猪流感H1N1亚型NP基因杆状病毒表达载体构建及其在昆虫细胞中的表达 被引量：1

1

作者 段博芳 张利仙 +5 位作者 段纲 董俊 叶玲玲 周晓黎 徐志斌 艾军 《中国人兽共患病学报》 CAS CSCD 北大核心 2010年第12期1118-1122,共5页

目的获得研发A型猪流感病毒ELISA检测试剂盒和制备NP蛋白单克隆抗体的抗原物质。方法根据已报道的猪流感病毒H1N1亚型NP基因序列(GenBank登录号:GQ422386)人工合成NP基因,通过XbaⅠ和EcoRⅠ特异性酶切,将NP基因克隆于昆虫杆状病毒表达载... 目的获得研发A型猪流感病毒ELISA检测试剂盒和制备NP蛋白单克隆抗体的抗原物质。方法根据已报道的猪流感病毒H1N1亚型NP基因序列(GenBank登录号:GQ422386)人工合成NP基因,通过XbaⅠ和EcoRⅠ特异性酶切,将NP基因克隆于昆虫杆状病毒表达载体pFastBacHTB,经PCR、酶切、测序鉴定后,获得携带NP基因的重组质粒pFast-BacHTB-NP。该重组质粒转化含有杆状病毒穿梭载体的DH10Bac感受态细胞,经抗生素、PCR筛选,获得转座的杆粒Bac-mid-NP。在脂质体介导下转染sf9昆虫细胞,获得重组杆状病毒,再感染细胞,收获目的蛋白。结果通过SDS-PAGE和Westernblotting分析表明该蛋白得到表达,且具有良好的生物活性,大小约为57KD。结论实验结果表明已成功构建了携带NP基因的重组质粒pFastBacHTB-NP和转座的杆粒Bacmid-NP,转染后在sf9昆虫细胞上成功的表达。 展开更多

关键词 H1N1 NP基因 杆状病毒表达载体 昆虫细胞

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日本血吸虫翻译控制肿瘤蛋白基因的杆状病毒表达载体构建和在昆虫细胞中的表达 被引量：1

2

作者 王海 胡少敏 +3 位作者 黄艳 吕刚 吴忠道 余新炳 《中国人兽共患病杂志》 CSCD 北大核心 2005年第8期656-659,共4页

目的构建日本血吸虫的翻译控制肿瘤蛋白(SjTCTP)基因的杆状病毒重组供体质粒pFASTA-TCTP,用该重组转移质粒转化含有杆状病毒表达载体以构建BacmidGFP-TCTP,感染昆虫细胞进行表达。方法将已克隆的SjTCTP基因与线性化的pFASTA进行连接为pF... 目的构建日本血吸虫的翻译控制肿瘤蛋白(SjTCTP)基因的杆状病毒重组供体质粒pFASTA-TCTP,用该重组转移质粒转化含有杆状病毒表达载体以构建BacmidGFP-TCTP,感染昆虫细胞进行表达。方法将已克隆的SjTCTP基因与线性化的pFASTA进行连接为pFASTA-TCTP,使pFASTA-TCTP与DH10BAC感受菌进行转座重组,利用抗性及蓝白斑筛选重组BacmidGFP-TCTP克隆,提取BacmidGFP-TCTP转染昆虫细胞Sf9获得有感染力的病毒,利用病毒感染Sf9细胞进行蛋白表达,通过荧光镜观察、RT-PCR、SDS-PAGE和Western-Blotting检测表达情况。结果获得了重组SjTCTP的杆状病毒,细胞能表达出与SjTCTP单抗结合的、分子量为23kDa左右的融合有组氨酸标签的目的蛋白。结论SjTCTP能在昆虫细胞中获得良好表达,为其的分子生物学活性研究奠定了基础。 展开更多

关键词 日本血吸虫 SjTCTP 杆状病毒表达载体 SF9细胞

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人VEGF基因昆虫杆状病毒表达载体的构建 被引量：1

3

作者 孙丽翠 王雅梅 +2 位作者 祁雅慧 闫豫东 张静宜 《首都医科大学学报》 CAS 2004年第2期159-161,共3页

为了在昆虫杆状病毒表达系统表达人血管内皮细胞生长因子 (VEGF)基因 ,用HindⅢ对 pcDNA3 .1 /VEGF进行酶切 ,回收 5 75bp的VEGF片段 ,与 pFastBacI载体连接 ,得到含VEGF基因的转座载体 pFast/VEGF ,NcoI酶切鉴定方向 ;将其转化到含有... 为了在昆虫杆状病毒表达系统表达人血管内皮细胞生长因子 (VEGF)基因 ,用HindⅢ对 pcDNA3 .1 /VEGF进行酶切 ,回收 5 75bp的VEGF片段 ,与 pFastBacI载体连接 ,得到含VEGF基因的转座载体 pFast/VEGF ,NcoI酶切鉴定方向 ;将其转化到含有穿梭载体杆粒 (Bacmid)的DH1 0Bac感受态细胞 ,得到重组杆状病毒穿梭载体Bacmid/VEGF ,采用琼脂糖凝胶电泳、PCR扩增对重组转座载体、穿梭载体进行鉴定。将Bacmid/VEGF转染sf 9细胞 ,进行病毒重组及噬斑筛选。结果 :琼脂糖电泳得到杆粒 (Bacmid)DNA条带 ,PCR扩增得到 5 75bp的VEGF片段 ,病毒液在 1 0 - 7稀释度时出现噬斑 ,约 5 0个 /孔。说明已成功构建了重组杆状病毒穿梭载体并重组出杆状病毒。 展开更多

关键词 人VEGF基因 昆虫杆状病毒表达载体 构建 噬斑筛选

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禽腺联病毒VP基因的克隆及杆状病毒表达载体的构建

4

作者 王安平 朱善元 +3 位作者 吴双 王永娟 左伟勇 洪伟鸣 《江苏农业科学》 北大核心 2013年第8期25-27,共3页

根据禽腺联病毒VP基因序列设计引物,扩增出VP基因,将其克隆至杆状病毒表达载体pFastBac1,经酶切鉴定筛选出阳性重组转移载体pFastBac-VP,并对阳性质粒进行测序及序列分析;将pFastBac-VP转化到DH10Bac感受态细胞中,与Bacmid发生位点特异... 根据禽腺联病毒VP基因序列设计引物,扩增出VP基因,将其克隆至杆状病毒表达载体pFastBac1,经酶切鉴定筛选出阳性重组转移载体pFastBac-VP,并对阳性质粒进行测序及序列分析;将pFastBac-VP转化到DH10Bac感受态细胞中,与Bacmid发生位点特异性转座作用,经抗性和蓝白斑筛选,获得含VP基因的重组穿梭载体rBacmid-VP。研究结果为进一步在昆虫细胞中表达VP基因,开发研制重组禽腺联病毒载体奠定了基础。 展开更多

关键词 禽腺联病毒 VP基因 杆状病毒表达载体 克隆

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利用杆状病毒表达载体系统表达重组乙型肝炎病毒核心蛋白 被引量：2

5

作者 高琳琳 王晓燕 +4 位作者 张颖慧 李岩 邓菲 张艳芳 林菊生 《华中科技大学学报（医学版）》 CAS CSCD 北大核心 2007年第6期787-790,共4页

目的利用杆状病毒表达载体系统制备重组乙型肝炎病毒核心蛋白。方法构建含有HBV C基因的杆状病毒转移载体pFastBac Dual-HBV core,转化大肠埃希菌DH10Bac进行转座,提取重组Bacmid DNA转染昆虫细胞Sf9,获得含有HBV C基因的重组杆状病毒... 目的利用杆状病毒表达载体系统制备重组乙型肝炎病毒核心蛋白。方法构建含有HBV C基因的杆状病毒转移载体pFastBac Dual-HBV core,转化大肠埃希菌DH10Bac进行转座,提取重组Bacmid DNA转染昆虫细胞Sf9,获得含有HBV C基因的重组杆状病毒。用重组杆状病毒感染Sf9细胞进行乙型肝炎病毒核心蛋白表达,然后通过SDS-PAGE电泳和Western blot分析表达情况。结果成功构建了含HBV C基因的重组杆状病毒,而且在昆虫细胞Sf9中表达了乙型肝炎病毒核心蛋白。结论利用Bac to Bac杆状病毒表达系统,成功地表达了乙型肝炎病毒核心蛋白,为进一步研究奠定了基础。 展开更多

关键词 乙型肝炎病毒核心蛋白 杆状病毒表达载体系统 昆虫细胞

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人血小板因子Ⅳ在家蚕杆状病毒表达载体系统中的表达 被引量：1

6

作者 于威 金勇丰 +1 位作者 吴玉澄 张耀洲 《蚕业科学》 CAS CSCD 2001年第2期100-103,共4页

将人血小板因子Ⅳ (HumanPlateletFactorⅣ ,简称hPF4)基因重组于家蚕杆状病毒转移载体pBacPAK8中 ,获得重组转移载体pBacPAK PF4,并与线性化病毒Bm BacPAK6DNA共转染家蚕培养细胞 ,在细胞内发生同源重组 ,获得重组病毒BacPAK PF4。Sout... 将人血小板因子Ⅳ (HumanPlateletFactorⅣ ,简称hPF4)基因重组于家蚕杆状病毒转移载体pBacPAK8中 ,获得重组转移载体pBacPAK PF4,并与线性化病毒Bm BacPAK6DNA共转染家蚕培养细胞 ,在细胞内发生同源重组 ,获得重组病毒BacPAK PF4。Southern杂交结果表明重组病毒基因组中含有hPF4基因。重组病毒以MOI=10感染家蚕培养细胞 (2× 10 6个细胞 )和家蚕 5龄幼虫 ,表达产物用体外培养的血管内皮细胞测定其生物活性 ,测得表达量在家蚕培养细胞中第 3天达到最高值为 6 0 88μg/ 2× 10 6个细胞 ;在蚕体内表达第 5天达到最高值 。 展开更多

关键词 人血小板因子Ⅳ 家蚕杆状病毒表达载体系统 基因表达 生物活性

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猴B病毒gB基因杆状病毒表达载体的构建 被引量：3

7

作者 王琼 吴志蕾 +5 位作者 艾军 李绍东 周亚敏 叶玲玲 董俊 周晓黎 《云南畜牧兽医》 2010年第1期4-5,共2页

根据B病毒E2490株(基因序列AF533768)人工合成猴B病毒gB基因,通过XbaI和EcoRI特异性酶切,将其亚克隆于昆虫杆状病毒表达载体pFastBacHTA,经PCR、酶切及测序鉴定,表明构建了猴B病毒gB基因杆状病毒表达重组质粒pFastHTA-gB。在此基础上,... 根据B病毒E2490株(基因序列AF533768)人工合成猴B病毒gB基因,通过XbaI和EcoRI特异性酶切,将其亚克隆于昆虫杆状病毒表达载体pFastBacHTA,经PCR、酶切及测序鉴定,表明构建了猴B病毒gB基因杆状病毒表达重组质粒pFastHTA-gB。在此基础上,重组质粒转化DH10Bac感受态细胞,经平板抗性筛选,PCR鉴定,表明获得了转座的杆粒,为下一步进行昆虫细胞的转染和以猴B病毒gB蛋白为抗原的猴B病毒ELISA检测试剂盒的研制奠定了基础。 展开更多

关键词 猴B病毒 GB基因 杆状病毒表达载体

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杆状病毒表达载体系统研究进展

8

作者 李青兵 《广东蚕业》 1998年第4期60-64,共5页

昆虫杆状病毒科(Baculoviridae)因包埋于多角体中的病毒粒子呈棒状而得名,迄今为止,用于基因工程的杆状病毒均属核型多角体病毒(nuclear polyhedrosis virus,NPV)。NPV是一类双链DNA病毒,它的DNA是90—230Kb的环状分子。利用NPV作为外... 昆虫杆状病毒科(Baculoviridae)因包埋于多角体中的病毒粒子呈棒状而得名,迄今为止,用于基因工程的杆状病毒均属核型多角体病毒(nuclear polyhedrosis virus,NPV)。NPV是一类双链DNA病毒,它的DNA是90—230Kb的环状分子。利用NPV作为外源基因表达载体的设想最初是由Miller 1981年提出。 展开更多

关键词 杆状病毒表达载体系统 启动子序列 外源基因 昆虫杆状病毒 多角体蛋白 转移载体 研究进展 重组病毒 核型多角体病毒 病毒粒子

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表达鸡传染性支气管炎病毒SD/97/01株S1蛋白的重组杆状病毒的构建 被引量：4

9

作者 戴亚斌 陈德胜 +6 位作者 丁铲 潘杰彦 刘兴友 芦银华 刘梅 陈溥言 蔡宝祥 《厦门大学学报（自然科学版）》 CAS CSCD 北大核心 2002年第4期487-492,共6页

采用BAC TO BAC 杆状病毒表达载体系统构建了表达鸡传染性支气管炎病毒 (IBV)呼吸型毒株SD/ 97/ 0 1S1蛋白的重组杆状病毒 .含SD/ 97/ 0 1株S1基因的重组质粒pMDSD970 1S1用BamHI和SalI双酶切后 ,回收目的片段并克隆到杆状病毒转座载体p... 采用BAC TO BAC 杆状病毒表达载体系统构建了表达鸡传染性支气管炎病毒 (IBV)呼吸型毒株SD/ 97/ 0 1S1蛋白的重组杆状病毒 .含SD/ 97/ 0 1株S1基因的重组质粒pMDSD970 1S1用BamHI和SalI双酶切后 ,回收目的片段并克隆到杆状病毒转座载体pFASTBAC HTa中多角体基因启动子的下游 ,筛选出重组转座质粒pFASTSD970 1S1并转化大肠杆菌DH10 BAC 后 ,获得重组穿梭质粒rBacmidSD970 1S1.用重组穿梭质粒DNA转染昆虫Sf9细胞 ,获得了含SD/ 97/ 0 1S1基因的重组杆状病毒rAcSD970 1S1.重组病毒感染Sf9细胞后 ,用SDS PAGE、Westernblot和IFA对细胞表达产物进行检测和分析 .结果表明 :构建的重组杆状病毒能够在昆虫细胞中表达SD/ 97/ 0 1的S1蛋白 ,该蛋白具有天然蛋白的抗原性 . 展开更多

关键词 鸡 传染性支气管炎病毒 SD/97/01 S1基因 S1蛋白 杆状病毒表达载体 基因表达 基因重组

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猪繁殖与呼吸综合征病毒兰州分离株ORF3基因的克隆及杆状病毒载体的构建 被引量：1

10

作者 赵娜 田宏 +5 位作者 祁燕蓉 满自萍 吴锦艳 尚佑军 何生虎 刘湘涛 《西北农业学报》 CAS CSCD 北大核心 2009年第3期1-5,共5页

根据猪繁殖与呼吸综合症病毒已知序列(ch-1a,AY032626)设计包含完整ORF3序列的1对引物,采用RT-PCR方法扩增PRRSV甘肃Lanzhou株的ORF3基因,将其克隆到杆状病毒载体pFastBac HTA上,经酶切鉴定、PCR鉴定筛选出阳性重组转移载体pFastBac HTA... 根据猪繁殖与呼吸综合症病毒已知序列(ch-1a,AY032626)设计包含完整ORF3序列的1对引物,采用RT-PCR方法扩增PRRSV甘肃Lanzhou株的ORF3基因,将其克隆到杆状病毒载体pFastBac HTA上,经酶切鉴定、PCR鉴定筛选出阳性重组转移载体pFastBac HTA-ORF3,并对阳性质粒进行测序及序列分析;将pFastBac HTA-ORF3转化到DH10Bac感受态细胞中,与Bacmid发生位点特异性转座作用,获得重组转座子rBacmid-ORF3。成功构建了PRRSV Lanzhou株ORF3基因的杆状病毒载体,为基因工程疫苗的研制奠定了基础。 展开更多

关键词 猪繁殖与呼吸综合征病毒 ORF3基因 克隆 杆状病毒表达载体

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人白细胞介素-4基因在家蚕杆状病毒表达系统中的表达

11

作者 陈蔚青 史锋 +1 位作者 朱成钢 申屠超 《蚕业科学》 CAS CSCD 北大核心 2006年第4期512-516,共5页

采用RT-PCR法从经LPS诱导刺激的人外周血淋巴细胞中克隆了人白细胞介素-4（human interleukin-4，hIL-4）基因。为高效表达hIL-4，促进其临床应用，将hIL-4插入家蚕杆状病毒转移载体pBacPAK8中，构建重组载体pBacPAK-hIL-4，并与线性化... 采用RT-PCR法从经LPS诱导刺激的人外周血淋巴细胞中克隆了人白细胞介素-4（human interleukin-4，hIL-4）基因。为高效表达hIL-4，促进其临床应用，将hIL-4插入家蚕杆状病毒转移载体pBacPAK8中，构建重组载体pBacPAK-hIL-4，并与线性化病毒Bm-BacPAK6 DNA共转染家蚕BmN细胞，获得重组病毒BacPAK-hIL-4。将重组病毒感染家蚕5龄幼虫和蚕蛹（1×10^5PFU／头），表达产物以ELISA、SDS-PAGE和Western blotting方法检测。用活化的人外周血T淋巴细胞测定表达产物体外生物活性。ELISA法结果表明hIL-4在感染病毒后96h的蚕血淋巴和120h的蚕蛹中表达量最高，分别达到2．3μg/mL蚕血淋巴和10．2μg／mL体液；SDS-PAGE、Western blotting分析表明表达产物分子量约20kD；表达产物对活化的T淋巴细胞增殖具有明显促进作用。 展开更多

关键词 人白细胞介素-4基因 克隆 表达 家蚕杆状病毒表达载体系统

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禽流感病毒NS1蛋白在杆状病毒表达系统中的表达 被引量：3

12

作者 李东卫 郭莹莹 +5 位作者 刘在斯 王世达 沈楠 文辉强 焦同路 王靖飞 《动物医学进展》 CSCD 北大核心 2012年第6期27-31,共5页

为获得纯化的禽流感病毒(AIV)的NS1蛋白,将A/chicken/Guangxi/10/99(H9N2)(CK/GX/10/99)NS1全长核苷酸克隆至杆状病毒转移载体pFastBacHTA中,构建了重组转移载体pFastBacHTA-NS1,然后转化入DH10Bac感受态细胞中制备重组杆粒,在脂质体介... 为获得纯化的禽流感病毒(AIV)的NS1蛋白,将A/chicken/Guangxi/10/99(H9N2)(CK/GX/10/99)NS1全长核苷酸克隆至杆状病毒转移载体pFastBacHTA中,构建了重组转移载体pFastBacHTA-NS1,然后转化入DH10Bac感受态细胞中制备重组杆粒,在脂质体介导下转染sf9昆虫细胞,获得表达NS1基因的重组杆状病毒。用重组杆状病毒转染昆虫细胞sf9进行NS1蛋白的表达,通过SDS-PAGE电泳、Western blot、间接免疫荧光(IFA)对表达的目标蛋白进行分析。结果表明,构建了含NS1基因的重组杆状病毒,分子质量约30ku的重组蛋白得到了表达,为NS1的相关功能研究奠定了基础。 展开更多

关键词 禽流感病毒 NS1蛋白 杆状病毒表达载体系统 蛋白纯化

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鸡白细胞介素18成熟蛋白在昆虫杆状病毒系统中的表达及其活性检测 被引量：1

13

作者 范忠玲 王婷婷 +1 位作者 马凤龙 胡敬东 《山东农业大学学报（自然科学版）》 CSCD 北大核心 2011年第3期438-444,共7页

首先将鸡白细胞介素18成熟蛋白(mature chicken interleukin-18,mChIL-18)基因亚克隆至杆状病毒转移载体pFastBac HTb上,然后转化至含穿梭载体Bacmid的受体菌E.coli DH10BacTM中,构建重组Bacmid(rBacmid)。通过脂质体介导法将纯化的rBac... 首先将鸡白细胞介素18成熟蛋白(mature chicken interleukin-18,mChIL-18)基因亚克隆至杆状病毒转移载体pFastBac HTb上,然后转化至含穿梭载体Bacmid的受体菌E.coli DH10BacTM中,构建重组Bacmid(rBacmid)。通过脂质体介导法将纯化的rBacmid转染sf9细胞,获得完整重组杆状病毒,将达到一定滴度的重组杆状病毒感染sf9,收获感染后不同时间段的培养上清和细胞,经SDS-PAGE分析、Western-blotting和间接免疫荧光(IFA)检测,结果表明,分子量约为23KDa的重组蛋白在昆虫细胞中获得了表达;鸡淋巴细胞转化试验和水疱性口炎病毒(VSV)抑制试验表明,表达产物具有良好的生物学活性。结论:在杆状病毒表达系统中成功表达了有活性的mChIL-18蛋白。 展开更多

关键词 ChIL-18成熟蛋白 杆状病毒表达载体系统 昆虫细胞 生物学活性

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重组杆状病毒感染悬浮昆虫细胞及重组蛋白表达策略的优化

14

作者 李文丽 刘霞 +2 位作者 刘在新 卢曾军 范朋举 《河南农业科学》 CSCD 北大核心 2018年第8期118-122,共5页

为确定嵌合口蹄疫病毒(FMDV)中和表位的猪细小病毒(PPV)衣壳蛋白在昆虫细胞(Sf-9)中的最佳表达条件。通过对比悬浮培养和贴壁培养2种培养条件,探究Sf-9细胞的最佳培养方式;利用血球计数板每隔24 h进行细胞计数,绘制Sf-9细胞生长曲线;将P... 为确定嵌合口蹄疫病毒(FMDV)中和表位的猪细小病毒(PPV)衣壳蛋白在昆虫细胞(Sf-9)中的最佳表达条件。通过对比悬浮培养和贴壁培养2种培养条件,探究Sf-9细胞的最佳培养方式;利用血球计数板每隔24 h进行细胞计数,绘制Sf-9细胞生长曲线;将P1代重组病毒传代至P3代,提取重组病毒基因组DNA,进行PCR鉴定,检测插入目的基因的完整性;通过研究感染复数(MOI)和感染时间的关系来摸索重组病毒最佳感染条件,以获得高滴度的重组病毒;利用Western blot检测目的蛋白的表达量并探究重组蛋白的最佳表达条件。结果表明,悬浮培养的Sf-9细胞大小均一、边缘整齐,生长状态良好;PCR鉴定结果表明,插入的FMDV中和表位基因完整,可以进行重组蛋白的表达;Western blot结果显示,重组蛋白同时与FMDV阳性血清和PPV阳性血清产生特异性反应,进一步证明了插入的FMDV中和表位的存在;重组蛋白最佳表达条件是以10个MOI病毒液感染悬浮Sf-9细胞,在72 h时重组蛋白表达量最大。 展开更多

关键词 口蹄疫病毒 猪细小病毒 中和表位 杆状病毒载体表达系统 昆虫细胞

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杆状病毒介导的哺乳动物细胞基因转移及其影响因素 被引量：1

15

作者 李梅 王昆 +3 位作者 葛菁萍 高冬妮 楼庄伟 平文祥 《微生物学杂志》 CAS CSCD 2009年第3期81-86,共6页

杆状病毒作为优良的哺乳动物细胞基因转移载体已在基因治疗、疫苗开发、药物筛选以及基因调控研究等方面发挥巨大作用。但杆状病毒对哺乳动物细胞的嗜性不够广泛、转导效率和转基因表达水平偏低,以及表达持续时间短暂等问题制约其进一... 杆状病毒作为优良的哺乳动物细胞基因转移载体已在基因治疗、疫苗开发、药物筛选以及基因调控研究等方面发挥巨大作用。但杆状病毒对哺乳动物细胞的嗜性不够广泛、转导效率和转基因表达水平偏低,以及表达持续时间短暂等问题制约其进一步发展,因此如何突破这个制约的瓶颈成为学者们新的关注焦点。针对以上问题,围绕杆状病毒介导哺乳动物细胞基因转移的各种影响因素进行综述。 展开更多

关键词 杆状病毒表达载体 基因转移 哺乳动物细胞

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小反刍兽疫病毒N基因在昆虫细胞中的表达 被引量：6

16

作者 龙云凤 祝贺 +6 位作者 杨建明 陈朝银 徐维佳 周晓黎 董俊 叶玲玲 艾军 《动物医学进展》 CSCD 北大核心 2011年第12期1-5,共5页

为了研发小反刍兽疫病毒ELISA检测试剂盒中替代全病毒的抗原物质,参照GenBank公布的小反刍兽疫疫苗株Nigeria75/1的全基因组序列(GenBank登录号:X74443),人工合成表达核蛋白的N基因开放阅读框序列,通过PCR扩增、经引物设计引入的EcoRⅠ... 为了研发小反刍兽疫病毒ELISA检测试剂盒中替代全病毒的抗原物质,参照GenBank公布的小反刍兽疫疫苗株Nigeria75/1的全基因组序列(GenBank登录号:X74443),人工合成表达核蛋白的N基因开放阅读框序列,通过PCR扩增、经引物设计引入的EcoRⅠ和KpnⅠ特异性酶切位点,将N基因克隆于昆虫杆状病毒表达载体pFastBacHTA,阳性重组质粒命名为pFastBacHTA-PPRV-N,测序结果显示N基因片段长度为1 578bp。将该重组质粒转化含有杆状病毒穿梭载体的DH10Bac感受态细胞,得到重组穿梭质粒Bacmid-PPRV-N,将该重组穿梭质粒在脂质体介导下转染昆虫细胞Sf9,获得重组杆状病毒。通过SDS-PAGE和Western blot分析表明该蛋白得到表达产物,具有与抗体反应的活性,大小约为61.3ku。 展开更多

关键词 小反刍兽疫病毒 N基因 杆状病毒表达载体 昆虫细胞 表达

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猪瘟病毒E_2(gp55)基因在昆虫细胞中的表达 被引量：3

17

作者 季新成 陈杰 +5 位作者 张彦明 吴发兴 黄宝续 李晓成 张燕霞 许信刚 《中国预防兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2004年第4期256-258,共3页

将除去 3’端跨膜区的猪瘟病毒E2 基因亚克隆到杆状病毒转移载体pFastBacHTb ,获得重组质粒pFBHT_E2 ,转化进含穿梭载体Bacmid的感受态细胞DH10Bac ,发生转座作用 ,经抗性及蓝白斑筛选得到含E2 基因的重组载体质粒rBacmid_E2 ,以脂质体... 将除去 3’端跨膜区的猪瘟病毒E2 基因亚克隆到杆状病毒转移载体pFastBacHTb ,获得重组质粒pFBHT_E2 ,转化进含穿梭载体Bacmid的感受态细胞DH10Bac ,发生转座作用 ,经抗性及蓝白斑筛选得到含E2 基因的重组载体质粒rBacmid_E2 ,以脂质体介导的方法将此重组载体质粒转染sf9昆虫细胞 ,获得重组病毒 ,命名为rvBac_E2 。经SDS_PAGE和Western_blot及ELISA等方法检测 ,结果表明 ,此E2 基因在昆虫细胞中正确表达 ,表达的蛋白能与猪瘟阳性血清发生特异性反应。 展开更多

关键词 猪瘟病毒 E2基因 杆状病毒表达载体 表达

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猴B病毒gB基因在昆虫细胞中的表达 被引量：2

18

作者 段博芳 王琼 +7 位作者 段纲 毛永杨 叶玲玲 杨建明 徐维加 董俊 周晓黎 艾军 《中国人兽共患病学报》 CAS CSCD 北大核心 2012年第7期674-678,共5页

目的研发猴B病毒ELISA检测试剂盒中替代全病毒的抗原。方法根据已报道的猴B病毒E2490株gB蛋白基因序列(GenBank登录号:AF533768)人工合成gB基因,通过XbaⅠ和EcoRⅠ特异性酶切,将gB基因克隆于昆虫杆状病毒表达载体pFastBacHTA,经PCR、酶... 目的研发猴B病毒ELISA检测试剂盒中替代全病毒的抗原。方法根据已报道的猴B病毒E2490株gB蛋白基因序列(GenBank登录号:AF533768)人工合成gB基因,通过XbaⅠ和EcoRⅠ特异性酶切,将gB基因克隆于昆虫杆状病毒表达载体pFastBacHTA,经PCR、酶切、测序鉴定后,成功构建了携带gB基因的重组质粒pFastBac-HTa-gB。结果该重组质粒转化含有杆状病毒穿梭载体的DH10BAC感受态细胞,经抗生素、PCR筛选,获得转座的杆粒bacmid-gB。在脂质体介导下转染sf9昆虫细胞,细胞变大变圆细胞核扩大,收获重组杆状病毒,再感染细胞,收获目的蛋白。通过SDS-PAGE和Western blot分析及间接免疫荧光检测,结果表明该蛋白得到表达,且具有良好的生物活性,大小约为98kDa。实验结果表明已成功构建了携带目的基因的重组质粒pFastBac-HTa-gB和转座的杆粒bacmid-gB,转染后在sf9昆虫细胞上得到表达。结论研究结果为下一步以表达的gB蛋白为诊断抗原,替代现阶段以病毒作为抗原的猴B病毒ELISA检测试剂盒的研制奠定了基础。 展开更多

关键词 猴B病毒 GB基因 杆状病毒表达载体 昆虫细胞

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施马伦贝格病毒核衣壳蛋白的表达及单克隆抗体制备 被引量：1

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作者 张永宁 宋姗姗 +1 位作者 吴绍强 林祥梅 《畜牧兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2016年第6期1280-1286,共7页

为表达与纯化具有天然构象的施马伦贝格病毒(Schmallenberg virus,SBV)核衣壳(N)蛋白,并制备其单抗(McAb),本研究在SBV-N基因的N端加入6个组氨酸(6×His)标签后,将其克隆至杆状病毒表达载体pFastBac^(TM)1中,构建重组供体质粒pFastB... 为表达与纯化具有天然构象的施马伦贝格病毒(Schmallenberg virus,SBV)核衣壳(N)蛋白,并制备其单抗(McAb),本研究在SBV-N基因的N端加入6个组氨酸(6×His)标签后,将其克隆至杆状病毒表达载体pFastBac^(TM)1中,构建重组供体质粒pFastBac-His-SBV-N。将pFastBac-His-SBV-N转化DH10Bac E.coli,通过蓝白斑筛选获得重组杆粒rBacmid-His-SBV-N。将rBacmid-His-SBV-N转染Sf9昆虫细胞制备表达His-SBV-N融合蛋白的重组杆状病毒,借助Ni-NTA琼脂糖纯化重组杆状病毒感染Sf9细胞中的His-SBV-N蛋白。以纯化的HisSBV-N免疫BALB/c小鼠制备McAb,利用ELISA叠加试验检测McAb抗原识别位点的异同,并采用高碘酸钠法对识别不同抗原表位的McAb进行辣根过氧化物酶(HRP)标记。最终获得了4株识别不同抗原表位的McAb(2A11、2E1、4H11和6E12)并进行了HRP标记;亚型鉴定表明,2A11为IgG1亚型,2E1、4H11和6E12均为IgG2b亚型;间接免疫荧光试验证实,4株McAb均能够识别稳定表达SBV-N蛋白的BHK-21细胞系;Western blot进一步表明,HRP标记的4株McAb均与His-SBV-N蛋白发生特异性反应。His-SBV-N融合蛋白及其McAb的成功制备,为施马伦贝格病血清学检测方法的建立提供了良好的生物材料。 展开更多

关键词 施马伦贝格病毒 核衣壳蛋白 杆状病毒表达载体 昆虫细胞 单克隆抗体

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人类疱疹病毒8型肿瘤转化基因K12的分离及在昆虫细胞中的表达 被引量：3

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作者 卢春 朱建中 《南京医科大学学报（自然科学版）》 CAS CSCD 北大核心 2003年第5期425-428,F002,共5页

目的:分离人类疱疹病毒8型(HHV-8)肿瘤转化基因 K12,克隆至杆状病毒载体并在昆虫细胞中作尝试性表达。方法:设计一对引物,在引物的5′端分别引入BamHI、EcoRI酶切位点,以佛波脂刺激的原发性渗出性淋巴瘤(PEL)细胞系BCBL-1细胞总DNA为模... 目的:分离人类疱疹病毒8型(HHV-8)肿瘤转化基因 K12,克隆至杆状病毒载体并在昆虫细胞中作尝试性表达。方法:设计一对引物,在引物的5′端分别引入BamHI、EcoRI酶切位点,以佛波脂刺激的原发性渗出性淋巴瘤(PEL)细胞系BCBL-1细胞总DNA为模板,PCR扩增HHV-8肿瘤转化基因K12。将经序列测定后的PCR产物克隆进杆状病毒转移载体pVL1393中,构建成重K12杆状病毒转移载体pVL-K12,并与线性BaculoGold病毒 DNA共转染昆虫细胞Sf9,获得重组病毒。RT-PCR检测K12 mRNA转录水平;间接免疫荧光染色(IFA)检测K12编码蛋白在Sf9细胞中的表达状况。结果:含 HHV-8 K12基因重组杆状病毒在昆虫细胞Sf9中获得表达,经IFA证实该重组蛋白为HHV-8特异性蛋白。结论:杆状病毒载体能够介导HHV-8肿瘤转化基因K12编码的蛋白在昆虫细胞中表达。 展开更多

关键词 人类疱疹病毒8型 肿瘤转化基因K12 杆状病毒表达载体 分离 昆虫细胞

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