIL+2Gy组。结果:成功构建pAd-Egr1-TRAIL-hTERT-E1A-E1Bp-E1B55K,并进行了病毒包装。以病毒滴度5感染复数(MOI)感染MDA-MB-231细胞24h后给予2.0Gy X射线照射,4h后MDA-MB-231各组细胞中TRAIL mRNA表达水平开始升高,8h后各组表达达峰值;CRAd.pEgr1-TRAIL+2.0Gy组mRNA表达水平升高最为明显,约为对照组的160倍(P<0.01),随后表达水平逐渐下降;6h后各组MDA-MB-231细胞中TRAIL蛋白表达水平开始升高,24h后各组TRAIL蛋白表达水平达峰值,48h后TRAIL蛋白表达水平下降,但仍未降至正常水平;与其他各组比较,CRAd.pEgr1-TRAIL+2.0Gy组TRAIL蛋白表达水平升高最明显(P<0.01)。结论:成功获得条件复制型腺病毒载体,联合2.0Gy X射线照射可使MDA-MB-231细胞中TRAIL mRNA和蛋白表达水平升高。 展开更多
关键词 X射线 肿瘤坏死因子相关的凋亡诱导配体 条件复制型腺病毒 MDA-MB-231细胞
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双重靶向条件复制型腺病毒的包装及抗肿瘤作用 被引量：2
2
作者 王宏芳 刘扬 +5 位作者 李金华 吴嘉慧 李艳博 王志成 刘威武 龚守良 《西安交通大学学报（医学版）》 CAS CSCD 北大核心 2013年第3期308-312,共5页
目的构建并包装以人端粒酶逆转录酶(human telomerase reverse transcriptase,hTERT)启动子调控E1A(CR2区缺失)蛋白表达的肿瘤细胞双重靶向条件复制型腺病毒(conditionally replicating adenovirus,CRAd),并探讨其对肿瘤细胞的抑制作用... 目的构建并包装以人端粒酶逆转录酶(human telomerase reverse transcriptase,hTERT)启动子调控E1A(CR2区缺失)蛋白表达的肿瘤细胞双重靶向条件复制型腺病毒(conditionally replicating adenovirus,CRAd),并探讨其对肿瘤细胞的抑制作用。方法采用PCR技术扩增hTERT启动子序列,将其克隆至pShuttle-E1A-E1Bp-E1B55K载体(E1A基因CR2区缺失)中,构建重组腺病毒质粒,并转染HEK293细胞进行病毒包装,PCR鉴定;CCK-8法检测重组腺病毒(CRAd.p-hTERT-E1A-E1Bp-E1B55K,简称CRAd.p)对肿瘤细胞的抑制作用。结果 hTERT启动子序列克隆正确;pShuttle-hTERT-E1A-E1Bp-E1B55K经KpnⅠ单酶切可见1 542bp和6 775bp两条电泳带,PCR鉴定得到250、1 148bp和298bp基因片段;CRAd.p经PCR扩增得到250、1 148bp和298bp基因片段,鉴定结果与预期完全相符;CRAd.p感染MCF-7、MDA-MB-231、HepG2和HTC-8细胞72h后与各自对照组比较差异均有统计学意义(P<0.01);CRAd.p感染MDA-MB-231细胞后10～250MOI组细胞吸光度值与对照组比较差异均有统计学意义(P<0.05或P<0.01),随着感染时间延长,抑制作用越发明显。结论成功获得对肿瘤细胞具有双重靶向和溶瘤作用的条件复制型腺病毒,为基因治疗的靶向性和有效性提供了可能。 展开更多
关键词 条件复制型腺病毒 人端粒酶逆转录酶 基因治疗 抗肿瘤
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单重靶向条件复制型腺病毒穿梭载体pshuttle-E1A-E1Bp-E1B55K的构建及鉴定 被引量：2
3
作者 王宏芳 李金华 +4 位作者 刘扬 李艳博 王志成 刘威武 龚守良 《吉林大学学报（医学版）》 CAS CSCD 北大核心 2010年第5期821-824,共4页
目的:构建并鉴定一种新型E1A基因CR2区选择性缺失的腺病毒穿梭载体pshuttle-E1A-E1Bp-E1B55K,为包装单重靶向条件复制型腺病毒进行肿瘤基因治疗奠定基础。方法:采用RT-PCR法从人胚肾细胞(293T)中扩增条件复制型腺病毒必需的E1区基因,包... 目的:构建并鉴定一种新型E1A基因CR2区选择性缺失的腺病毒穿梭载体pshuttle-E1A-E1Bp-E1B55K,为包装单重靶向条件复制型腺病毒进行肿瘤基因治疗奠定基础。方法:采用RT-PCR法从人胚肾细胞(293T)中扩增条件复制型腺病毒必需的E1区基因,包括E1A、E1Bp及E1B55K基因片段;重叠PCR法扩增CR2区缺失的E1A基因;采用基因重组技术构建pshuttle-E1A-E1Bp-E1B55K重组质粒,并进行PCR及酶切鉴定。结果:经测序证实获得的E1B55K及CR2区缺失的E1A基因与GenBank公布的完全一致,E1A基因CR2区缺失的pshuttle-E1A-E1Bp-E1B55K质粒经分别经XbaⅠ与KpnⅠ单酶切,得到大小约为817和1244bp的酶切片段,PCR鉴定得到约250及1148bp的基因片段,鉴定结果与预期结果完全一致。结论:E1A基因CR2区选择性缺失的单重靶向条件复制型腺穿梭载体pshuttle-E1A-E1Bp-E1B55K构建成功。 展开更多
关键词 条件复制型腺病毒 穿梭载体 E1A基因
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CXCR4启动子的条件复制型腺病毒对肺癌细胞的靶向杀伤作用
4
作者 李龙光 李书华 +3 位作者 王红艳 龙捷 谢晓斌 张雅洁 《中国病理生理杂志》 CAS CSCD 北大核心 2015年第7期1203-1208,共6页
目的:构建CXCR4启动子的条件复制型腺病毒载体CRAd-CXCR4-GFP,探究CRAd-CXCR4-GFP对肺癌细胞的靶向杀伤效应。方法:PCR法扩增人CXCR4-E1A基因并克隆至穿梭质粒p DC316-GFP,将骨架质粒p BHG-lox-E1,3Cre和重组质粒p DC316-CXCR4-GFP共转... 目的:构建CXCR4启动子的条件复制型腺病毒载体CRAd-CXCR4-GFP,探究CRAd-CXCR4-GFP对肺癌细胞的靶向杀伤效应。方法:PCR法扩增人CXCR4-E1A基因并克隆至穿梭质粒p DC316-GFP,将骨架质粒p BHG-lox-E1,3Cre和重组质粒p DC316-CXCR4-GFP共转染293细胞,产生重组腺病毒CRAd-CXCR4-GFP并扩增,扩增后进行PCR鉴定和腺病毒滴度测定;real-time PCR检测5种肺癌细胞株CXCR4的mRNA表达,筛选出表达最高的A549细胞;将CRAd-CXCR4-GFP和Ad-NULL分别转染A549细胞,检测两者转染后CXCR4启动子活性和腺病毒复制数;将CRAd-CXCR4-GFP和Ad-NULL分别转染A549细胞和16HBE细胞,流式细胞术检测各组细胞凋亡情况,CCK-8检测各组细胞活性。结果:成功构建重组质粒p DC316-CXCR4-GFP,与骨架质粒p BHG-lox-E1,3Cre共转染293细胞后第11天可见片状绿色荧光;PCR表明目的基因CXCR4-E1A已成功整合在重组腺病毒基因组中;测定重组腺病毒滴度为1×1013PFU/L;CRAd-CXCR4-GFP转染A549细胞后E1A的mRNA和E4表达较Ad-NULL组明显上升;与Ad-NULL组和空白对照组相比,CRAd-CXCR4-GFP组前4 d A549细胞凋亡率和活性无明显差异,第5天细胞凋亡率明显增加,细胞活性明显降低,各组间5 d内16HBE细胞的细胞凋亡率和细胞活性均无明显变化。结论:成功构建条件复制型腺病毒表达载体CRAd-CXCR4-GFP,该载体对肺癌细胞具有靶向杀伤作用。 展开更多
关键词 条件复制型腺病毒 肿瘤特异性启动子 CXCR4启动子
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PTEN增强溶瘤腺病毒对前列腺癌细胞的特异性杀伤作用 被引量：2
5
作者 文博 李晓铭 +4 位作者 徐丽娟 黄小佳 邱建忠 张勇辉 许祥 《华中科技大学学报（医学版）》 CAS CSCD 北大核心 2011年第4期429-432,454,共5页
目的研究由survivin启动子调控、携带抑癌基因PTEN的条件复制型重组腺病毒对前列腺癌细胞的杀伤作用。方法构建含有survivin启动子和PTEN基因的重组腺病毒reADGL3BSurvPTEN,感染前列腺癌细胞系和正常前列腺上皮细胞系。利用Western blo... 目的研究由survivin启动子调控、携带抑癌基因PTEN的条件复制型重组腺病毒对前列腺癌细胞的杀伤作用。方法构建含有survivin启动子和PTEN基因的重组腺病毒reADGL3BSurvPTEN,感染前列腺癌细胞系和正常前列腺上皮细胞系。利用Western blot检测病毒感染前后前列腺癌细胞中PTEN的表达变化,CCK-8法及流式细胞学检测重组腺病毒对前列腺癌细胞生长及凋亡的影响。结果 PCR结果证实成功构建了含有survivin启动子和PTEN基因的腺病毒载体reADGL3BSurvPTEN,Western blot结果显示感染ADGL3BSurvPTEN后在高表达survivin的前列腺癌细胞中PTEN表达明显增高,而在不表达survivin的正常前列腺细胞中,仅检测到内源性PTEN的表达。CCK-8法及流式细胞术结果表明reADGL3BSurvPTEN病毒对前列腺癌细胞的杀伤作用较不含PTEN基因的腺病毒re-ADGL3Bsurvivin更加明显,对正常前列腺上皮细胞没有显著的杀伤作用。结论成功构建了含有survivin启动子和PTEN基因的条件复制型腺病毒,该病毒对前列腺癌细胞有显著的杀伤作用,实验结果为前列腺癌细胞靶向治疗提供了更为良好的条件复制型病毒载体及新的治疗策略。 展开更多
关键词 SURVIVIN启动子 PTEN 条件复制型腺病毒 前列腺癌
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腺病毒提高腺相关病毒在耐药与非耐药肿瘤细胞中的基因表达及其机制
6
作者 张圣海 吴继红 +4 位作者 董小岩 吴小兵 田毓华 刘新建 黄倩 《中国肿瘤生物治疗杂志》 CAS CSCD 2007年第5期405-410,共6页
目的:研究利用低剂量腺病毒提高重组腺相关病毒2型(recombined adeno-associated virus,rAAV2)在耐药与非耐药肿瘤细胞中基因表达水平的新方法,并初步探讨其可能的作用机制。方法:rAAV2-GFP单独或联合复制缺陷型腺病毒(Ad5-RFP)或条件... 目的:研究利用低剂量腺病毒提高重组腺相关病毒2型(recombined adeno-associated virus,rAAV2)在耐药与非耐药肿瘤细胞中基因表达水平的新方法,并初步探讨其可能的作用机制。方法:rAAV2-GFP单独或联合复制缺陷型腺病毒(Ad5-RFP)或条件复制型腺病毒(Ad5-TERT-RFP)感染人非小细胞肺癌细胞系(NCI-H446)、人肺腺癌细胞系(A549)、人胃癌细胞系(SGC7901)、人口腔黏膜上皮癌细胞系(KB)和人口腔黏膜上皮癌耐长春新碱细胞系(KB/VCR)。荧光显微镜观察和流式细胞仪分析肿瘤细胞感染后GFP的表达;Western blotting检测感染后肿瘤细胞GFP蛋白表达及ERK和AKT磷酸化水平;Real-time PCR检测肿瘤细胞内GFP的mRNA表达量、DNA拷贝数,以及细胞表面受体HSPG、α_v integrin和FGFR-1的mRNA表达。结果:流式细胞结果显示,rAAV2-GFP联合Ad5-RFP或Ad-TERT-RFP感染肿瘤细胞24h后,GFP阳性细胞率和GFP平均荧光亮度分别提高了约0.3～3倍和4～8倍。Western blotting证实联合应用Ad5-RFP感染肿瘤细胞后24h,GFP蛋白表达增加约4～6倍,肿瘤细胞内ERK和AKT磷酸化水平升高。联合感染后细胞内GFP的mRNA表达量提高了3.83～7.33倍,DNA拷贝数未见明显改变,HSPG、α_v integrin和FGFR-1的mRNA表达轻微提高。结论:低剂量腺病毒显著提高rAAV2在耐药与非耐药肿瘤细胞中的基因表达水平,可能与激活信号传导通路、增加细胞内转录有关。 展开更多
关键词 重组腺相关病毒 复制缺陷型腺病毒 条件复制型腺病毒 肿瘤细胞 基因表达
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肝癌选择性溶瘤腺病毒的构建及其体外抑瘤作用
7
作者 傅强 王慧萍 +4 位作者 韦芳 李慧明 陈霞芳 王煜非 黄倩 《中国肿瘤生物治疗杂志》 CAS CSCD 北大核心 2009年第2期113-119,共7页
目的:构建由AFP基因增强子-启动子调控,并携带自杀基因TK的新型条件复制型腺病毒载体,观察该载体的选择复制能力、溶瘤作用及其与前药GCV联合处理对肝癌细胞的杀伤作用。方法:以HepG2基因组DNA为模板,PCR扩增AFP基因启动子(AFPp)和增强... 目的:构建由AFP基因增强子-启动子调控,并携带自杀基因TK的新型条件复制型腺病毒载体,观察该载体的选择复制能力、溶瘤作用及其与前药GCV联合处理对肝癌细胞的杀伤作用。方法:以HepG2基因组DNA为模板,PCR扩增AFP基因启动子(AFPp)和增强子(AFPe),构建表达质粒pAFPp-EGFPluc和pAFPep-EGFPluc,再构建由AFPep调控E1A表达、并携带TK基因的穿梭质粒pDC311-AFPep-E1A/CMV-TK,利用AdMax系统包装腺病毒Ad.AFPep-E1A/CMV-TK;利用Western blotting、病毒增殖测试、细胞病变效应实验、病毒联合前药GCV对肝癌细胞的杀伤实验等鉴定病毒的复制能力、溶瘤作用和对肝癌细胞的杀伤作用。结果:成功构建的腺病毒载体Ad.AFPep-E1A/CMV-TK在AFP阳性细胞中选择性复制,病毒自身具有一定的溶瘤作用;该病毒载体联合GCV前药系统处理肝癌细胞后,AFP阳性肝癌HepG2细胞和Hep3B细胞的存活率分别为(10.35±1.07)%、(15.49±5.80)%,AFP阴性的张氏肝细胞和人肺癌NCIH460细胞的存活率分别为(73.55±4.36)%、(74.54±9.89)%(P<0.01)。结论:构建的新型溶瘤腺病毒载体具有选择性杀伤肝癌细胞的能力,在肝癌治疗方面有良好的应用前景。 展开更多
关键词 肝肿瘤 条件复制型腺病毒载体 HSV-1TK基因 甲胎蛋白基因启动子 甲胎蛋白基因增强子 病毒-基因治疗
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