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鸭IFN-α昆虫杆状病毒表达系统的建立及其抗新型鸭呼肠孤病毒活性研究
1
作者 孔雨心 柳美玲 +4 位作者 于鲁娜 鹿益豪 张兆鹏 傅绩 李宁 《中国动物检疫》 2025年第3期119-126,共8页
为利用昆虫杆状病毒表达系统表达鸭干扰素α(inteferon-α,IFN-α),并研究其对新型鸭呼肠孤病毒(novel duck reovirus,NDRV)的抗病毒活性,针对鸭IFN-α序列构建重组质粒PFastBac-DuIFN-α,转化DH10Bac细胞后提取重组杆粒B acmid-DuIFN-... 为利用昆虫杆状病毒表达系统表达鸭干扰素α(inteferon-α,IFN-α),并研究其对新型鸭呼肠孤病毒(novel duck reovirus,NDRV)的抗病毒活性,针对鸭IFN-α序列构建重组质粒PFastBac-DuIFN-α,转化DH10Bac细胞后提取重组杆粒B acmid-DuIFN-α,然后将其转染Sf9昆虫细胞并收集上清,盲传3代后收集病变细胞,经超声纯化获得重组鸭IFN-α蛋白。Western blot鉴定结果显示,鸭IFN-α在细胞质中表达,大小约为23 kDa。经测定,重组鸭IFN-α蛋白效价为2.14×10^(5)U/mL,以其处理鸭胚成纤维细胞(DEF)后,可极显著刺激蛋白激酶R(protein kinase R,PKR)、抗黏病毒蛋白(myxovirus resistant,Mx)和寡腺苷酸合成酶(oligadenylate syntase,OAS)编码基因的表达(P<0.01)。进一步将鸭IFN-α蛋白接种5日龄樱桃谷鸭(2.14×10^(3) U/mL,0.2mL/只),2 d后再进行NDRV攻毒试验(1000 TCID_(50)/0.1 mL,0.2 mL/只),同时设置阴性对照组和仅NDRV攻毒组。组织病理学检测显示,仅肌注NDRV的攻毒组雏鸭脾出现大量淋巴细胞崩解坏死,数量减少;而先肌注鸭IFN-α蛋白后攻毒NDRV的试验组雏鸭病变较轻,仅有少量淋巴细胞坏死。实时荧光定量PCR(quantitative real-time PCR,qPCR)检测发现,试验组雏鸭的排毒量极显著低于攻毒组(P<0.01),且其肝和脾中NDRV载量也极显著低于攻毒组(P<0.01),同时试验组Mx和OAS表达量极显著升高(P<0.01)。结果表明,本研究通过昆虫杆状病毒系统成功表达出了重组鸭IFN-α蛋白,其具有较好的抗NDRV活性。本研究为进一步探索鸭IFN-α对NDRV感染等鸭病毒性疾病的防治机制提供了技术支持。 展开更多
关键词 干扰素Α 鸭 昆虫杆状病毒表达系统 新型鸭呼肠孤病毒 抗病毒活性
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杆状病毒表达系统表达BCoV纤突蛋白及其对小鼠的免疫原性 被引量：4
2
作者 喻琦胜 朱庆 +6 位作者 周群 宋鑫 张家祺 陈涛云 徐林 张朝辉 张斌 《畜牧兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2024年第2期640-648,共9页
旨在为表达牛冠状病毒(bovine coronavirus,BCoV)的纤突蛋白(S蛋白),并评价其作为免疫原免疫小鼠后的免疫效果。本研究以BCoV/SWUN/HXD-4/2021株的全长S基因为模板,针对昆虫细胞进行密码子优化和合成,构建重组质粒pFastBac-Dual-S,与DH1... 旨在为表达牛冠状病毒(bovine coronavirus,BCoV)的纤突蛋白(S蛋白),并评价其作为免疫原免疫小鼠后的免疫效果。本研究以BCoV/SWUN/HXD-4/2021株的全长S基因为模板,针对昆虫细胞进行密码子优化和合成,构建重组质粒pFastBac-Dual-S,与DH10Bac同源重组后转染昆虫细胞收获重组杆状病毒rpFastBac-S,利用基因组PCR、免疫印迹法(Western blot)和间接免疫荧光试验对其进行鉴定,测定杆状病毒滴度。优化和筛选感染剂量对蛋白表达的影响,超速离心纯化蛋白,免疫小鼠和评估其免疫效果。结果显示:优化后全长4108 bp的BCoV S基因CAI(密码子适应指数)从0.39调整为0.87,平均GC含量从35.8%调整为50.6%。经双酶切、PCR验证,重组质粒与重组杆粒均构建成功。用5μg重组杆粒Bacmid-S转染Sf9细胞并传代至第四代后细胞病变趋于稳定,感染杆状病毒约20 h后产生典型病变,收获重组杆状病毒进行鉴定。PCR电泳结果显示重组杆粒携带S目的蛋白基因;间接免疫荧光试验显示,试验组观察到特异性绿色荧光;Western blot结果显示重组杆状病毒rpFastBac-S所表达的蛋白为S目的蛋白,目的条带位于250 ku左右,感染剂量MOI=0.5时蛋白表达量最高。将50μg蛋白、20μg CpG免疫增强剂与等体积MF59佐剂充分混合乳化后,肌肉注射免疫小鼠,间接ELISA试验结果显示,小鼠免疫蛋白后产生了IgG特异性抗体,且抗体水平高于佐剂对照组(P<0.001),最高抗体效价达1∶12800;微量中和试验结果显示,小鼠血清中和效价最高达1∶224,试验组中和效价平均值高于灭活病毒组,但统计学差异不显著(P>0.05)。本研究利用杆状病毒表达系统表达了牛冠状病毒S蛋白,并对S蛋白免疫保护效果做了进一步评价,为后续牛冠状病毒疫苗研究提供了理论依据。 展开更多
关键词 牛冠状病毒 S蛋白 杆状病毒表达系统 免疫原性
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融合蛋白E^(MP)-VP2在杆状病毒表达系统中的表达与免疫原性鉴定
3
作者 张欣雅 杨扬 +7 位作者 田羽彤 李宗杰 李蓓蓓 刘珂 邵东华 邱亚峰 魏建超 马志永 《中国动物传染病学报》 北大核心 2024年第6期25-35,共11页
日本脑炎病毒(JEV)和猪细小病毒(PPV)是引起猪繁殖障碍的2种重要病原体,严重影响养猪业经济效益。本研究将日本脑炎病毒E基因上的多个B细胞及T细胞抗原表位与猪细小病毒VP2基因进行融合表达,构建pFastBac Dual-E^(MP)-VP2载体,转化到DH1... 日本脑炎病毒(JEV)和猪细小病毒(PPV)是引起猪繁殖障碍的2种重要病原体,严重影响养猪业经济效益。本研究将日本脑炎病毒E基因上的多个B细胞及T细胞抗原表位与猪细小病毒VP2基因进行融合表达,构建pFastBac Dual-E^(MP)-VP2载体,转化到DH10Bac感受态细胞后,通过蓝白斑筛选成功构建了rBacmid E^(MP)-VP2重组杆粒,并在昆虫细胞Sf9中成功拯救了重组杆状病毒,实现了E^(MP)-VP2高效表达。SDS-PAGE和Western blot分析表明,表达产物分子量与预期相符,且可以和JEV及PPV阳性血清反应,表明重组E^(MP)-VP2蛋白具有良好的免疫反应性。表达的蛋白可以通过亲和层析成功纯化,用纯化后的E^(MP)-VP2蛋白免疫小鼠和豚鼠,可以分别激活小鼠和豚鼠JEV和PPV特异性体液免疫反应,证明E^(MP)-VP2蛋白具有免疫原性,为后续JEV和PPV的防控以及二联亚单位疫苗的研发奠定了基础。 展开更多
关键词 日本脑炎病毒 猪细小病毒 杆状病毒表达系统 免疫反应性 免疫原性
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鳜弹状病毒糖蛋白在杆状病毒表达系统中的表达与鉴定
4
作者 张彦冰 叶加鑫 +2 位作者 孙威 刘晓丹 林强 《水产科学》 CAS CSCD 北大核心 2024年第2期281-288,共8页
近年来,鳜弹状病毒引起的病害频发,该病毒传播快,致病性强,是引起鳜病害的主要病原之一。鳜弹状病毒基因组编码5个结构蛋白,其中糖蛋白G是病毒表面的主要抗原,为实现该抗原蛋白的大量表达,利用分子克隆技术将鳜弹状病毒糖蛋白G片段插入... 近年来,鳜弹状病毒引起的病害频发,该病毒传播快,致病性强,是引起鳜病害的主要病原之一。鳜弹状病毒基因组编码5个结构蛋白,其中糖蛋白G是病毒表面的主要抗原,为实现该抗原蛋白的大量表达,利用分子克隆技术将鳜弹状病毒糖蛋白G片段插入杆状病毒穿梭载体pFastBac1中转化至大肠杆菌DH5α感受态细胞后,筛选阳性克隆获得重组转移载体pFastBac-G,再将其转化至大肠杆菌DH10Bac感受态细胞,经蓝白斑与抗性筛选后获取重组杆粒rBacmid-G,随后利用脂质体转染法将重组杆粒转染Sf9昆虫细胞制备重组杆状病毒。将获取到的P3代重组病毒感染Sf9昆虫细胞进行重组蛋白的SDS-PAGE检测,成功表达后利用镍离子亲和层析柱纯化目的蛋白,随后对重组蛋白进行Western blot鉴定,结果显示在大于50 ku处有一条特异性条带,而对照组无条带,表明制备的抗原能与抗体特异性结合。结果表明,鳜弹状病毒糖蛋白G在杆状病毒表达系统成功表达。本试验结果可为鳜弹状病毒糖蛋白G疫苗的研发和大规模生产提供技术支撑。 展开更多
关键词 鳜弹状病毒 糖蛋白 杆状病毒表达系统 重组杆状病毒
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ENO1蛋白及其相关活性位点缺失突变蛋白在昆虫杆状病毒表达系统中的表达与鉴定
5
作者 代鹏钰 杨蕊 +2 位作者 章婷婷 马昕芸 刘会玲 《中国肿瘤生物治疗杂志》 CAS CSCD 北大核心 2024年第7期669-674,共6页
目的:利用昆虫杆状病毒表达系统(昆虫BEVS)表达糖酵解酶α-烯醇化酶(ENO1)及其3种酶活性位点缺失突变的ENO1蛋白ENO1-M1、ENO1-M2和ENO1-M3,为后续宫颈癌的代谢治疗研究奠定基础。方法:利用分子克隆技术将优化后ENO1序列插入pFastBacTM... 目的:利用昆虫杆状病毒表达系统(昆虫BEVS)表达糖酵解酶α-烯醇化酶(ENO1)及其3种酶活性位点缺失突变的ENO1蛋白ENO1-M1、ENO1-M2和ENO1-M3,为后续宫颈癌的代谢治疗研究奠定基础。方法:利用分子克隆技术将优化后ENO1序列插入pFastBacTM1载体,获得含有目的基因的重组质粒pFastBac-ENO1。分别缺失ENO1发挥糖酵解酶功能的3个活性位点,进行优化后将其插入pFastBacTM1载体,获得3个活性位点缺失的重组质粒pFastBac-M1、pFastBac-M2和pFastBac-M3。通过转座、转染后获得重组杆状病毒rBV-ENO1、rBV-M1、rBV-M2和rBV-M3,利用WB法对目的蛋白的表达及特异性进行检测。结果:成功扩增重组杆粒rBacmid-ENO1、rBacmid-M1、rBacmid-M2和rBacmid-M3,获得大小约2000 bp的基因片段,与预期大小相符。昆虫BEVS可表达ENO1蛋白及其3个酶活位点缺失的重组蛋白ENO1-M1、ENO1-M2和ENO1-M3,其分子量约为52000,与预期相符。WB法鉴定这些蛋白能与特异性标签His-tag发生反应。结论:通过昆虫BEVS成功表达目的蛋白ENO1及其酶活性位点缺失蛋白ENO1-M1、ENO1-M2和ENO1-M3,这些蛋白具有反应原性,为后续测定这些蛋白与ENO1单抗亲和力创造了条件。 展开更多
关键词 α-烯醇化酶 昆虫杆状病毒表达系统 蛋白表达 酶活性位点缺失
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家蚕Polh^+ Bac-to-Bac杆状病毒表达系统的构建 被引量：7
6
作者 曹翠平 兰丽盼 +3 位作者 姚慧鹏 何芳青 郭爱芹 吴小锋 《蚕业科学》 CAS CSCD 北大核心 2008年第2期237-243,共7页
为利用杆状病毒的强启动子——多角体启动子而构建的重组杆状病毒一般是多角体缺失型(polh-)病毒。为了解决家蚕生物反应器规模化生产中病毒必需经皮接种而效率低下的问题,在建立家蚕Bac-to-Bac快速表达系统的基础上,构建了能形成多角... 为利用杆状病毒的强启动子——多角体启动子而构建的重组杆状病毒一般是多角体缺失型(polh-)病毒。为了解决家蚕生物反应器规模化生产中病毒必需经皮接种而效率低下的问题,在建立家蚕Bac-to-Bac快速表达系统的基础上,构建了能形成多角体的家蚕Polh+ Bac-to-Bac表达系统。通过该系统能够产生表达外源目的基因的重组病毒,获得的该重组病毒能在培养细胞内表达,也能通过经口添食感染表达。利用EGFP报告基因分析了该系统的表达效果,构建的重组病毒不仅有效表达了EGFP蛋白,还在细胞核中形成了大量多角体。该系统较好解决了重组病毒必需经皮接种感染的缺陷,提高了生产效率,拓宽了杆状病毒在生物杀虫剂、基因治疗等领域的应用前景。 展开更多
关键词 家蚕 杆状病毒表达系统 多角体 经口感染
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猪繁殖与呼吸综合征病毒ORF5基因的克隆及杆状病毒表达载体的构建 被引量：8
7
作者 赵娜 田宏 +4 位作者 吴锦艳 满自萍 尚佑军 何生虎 刘湘涛 《华北农学报》 CSCD 北大核心 2009年第1期83-86,共4页
根据猪繁殖与呼吸综合症病毒已知序列(ch-1a,AY032626)设计包含完整ORF5序列的1对引物,采用RT-PCR方法扩增PRRSV甘肃LZH株的ORF5基因,将其克隆到杆状病毒载体pFastBacHTA上,经酶切鉴定、PCR鉴定筛选出阳性重组转移载体pFastBacHTA-ORF5... 根据猪繁殖与呼吸综合症病毒已知序列(ch-1a,AY032626)设计包含完整ORF5序列的1对引物,采用RT-PCR方法扩增PRRSV甘肃LZH株的ORF5基因,将其克隆到杆状病毒载体pFastBacHTA上,经酶切鉴定、PCR鉴定筛选出阳性重组转移载体pFastBacHTA-ORF5,并对阳性质粒进行测序及序列分析;将pFastBacHTA-ORF5转化到DH10Bac感受态细胞中,与Bacmid发生位点特异性转座作用,获得重组转座子rBacmid-ORF5;并成功构建了PRRSV LZH株ORF5基因的杆状病毒载体,为基因工程疫苗的研制奠定了基础。 展开更多
关键词 猪繁殖与呼吸综合征病毒 ORF5基因 克隆 杆状病毒表达
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非洲猪瘟病毒p72蛋白杆状病毒表达系统的构建及其抗原性分析 被引量：6
8
作者 侯绍华 柏丽华 +3 位作者 郭晓宇 贾红 姜一曈 朱鸿飞 《中国预防兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2012年第1期33-36,共4页
为研究真核表达非洲猪瘟病毒(ASFV)主要结构蛋白p72,本研究从含ASFV p72基因全序列的重组质粒pGEX-6p-p72中扩增出1 941 bp的p72全长基因,将其插入于pFastBac HTa杆状病毒载体中,构建了重组质粒pFastBac HTa-p72,转化至感受态细胞DH10Ba... 为研究真核表达非洲猪瘟病毒(ASFV)主要结构蛋白p72,本研究从含ASFV p72基因全序列的重组质粒pGEX-6p-p72中扩增出1 941 bp的p72全长基因,将其插入于pFastBac HTa杆状病毒载体中,构建了重组质粒pFastBac HTa-p72,转化至感受态细胞DH10Bac中,获得重组杆粒rBacmid-p72。再将其转染至sf9昆虫细胞,获得重组杆状病毒。Western blot和夹心法ELISA分析表明ASFV p72基因在昆虫细胞sf9中获得了正确表达,重组p72蛋白可以被特异性抗ASFV血清、p72单克隆抗体识别,表明该蛋白特异性强、活性稳定,具有良好的抗原性。为进一步研究p72蛋白的结构、功能和免疫学特性奠定基础。 展开更多
关键词 非洲猪瘟病毒 p72蛋白 杆状病毒表达 抗原性
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兔出血症病毒衣壳蛋白VP60在杆状病毒表达系统中的表达及细胞内定位 被引量：6
9
作者 陈柳 云涛 +3 位作者 刘光清 倪征 余斌 宋毅 《浙江农业学报》 CSCD 北大核心 2010年第2期135-139,共5页
为了探讨兔出血症病毒(RHDV)衣壳蛋白的细胞内定位,利用杆状病毒表达系统构建了表达RHDV结构蛋白(VP60)的重组杆状病毒。间接免疫荧光(IFA)和Western blot检测以及电子显微镜观察结果表明,VP60不仅能在昆虫细胞中正确表达,而且能自组装... 为了探讨兔出血症病毒(RHDV)衣壳蛋白的细胞内定位,利用杆状病毒表达系统构建了表达RHDV结构蛋白(VP60)的重组杆状病毒。间接免疫荧光(IFA)和Western blot检测以及电子显微镜观察结果表明,VP60不仅能在昆虫细胞中正确表达,而且能自组装形成病毒样颗粒(VLPs)。进一步对表达蛋白进行细胞内定位观察发现,表达蛋白定位于Sf9细胞的细胞膜上。 展开更多
关键词 兔出血症病毒 结构蛋白 昆虫—杆状病毒表达系统 细胞内定位
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杆状病毒表达系统在兽用亚单位疫苗领域应用的研究进展 被引量：11
10
作者 刘春菊 任炜杰 王志亮 《中国畜牧兽医》 CAS 北大核心 2013年第9期101-105,共5页
杆状病毒表达系统是以杆状病毒为蛋白质表达载体,昆虫细胞或幼虫为受体的真核表达系统。与原核细胞相比,昆虫细胞可对外源蛋白进行翻译后修饰,如多肽折叠、糖基化、酰基化、磷酸化、二硫键形成及蛋白质水解等。因杆状病毒对畜禽无致病性... 杆状病毒表达系统是以杆状病毒为蛋白质表达载体,昆虫细胞或幼虫为受体的真核表达系统。与原核细胞相比,昆虫细胞可对外源蛋白进行翻译后修饰,如多肽折叠、糖基化、酰基化、磷酸化、二硫键形成及蛋白质水解等。因杆状病毒对畜禽无致病性,这使得杆状病毒表达系统成为一种安全有效的兽用亚单位疫苗生产平台。作者对杆状病毒表达系统在兽用亚单位疫苗领域中的应用作了简要综述。 展开更多
关键词 杆状病毒表达系统 杆状病毒 昆虫细胞 兽用亚单位疫苗 病毒样颗粒 生产加工
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杆状病毒表达系统——有效的VLP构建工具 被引量：11
11
作者 刘拂晓 柳增善 王志亮 《生物技术通报》 CAS CSCD 北大核心 2012年第6期25-31,共7页
杆状病毒表达系统是以杆状病毒为外源基因载体,昆虫细胞或活体昆虫为受体的真核表达系统。相对于其他表达系统,杆状病毒表达系统具有特殊的优势:杆状病毒基因组作为表达载体可以容纳更多外源基因;杆状病毒极晚期启动子能有效调控外源蛋... 杆状病毒表达系统是以杆状病毒为外源基因载体,昆虫细胞或活体昆虫为受体的真核表达系统。相对于其他表达系统,杆状病毒表达系统具有特殊的优势:杆状病毒基因组作为表达载体可以容纳更多外源基因;杆状病毒极晚期启动子能有效调控外源蛋白的表达;昆虫细胞作为受体能够对外源蛋白进行加工修饰;杆状病毒通常只感染节肢动物,不会对人畜构成危害。因此,该系统越来越受到人们的重视,并已应用于亚单位疫苗的研发与生产,特别其对于构建病毒样颗粒,即由一种或多种病毒结构蛋白自行装配而成且不含病毒基因组的蛋白颗粒,具有不可比拟的优势。对此做详细评述并展望病毒样颗粒疫苗的发展趋势。 展开更多
关键词 杆状病毒 昆虫细胞 病毒样颗粒 杆状病毒表达系统 疫苗
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宿主域扩大的重组救活昆虫杆状病毒表达载体的构建及外源基因的表达 被引量：4
12
作者 易咏竹 陈寅 +2 位作者 张志芳 何家禄 秦俭 《蚕业科学》 CAS CSCD 2002年第4期304-307,共4页
通过克隆的家蚕核多角体病毒解旋酶基因DNA与重组救活可线性化的苜蓿尺蠖核多角体病毒基因工程载体病毒 (BacPAK6 )DNA在昆虫细胞中发生重组 ,经累代筛选获得了既可感染家蚕又可感染秋粘虫细胞Sf 2 1的宿主域扩大的昆虫杆状病毒表达载体... 通过克隆的家蚕核多角体病毒解旋酶基因DNA与重组救活可线性化的苜蓿尺蠖核多角体病毒基因工程载体病毒 (BacPAK6 )DNA在昆虫细胞中发生重组 ,经累代筛选获得了既可感染家蚕又可感染秋粘虫细胞Sf 2 1的宿主域扩大的昆虫杆状病毒表达载体 (HyBacPAK6 )。HyBacPAK6DNA经Bsu36Ⅰ酶切后与含植酸酶基因的转移载体pVL1393 phy在家蚕细胞中重组后 ,通过蓝白斑筛选发现重组率可达 90 %以上。然而以杂交病毒为载体的外源基因表达量仅为以BmNPV为载体病毒的表达量的 2 0 %左右。分析认为HyBacPAK6可用于表达一些对蚕体有害的外源基因。 展开更多
关键词 表达载体 宿主域 外源基因表达 家蚕 昆虫杆状病毒表达系统 HyBacPAK6
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J亚群禽白血病Hrb-1分离株env基因克隆及gp85杆状病毒表达载体的构建 被引量：4
13
作者 付朝阳 宋素泉 +6 位作者 高宏雷 王笑梅 郭艳 王英 张厚双 尹训南 童光志 《中国预防兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2004年第2期81-85,共5页
自哈尔滨某送检患病鸡群中分离出一株病毒,经RT＿PCR检测、SPF鸡胚成纤维细胞增殖后,获取其前病毒DNA,采用依据原型毒株HPRS＿103cDNA序列设计并合成的一对引物,PCR扩增病毒的囊膜基因,连接pMD18＿T载体并转化大肠杆菌JM109,培养后提取... 自哈尔滨某送检患病鸡群中分离出一株病毒,经RT＿PCR检测、SPF鸡胚成纤维细胞增殖后,获取其前病毒DNA,采用依据原型毒株HPRS＿103cDNA序列设计并合成的一对引物,PCR扩增病毒的囊膜基因,连接pMD18＿T载体并转化大肠杆菌JM109,培养后提取质粒分别用HindIII,BamHI进行单酶切和双酶切鉴定,得到了阳性重组质粒pMD18＿T＿Hrb＿1/env,对其进行PstI酶切,回收包含J亚群禽白血病病毒株Hrb＿1gp85基因的997bp片段,应用BactoBac杆状病毒表达系统,将外源片段与线性化的杆状病毒载体pFastBacHTA进行连接,获得重组载体pFASTBacHTA/gp85,将该重组载体转化DH10Bac感受态细菌,在体内进行重组,经抗性和蓝白斑筛选,获得了杆状病毒重组载体Bacmid/gp85,为表达gp85并建立适于国内应用的ELISA诊断方法奠定了基础。 展开更多
关键词 J亚群禽白血病病毒gp85基因 克隆 载体构建 杆状病毒表达系统
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利用昆虫-杆状病毒表达系统制备HPV16E6蛋白 被引量：5
14
作者 郑瑾 任斐 +2 位作者 余翔 来宝长 王一理 《西北大学学报（自然科学版）》 CAS CSCD 北大核心 2008年第5期775-778,共4页
目的利用昆虫-杆状病毒表达系统高效表达HPV16E6蛋白。方法将HPV16E6基因克隆入供体质粒pFastBac-HTb,然后再重组入杆状病毒基因组;用带有目的基因的杆状病毒转染昆虫(Sf-9)细胞,27℃培养72 h,收集被转染细胞,SDS-PAGE,Western-blot分... 目的利用昆虫-杆状病毒表达系统高效表达HPV16E6蛋白。方法将HPV16E6基因克隆入供体质粒pFastBac-HTb,然后再重组入杆状病毒基因组;用带有目的基因的杆状病毒转染昆虫(Sf-9)细胞,27℃培养72 h,收集被转染细胞,SDS-PAGE,Western-blot分析鉴定表达蛋白。结果SDS-PAGE分析显示所表达蛋白分子量约为24KD,Western-blot结果表明表达产物为HPV16E6蛋白。结论利用昆虫杆状病毒表达系统获得HPV16E6蛋白的高效表达。 展开更多
关键词 昆虫杆状病毒表达系统 重组DAN技术 HPV16E6
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具有荧光标签的猪瘟病毒E^(rns)蛋白在杆状病毒表达系统中的表达 被引量：4
15
作者 陈柳 余斌 +3 位作者 云涛 倪征 华炯钢 李双茂 《华北农学报》 CSCD 北大核心 2011年第1期26-30,共5页
为了获得具有标记的猪瘟病毒Erns蛋白,通过基因工程操作,使猪瘟病毒Erns基因与绿色荧光蛋白基因(GFP)融合,用Bac-to-Bac杆状病毒表达系统在昆虫细胞中高效表达了ErnsGFP融合蛋白,经Western Blot和荧光显微镜观察证实,表达产物分子量正确... 为了获得具有标记的猪瘟病毒Erns蛋白,通过基因工程操作,使猪瘟病毒Erns基因与绿色荧光蛋白基因(GFP)融合,用Bac-to-Bac杆状病毒表达系统在昆虫细胞中高效表达了ErnsGFP融合蛋白,经Western Blot和荧光显微镜观察证实,表达产物分子量正确,且发出易于检测的绿色荧光,具有标记的Erns蛋白的获得为进一步研究Erns蛋白结构和功能奠定了基础。 展开更多
关键词 猪瘟病毒 Erns 绿色荧光蛋白 Bac-to-Bac杆状病毒表达系统
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昆虫杆状病毒表达系统研究进展及其应用展望 被引量：17
16
作者 朱江 吴祥甫 《蚕业科学》 CAS CSCD 2003年第2期114-119,共6页
昆虫杆状病毒表达系统作为四大表达系统之一,已广泛应用于重组蛋白的合成。该系统具有如多角体启动子控制下的高效表达,比较完善的转译后加工修饰,容易从无血清培养上清中纯化,无内毒素污染等特点。杆状病毒表达载体系统研究的最新进展... 昆虫杆状病毒表达系统作为四大表达系统之一,已广泛应用于重组蛋白的合成。该系统具有如多角体启动子控制下的高效表达,比较完善的转译后加工修饰,容易从无血清培养上清中纯化,无内毒素污染等特点。杆状病毒表达载体系统研究的最新进展:高强度早期启动子群杆状病毒转移载体的成功合成,以扩大寄主范围和增进重组蛋白稳定性为目的的亲本病毒的改造;通用的昆虫细胞培养基配方的不断优化,特定昆虫细胞株培养基的研制和适用于大规模悬浮培养的无血清培养基的商品化;旨在进行复杂糖基化及提供相对稳定细胞环境的宿主细胞工程;以新标记物(tag)载体和相关亲和层析方法为代表的蛋白质高效纯化方法的进步。昆虫杆状病毒表达载体系统在基础研究、医药卫生和农业上具有广阔的应用前景。 展开更多
关键词 昆虫杆状病毒表达系统 研究进展 应用 改进 蛋白质 昆虫细胞培养 纯化
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O型口蹄疫病毒P1-2A3C基因在家蚕杆状病毒表达系统中的表达 被引量：4
17
作者 张韵 易咏竹 +2 位作者 李志勇 张志芳 柳纪省 《蚕业科学》 CAS CSCD 北大核心 2008年第1期148-153,共6页
口蹄疫是一种严重危害畜牧业生产的烈性传染病。为了促进O型口蹄疫病毒(FMDV)基因工程活载体疫苗的研制,选取O型FMDV编码序列中的衣壳蛋白前体P1-2A基因和蛋白酶3C基因,插入家蚕杆状病毒转移载体pVL1393中,构建重组载体pVL-P1-2A3C,并... 口蹄疫是一种严重危害畜牧业生产的烈性传染病。为了促进O型口蹄疫病毒(FMDV)基因工程活载体疫苗的研制,选取O型FMDV编码序列中的衣壳蛋白前体P1-2A基因和蛋白酶3C基因,插入家蚕杆状病毒转移载体pVL1393中,构建重组载体pVL-P1-2A3C,并与线性化病毒Bm-BacPAK6 DNA共转染家蚕BmN细胞,获得重组病毒Bm-P1-2A3C。将重组病毒感染家蚕5龄幼虫,以双抗体夹心ELISA法和间接血凝方法检测血淋巴中的表达产物:目的蛋白在感染病毒后120 h的蚕血淋巴中表达量最高,抗原表达呈阳性的最大稀释倍数为1∶128。结果显示O型FMDV的P1-2A3C基因已在家蚕体内获得表达。 展开更多
关键词 O型口蹄疫病毒 基因工程疫苗 P1-2A3C基因 家蚕杆状病毒表达系统
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水貂肠炎病毒VP2基因在昆虫杆状病毒表达系统中的表达 被引量：5
18
作者 倪佳 张蕾 +6 位作者 柴秀丽 高晗 张海玲 赵建军 白雪 邵西群 闫喜军 《中国畜牧兽医》 CAS 北大核心 2011年第9期97-100,共4页
利用昆虫杆状病毒表达系统表达水貂肠炎病毒(mink enteritis virus,MEV)VP2基因,表达的蛋白能够形成病毒样粒子,具有反应原性,为研究MEV新型疫苗奠定基础。采用PCR方法扩增MEVVP2基因,将PCR产物连接到pMD18-T载体,目的基因定向克隆到pFa... 利用昆虫杆状病毒表达系统表达水貂肠炎病毒(mink enteritis virus,MEV)VP2基因,表达的蛋白能够形成病毒样粒子,具有反应原性,为研究MEV新型疫苗奠定基础。采用PCR方法扩增MEVVP2基因,将PCR产物连接到pMD18-T载体,目的基因定向克隆到pFast-BacⅠ载体中,构建重组转座载体后转化DH10Bac感受态细胞,获得重组Bacmid质粒后转染Sf9昆虫细胞,传毒3代,对表达蛋白进行Western blotting鉴定。结果成功克隆MEVVP2基因。Western blotting结果证实,表达蛋白能够被MEV单克隆抗体识别。在Bac-To-Bac杆状病毒表达系统中成功的表达了MEV VP2蛋白,目的蛋白具有较好的反应原性。 展开更多
关键词 水貂肠炎病毒 VP2基因 病毒样粒子 杆状病毒表达系统
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昆虫杆状病毒表达系统中重组蛋白质的降解及其对策 被引量：7
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作者 吴小锋 曹翠平 鲁兴萌 《蚕业科学》 CAS CSCD 北大核心 2005年第4期382-388,共7页
昆虫杆状病毒基因表达系统是目前比较高效的真核表达系统之一,但重组蛋白质的降解成为影响该系统生产效率的一个重要问题。就该系统中蛋白质降解的相关问题及其对应策略进行了探讨。
关键词 杆状病毒表达系统 重组蛋白质降解 蛋白酶抑制剂
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HSV-2糖蛋白D在昆虫-杆状病毒表达系统中的表达及免疫原性分析 被引量：2
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作者 刘微 罗晓华 +7 位作者 陈文婧 董媛 朱洁 郭健 姜勇 张磊 孟桂先 王会岩 《吉林大学学报（医学版）》 CAS CSCD 北大核心 2017年第4期720-724,共5页
目的:在昆虫细胞中表达2型单纯疱疹病毒(HSV-2)糖蛋白D(gD2)胞外区基因,检测其免疫原性。方法:以HSV-2病毒基因组为模板,PCR扩增得到gD2片段,构建至杆状病毒质粒Bacmind中,转染sf9细胞,包装重组杆状病毒,收集后连续感染sf9细胞,收获第4... 目的:在昆虫细胞中表达2型单纯疱疹病毒(HSV-2)糖蛋白D(gD2)胞外区基因,检测其免疫原性。方法:以HSV-2病毒基因组为模板,PCR扩增得到gD2片段,构建至杆状病毒质粒Bacmind中,转染sf9细胞,包装重组杆状病毒,收集后连续感染sf9细胞,收获第4代重组杆状病毒(P4),通过Western blotting法鉴定蛋白表达情况,采用空斑实验检测重组病毒滴度,将P4代重组病毒作为种子大量感染sf9细胞,上清经镍柱亲和层析进行纯化,将纯化后的蛋白在第0、2和4周免疫BALB/c小鼠(gD2组),以PBS作为阴性对照(PBS组),ELISA检测小鼠血清中gD2特异性IgG滴度。结果:PCR鉴定和DNA测序,重组表达质粒gD2-Bacmind构建正确,空斑实验检测重组病毒滴度为2.0×109 pfu·mL-1,纯化的gD2重组蛋白在相对分子质量37 000处出现目标条带,纯度达90%以上。第6周gD2组小鼠免疫血清中gD2特异性IgG抗体滴度Log10平均值达到4.34,与PBS组比较差异有统计学意义(P<0.01)。结论:利用昆虫-杆状病毒表达系统表达的gD2胞外区蛋白具有良好的免疫原性,可作为HSV-2疫苗的候选。 展开更多
关键词 生殖器疱疹 疱疹病毒2型 人 糖蛋白D 昆虫-杆状病毒表达系统
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