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人杀菌渗透增强性蛋白N末端片段在大肠杆菌中的表达 被引量:2
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作者 董伟 董晓慧 +3 位作者 楚雍烈 杨娥 胡刚 郑建武 《西安交通大学学报(医学版)》 CAS CSCD 北大核心 2006年第1期11-14,共4页
目的构建表达人杀菌渗透增强性蛋白(BPI)N-端193个氨基酸的重组表达质粒,诱导表达BPI193重组蛋白。方法应用RT-PCR的方法从HL-60细胞内扩增出BPI氨基端1-193个氨基酸的基因序列,克隆入T载体。将BPI193基因片段定向克隆入原核表达载体PET... 目的构建表达人杀菌渗透增强性蛋白(BPI)N-端193个氨基酸的重组表达质粒,诱导表达BPI193重组蛋白。方法应用RT-PCR的方法从HL-60细胞内扩增出BPI氨基端1-193个氨基酸的基因序列,克隆入T载体。将BPI193基因片段定向克隆入原核表达载体PET-28a中,构建重组的原核表达质粒PET-BPI193,转化大肠杆菌BL21菌株,用IPTG诱导表达蛋白。应用SDS-PAGE检测蛋白表达情况,计算机薄层扫描分析蛋白占菌体总蛋白百分比;Western-blot技术检测表达蛋白的特异性。结果从HL-60细胞中扩增得到579bp的BPI193基因片段,构建了T-BPI193亚克隆和PET-BPI193重组表达质粒。转化大肠杆菌BL21,通过IPTG诱导,经SDS-PAGE检测表明,成功表达了6His-BPI193融合蛋白。计算机薄层扫描分析表达量占菌体总蛋白的12%。Western-blot检测显示表达产物具有特异性。结论成功构建了PET-BPI193重组表达质粒。在大肠杆菌BL21内,诱导获得了BPI193与组氨酸融合表达的重组蛋白。 展开更多
关键词 杀菌/渗透增强性蛋白 基因表达 大肠杆菌
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杀菌/渗透性增强蛋白功能及应用前景 被引量:4
2
作者 颜金鹏 王丽 +2 位作者 李善妮 邓丽明 韩旭 《中国生物化学与分子生物学报》 CAS CSCD 北大核心 2011年第7期622-631,共10页
杀菌/通透性增强蛋白(BPI)是存在于中性粒细胞中的阳离子蛋白,约为55 kD.BPI能与革兰氏阴性菌外膜上的脂多糖结合,增加外膜对抗菌药的通透性,具有特异性杀灭革兰氏阴性菌及结合/中和内毒素的生物学功能,在革兰氏阴性菌感染的治疗方面有... 杀菌/通透性增强蛋白(BPI)是存在于中性粒细胞中的阳离子蛋白,约为55 kD.BPI能与革兰氏阴性菌外膜上的脂多糖结合,增加外膜对抗菌药的通透性,具有特异性杀灭革兰氏阴性菌及结合/中和内毒素的生物学功能,在革兰氏阴性菌感染的治疗方面有良好的发展前景.近年来,国内外对BPI研究颇多,并逐渐发现BPI还具有调理作用、抗真菌、抗原虫和抑制血管生成等许多功能,被学者称为未来的"超级抗生素".本文主要就BPI的结构、分布、生理功能、作用机理及临床研究方面的研究进展作一综述. 展开更多
关键词 杀菌/渗透增强蛋白(BPI) 中性粒细胞 革兰氏阴性菌 内毒素
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杀菌/渗透增强蛋白功能区抗菌肽与内毒素亲和性的SPR技术检测 被引量:1
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作者 李晶琴 孔庆利 樊峥 《细胞与分子免疫学杂志》 CAS CSCD 北大核心 2010年第11期1143-1145,共3页
目的:研究杀菌/渗透增强蛋白(BPI)不同功能区抗菌肽与内毒素(LPS)结合的能力。方法:设计、合成来自杀菌/渗透增强蛋白N端不同功能区的3段抗菌肽,分别为BPI22-36、BPI85-99和BPI147-161,将其固定于CM5蛋白质芯片上,使用表面等离子共振(S... 目的:研究杀菌/渗透增强蛋白(BPI)不同功能区抗菌肽与内毒素(LPS)结合的能力。方法:设计、合成来自杀菌/渗透增强蛋白N端不同功能区的3段抗菌肽,分别为BPI22-36、BPI85-99和BPI147-161,将其固定于CM5蛋白质芯片上,使用表面等离子共振(SPR)仪检测3种抗菌肽与LPS和类脂A(Lipid A)相互作用的情况。结果:3种抗菌肽中,BPI147-161与LPS和Lipid A结合的能力最强,BPI85-99次之,但BPI22-36与其不结合;BPI147-161与Lipid A的亲和常数KA为1.12×106L/mol,相比,多黏菌素B(PMB)的亲和常数KA为5.58×106L/mol。结论:来自杀菌/渗透增强蛋白的抗菌肽BPI147-161能有效地中和内毒素,这可能为败血症休克的治疗提供一种新的策略。 展开更多
关键词 杀菌/渗透增强蛋白 内毒素 (类)脂质A 相互作用 表面等离子共振技术
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人杀菌/渗透增强蛋白N端功能片段基因突变文库的构建和鉴定
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作者 李晶琴 孔庆利 安云庆 《首都医科大学学报》 CAS 北大核心 2017年第6期903-910,共8页
目的为提高杀菌/渗透性增强蛋白N端功能片段BPI_(23)对内毒素(lipopolysaccharides,LPS)的亲和性,通过易错聚合酶链式反应(polymerase chain reaction,PCR)和DNA改组技术,对其编码序列BPI_(600)进行突变,在大肠杆菌XL10-Gold中构建BPI_(... 目的为提高杀菌/渗透性增强蛋白N端功能片段BPI_(23)对内毒素(lipopolysaccharides,LPS)的亲和性,通过易错聚合酶链式反应(polymerase chain reaction,PCR)和DNA改组技术,对其编码序列BPI_(600)进行突变,在大肠杆菌XL10-Gold中构建BPI_(600)基因突变体库。方法通过控制Mg2+和Mn2+的浓度进行易错PCR,获得BPI_(600)随机突变基因片段,经测序和基因比对,确定BPI_(600)的随机突变率。再对易错PCR产物进行DNA改组,将改组产物克隆至pYD1载体中,转化大肠杆菌XL10-Gold,从Amp抗性(LuriaBertani,LB)固体培养平板上任选10个单菌落,增菌后提取质粒,得到pYD1-shuffled BPI_(600)重组质粒,将质粒进行HindⅢ/XhoⅠ酶切鉴定,取5个阳性质粒进行DNA测序,通过基因和氨基酸比对鉴定突变情况。结果测序和基因比对显示,BPI_(600)经易错PCR所获突变文库的随机突变率达2.3%;改组后重组质粒的酶切结果表明,在随机选择的10个菌落所提质粒中,有6个含BPI_(600),表明构建了重组质粒pYD1-shuffled BPI_(600);在5个阳性质粒中,有4个重组质粒的BPI_(23)编码序列分别发生了6、9、11和14个碱基突变;1个不仅有10个碱基突变,还存在1个碱基的缺失。氨基酸比对表明,有2个质粒(分别有6和14个碱基突变)具有正确的读码框,能够翻译完整的蛋白质,各有4或14个氨基酸突变。3个质粒因含终止密码子而不能表达完整目的蛋白。结论成功构建pYD1-shuffled BPI_(600)重组质粒,获得库容量为2×105的突变文库,为高内毒素亲和力突变体的筛选奠定了基础。 展开更多
关键词 杀菌 渗透增强蛋白 定向进化 易错PCR DNA改组
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杀菌/渗透增强蛋白在小鼠组织器官和细胞中的分布 被引量:2
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作者 郭玲 许晴 +5 位作者 吕喆 刘振龙 范宜强 王炜 孔庆利 安云庆 《首都医科大学学报》 CAS 北大核心 2009年第5期671-676,共6页
目的探讨生理状态和脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)刺激下,杀菌渗透增强蛋白(murine bactericidal/permeability-increasing protein,muBPI)在小鼠组织器官和细胞中的表达情况。方法①实验小鼠分为3组,即LPS未刺激组、LPS刺激组和阴性... 目的探讨生理状态和脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)刺激下,杀菌渗透增强蛋白(murine bactericidal/permeability-increasing protein,muBPI)在小鼠组织器官和细胞中的表达情况。方法①实验小鼠分为3组,即LPS未刺激组、LPS刺激组和阴性对照组;②制备小鼠心、肝、脾、肺、肾、胸腺、睾丸、小肠组织切片和骨髓细胞、腹腔灌洗细胞、骨髓源树突状细胞涂片;③采用免疫组化方法检测muBPI在上述组织器官和细胞中的表达。结果①LPS未刺激组小鼠睾丸、小肠、肾脏组织切片和骨髓细胞、腹腔灌洗细胞、骨髓源树突状细胞涂片均呈黄色着染;LPS刺激后上述组织切片和细胞涂片呈棕黄或深棕色着染;阴性对照组呈现非特异微弱黄色背景着染;②LPS未刺激组小鼠肺、肝组织切片呈微弱黄色背景着染;LPS刺激后上述组织切片呈棕黄色着染;阴性对照呈微弱黄色背景着染;③其余器官组织切片在LPS刺激或未刺激组均呈现与阴性对照组相同的非特异微弱黄色背景着染。结论①生理状态下,小鼠睾丸、小肠、肾脏、骨髓细胞、腹腔灌洗细胞和骨髓源树突状细胞可组成性表达BPI蛋白,LPS刺激后BPI蛋白表达量显著增高;②生理状态下,小鼠肺、肝组织不表达BPI蛋白,LPS可诱导上述组织表达BPI蛋白;③其余组织器官在生理状态下和LPS刺激后均不表达BPI蛋白。 展开更多
关键词 脂多糖 杀菌/渗透增强蛋白 小鼠BPI抗血清 免疫组化
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重组杀菌渗透性增加蛋白21在大鼠内毒素血症中保护机制的探讨
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作者 吴丽娜 刘勇 《中国医科大学学报》 CAS CSCD 北大核心 2008年第1期47-49,共3页
目的探讨重组杀菌渗透性增加蛋白21(rBPI21)在大鼠内毒素血症中保护效应的机制。方法给内毒素血症大鼠注射不同剂量的rBPI21,动态观察rBPI21不同剂量组大鼠血液中内毒素(LPS)、肿瘤坏死因子α(TNF-α)含量的变化。结果rBPI21治疗1组(rBP... 目的探讨重组杀菌渗透性增加蛋白21(rBPI21)在大鼠内毒素血症中保护效应的机制。方法给内毒素血症大鼠注射不同剂量的rBPI21,动态观察rBPI21不同剂量组大鼠血液中内毒素(LPS)、肿瘤坏死因子α(TNF-α)含量的变化。结果rBPI21治疗1组(rBPI21剂量为0.625mg/kg)大鼠,6,12h血浆LPS含量明显低于内毒素组大鼠相同时间点LPS含量(P<0.01),血清TNF-α含量各检测时间点均明显低于内毒素组大鼠相同时间点的含量(P<0.01)。与内毒素组大鼠相比,rBPI21治疗2、3、4组(rBPI21剂量分别为1.25,2.5,5.0mg/kg)大鼠各检测时间点血浆LPS、血清TNF-α含量均明显降低(P<0.01)。结论rBPI21对内毒素血症大鼠的保护作用机制主要是通过促进体内LPS的聚合和清除,降低LPS活性,减少TNF-α等细胞因子的过度表达。 展开更多
关键词 内毒素 重组杀菌渗透性增加蛋白21 肿瘤坏死因子Α
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小鼠BPI N端功能片段(muBPI_(25)蛋白)体外杀菌和中和内毒素作用研究 被引量:2
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作者 吕喆 王炜 +7 位作者 范宜强 刘振龙 孔庆利 温铭杰 龙军 李晨 许晴 安云庆 《中国免疫学杂志》 CAS CSCD 北大核心 2010年第4期294-297,303,共5页
目的:建立胞内杀菌和体外中和内毒素实验模型,检测muBPI25目的蛋白对胞内寄生菌的抑杀作用和对内毒素的中和作用。方法:将pcDNA3.1(+)-muBPI36-259质粒导入RAW264.7细胞,用胞内寄生G+/G-菌感染上述细胞建立muBPI25目的蛋白胞内杀菌实验... 目的:建立胞内杀菌和体外中和内毒素实验模型,检测muBPI25目的蛋白对胞内寄生菌的抑杀作用和对内毒素的中和作用。方法:将pcDNA3.1(+)-muBPI36-259质粒导入RAW264.7细胞,用胞内寄生G+/G-菌感染上述细胞建立muBPI25目的蛋白胞内杀菌实验模型;将pSecTag2B-muBPI36-259与双荧光素酶报告基因质粒共转染RAW264.7细胞,建立体外检测muBPI25蛋白中和内毒素实验模型。结果:胞内杀菌实验模型证实muBPI25目的蛋白对G-伤寒杆菌具有抑杀作用;中和内毒素实验模型证实muBPI25目的蛋白对内毒素具有中和作用。结论:首次证实小鼠BPI N端功能片段,即muBPI25目的蛋白对G-菌具有抑杀作用,对其裂解产物内毒素具有中和作用。 展开更多
关键词 杀菌/渗透增强蛋白 RAW264.7细胞 胞内寄生菌 内毒素
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BPI_(m23)重组抗菌蛋白在巴斯德毕赤酵母中的分泌表达 被引量:3
8
作者 靖学芳 安云庆 杨贵贞 《中国免疫学杂志》 CAS CSCD 北大核心 2004年第6期374-378,共5页
目的 :采用巴斯德毕赤酵母表达系统表达分泌型功能性rBPIm2 3抗菌蛋白。方法 :利用构建的pUC1 8 synBPI4 1 4质粒和PBV2 2 0 BPIm4 2 0 质粒 ,按分子克隆方法构建pPICZα synBPIm6 0 0 重组表达载体 ;用线性化pPICZα synBPIm6 0 0 质... 目的 :采用巴斯德毕赤酵母表达系统表达分泌型功能性rBPIm2 3抗菌蛋白。方法 :利用构建的pUC1 8 synBPI4 1 4质粒和PBV2 2 0 BPIm4 2 0 质粒 ,按分子克隆方法构建pPICZα synBPIm6 0 0 重组表达载体 ;用线性化pPICZα synBPIm6 0 0 质粒电转化PichiapastorisGS1 1 5 ,筛选抗性转化子 ,进行PCR和Mut表型鉴定 ;用甲醇诱导目的蛋白rBPIm2 3的表达 ;用离子交换层析纯化rBPIm2 3,并进行SDS PAGE分析、Westernblot鉴定和用BCA法定量。结果 :①成功构建了pPICZα synBPIm6 0 0 重组表达载体 ;②获得稳定整合目的基因的GS1 1 5菌株 ;③表达产物相对分子量约为 2 3kD ,可与抗BPI抗体特异性结合 ;④培养上清液中目的蛋白表达量约为 2 9mg L。结论 :BPIm2 3重组抗菌蛋白在毕赤酵母GS1 1 5中得到分泌表达。 展开更多
关键词 杀菌/渗透增强蛋白 BPIm23重组抗菌蛋白 巴斯德毕赤酵母 分泌表达
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小鼠BPI N端功能基因片段的克隆及其表达产物的胞内杀菌作用 被引量:2
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作者 李丽 冯颖 +6 位作者 吕喆 庆利 刘振龙 赵冬 高燕 王炜 安云庆 《中国免疫学杂志》 CAS CSCD 北大核心 2008年第6期500-503,508,共5页
目的:克隆小鼠BPI36-259基因片段,转染细胞获得具有杀菌作用的目的抗菌蛋白。方法:采用生物信息学方法,构建PUC57-muBPI1-281质粒;PCR扩增获得muBPI36-259基因片段,制备pcDNA3.1(+)-muBPI36-259重组质粒;采用电穿孔法将上述重组质粒转染... 目的:克隆小鼠BPI36-259基因片段,转染细胞获得具有杀菌作用的目的抗菌蛋白。方法:采用生物信息学方法,构建PUC57-muBPI1-281质粒;PCR扩增获得muBPI36-259基因片段,制备pcDNA3.1(+)-muBPI36-259重组质粒;采用电穿孔法将上述重组质粒转染RAW264.7细胞,Western blot法检测目的蛋白在胞内的表达;建立胞内杀菌实验模型,检测muBPI36-259目的蛋白对胞内寄生菌(伤寒杆菌)的杀伤作用。结果:muBPI36-259目的蛋白在RAW264.7细胞内成功表达,对胞内寄生菌-G-伤寒杆菌具有杀伤作用。结论:成功克隆了小鼠BPI36-259基因片段,转染RAW264.7细胞获得具有生物学活性目的抗菌蛋白。 展开更多
关键词 杀菌/渗透增强蛋白 RAW264.7细胞 伤寒杆菌
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长柄链格孢AlCyP1基因的克隆及其在渗透胁迫适应中的作用 被引量:2
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作者 罗义勇 祝明亮 +3 位作者 路则宝 毕薇 张克勤 杨金奎 《浙江大学学报(农业与生命科学版)》 CAS CSCD 北大核心 2011年第2期133-141,共9页
为了阐明烟草赤星病(tobaccobrown-spotdisease)病原真菌长柄链格孢(Alternarialongipes)对二甲酰亚胺类杀菌剂抗性的分子机制,以不同抗性水平的长柄链格孢菌株为实验材料,通过基因钓鱼(GeneFishing)技术进行基因差异表达分析... 为了阐明烟草赤星病(tobaccobrown-spotdisease)病原真菌长柄链格孢(Alternarialongipes)对二甲酰亚胺类杀菌剂抗性的分子机制,以不同抗性水平的长柄链格孢菌株为实验材料,通过基因钓鱼(GeneFishing)技术进行基因差异表达分析;并利用基因敲除技术对已克隆到的AlCyP1基因进行功能分析.结果表明:一个亲环蛋白基因AlCyP1的表达量在不同抗性水平的长柄链格孢中存在明显差异;应用DNA步移(DNAwalking)方法克隆得到AlCyP1基因的DNA序列,其开放阅读框中存在2个翻译起始密码子,可以编码产生2种不同长度的多肽,长、短多肽产物分别具有222和188个氨基酸,其中短多肽起始于长多肽的第35个密码子;另外,氨基酸序列同源性分析发现,AlCyP1和其他真菌的亲环蛋白具有很高的同源性,达50.0%~61.3%;利用基因敲除技术对AlCyP1基因进行功能分析发现,该基因通过表达水平的改变参与了长柄链格孢对渗透胁迫的适应调节过程. 展开更多
关键词 长柄链格孢 基因差异表达 亲环蛋白AlCyP1 渗透胁迫 二甲酰亚胺类杀菌
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鉴别诊断临床急性肺炎病原体感染的血清标志物研究 被引量:12
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作者 刘萌 窦云鹏 +5 位作者 谷丽 吕喆 王一民 刘颖梅 安云庆 曹彬 《首都医科大学学报》 CAS 北大核心 2016年第5期636-640,共5页
目的检测急性肺炎患者血清相关生物标志物含量,为建立一种快速鉴别诊断临床急性支原体肺炎、病毒性肺炎、细菌性肺炎的免疫胶体金检测法提供实验依据。方法以临床病原学诊断明确的急性支原体肺炎,病毒性肺炎,细菌性肺炎患者和正常人血... 目的检测急性肺炎患者血清相关生物标志物含量,为建立一种快速鉴别诊断临床急性支原体肺炎、病毒性肺炎、细菌性肺炎的免疫胶体金检测法提供实验依据。方法以临床病原学诊断明确的急性支原体肺炎,病毒性肺炎,细菌性肺炎患者和正常人血清为检测样品,采用血小板衍生生长因子(platelet-derived growth factor,PDGF)/杀菌渗透增强蛋白(bactericidal/permeability-increasing protein,BPI)酶联免疫法(enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)检测试剂盒检测上述血清中相关生物标志物含量。结果 (1)正常人群血清78份,急性支原体肺炎患者血清46份,病毒性肺炎和细菌性肺炎患者血清42份,其中病毒感者患者血清35份,细菌感染患者血清7份;(2)正常人群血清PDGF最大值<6 000 pg/m L;血清BPI最大值<80 ng/m L;(3)以血清PDGF值6 000 pg/m L作为鉴别诊断急性支原体感染的基线值,支原体感染患者阳性检出率为93.47%(43/46);病毒和细菌感染患者出现支原体感染的假阳性率为7.14%(3/42);(4)以血清BPI值80 ng/m L作为鉴别诊断急性细菌感染的基线值,细菌感染患者阳性检出率为85.71%(6/7);病毒感染患者出现细菌感染的假阳性率为3.22%(1/31)。结论以血清PDGF6 000 pg/m L和BPI 80 ng/m L作为鉴别诊断不同病原体感染的基线值,对临床急性支原体肺炎、病毒性肺炎、细菌性肺炎鉴别诊断具有一定意义。 展开更多
关键词 肺炎 鉴别诊断 血小板衍生生长因子 杀菌渗透增强蛋白
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pBV-BPI600重组表达载体的构建及其在E.coli中的表达 被引量:1
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作者 安云庆 刘箐 +1 位作者 柯岩 沈海中 《首都医科大学学报》 CAS 2001年第1期1-5,共5页
①采用RT PCR技术 ,以HL 60细胞mRNA为模板扩增获得编码BPI氨基端 1 93个氨基酸 (rBPI2 1)的基因片段 (BPI60 0 ) ;EcoRI/BamHI酶切扩增产物获得BPI 2 0 0bp和BPI 4 0 0bp 2个基因片段。②成功构建PUC1 8 BPI2 0 0和PUC1 8 BPI4 0 0重... ①采用RT PCR技术 ,以HL 60细胞mRNA为模板扩增获得编码BPI氨基端 1 93个氨基酸 (rBPI2 1)的基因片段 (BPI60 0 ) ;EcoRI/BamHI酶切扩增产物获得BPI 2 0 0bp和BPI 4 0 0bp 2个基因片段。②成功构建PUC1 8 BPI2 0 0和PUC1 8 BPI4 0 0重组克隆载体 ,DNA测序分析结果与文献报道一致。③成功构建pBV2 2 0 BPI60 0重组表达载体 ;转化E .coliDH5α感受态细胞 ,诱导目的重组蛋白表达 ;经SDS PAGE电泳和Western blot鉴定 ,证实表达的重组蛋白确为外源基因 (BPI 60 0bp)编码的产物BPI2 1重组蛋白。 展开更多
关键词 重组杀菌 渗透增强蛋白 pBV220表达载体 PUC18克隆载体
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BPIN端优势抗原表位的模拟合成及其抗血清的制备 被引量:2
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作者 陈艳秋 彭智 +3 位作者 龙军 张国民 吕喆 安云庆 《细胞与分子免疫学杂志》 CAS CSCD 北大核心 2007年第2期143-145,共3页
目的通过生物信息学模拟合成杀菌/渗透增强蛋白氨基端(BPIN端)优势抗原表位肽,免疫动物获得相应抗血清。方法利用生物信息学分析BPIN端(1-199)氨基酸序列的抗原性、亲水性、可塑性、表面可及性和二级结构等理化特性,据此设计合成TA/IK... 目的通过生物信息学模拟合成杀菌/渗透增强蛋白氨基端(BPIN端)优势抗原表位肽,免疫动物获得相应抗血清。方法利用生物信息学分析BPIN端(1-199)氨基酸序列的抗原性、亲水性、可塑性、表面可及性和二级结构等理化特性,据此设计合成TA/IK两条多肽,将其与钥孔戚血蓝素(KLH)偶联后,免疫家兔获得相应抗血清;采用间接ELISA法鉴定多肽的抗原性、测定血清抗体效价,Westernblot鉴定抗血清特异性。结果人工合成BPIN端TA/IK两个B细胞表位肽;ELISA检测证实TA/IK抗原肽能与商品化兔抗人BPI55多克隆抗体结合;所获TA/IK抗血清效价分别为1∶51200和1∶25600;Westernblot证实TA/IK抗血清能与BPI55标准品特异性结合。结论模拟合成的TA/IK抗原肽确为BPIN端优势抗原表位,相应抗血清可用于BPIN端功能性片段的检测鉴定。 展开更多
关键词 生物信息学 杀菌/渗透增强蛋白(BPI) 抗原表位肽 抗血清
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