鸭IFN-α昆虫杆状病毒表达系统的建立及其抗新型鸭呼肠孤病毒活性研究

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作者 孔雨心 柳美玲 +4 位作者 于鲁娜 鹿益豪 张兆鹏 傅绩 李宁 《中国动物检疫》 2025年第3期119-126,共8页

为利用昆虫杆状病毒表达系统表达鸭干扰素α(inteferon-α,IFN-α),并研究其对新型鸭呼肠孤病毒(novel duck reovirus,NDRV)的抗病毒活性,针对鸭IFN-α序列构建重组质粒PFastBac-DuIFN-α,转化DH10Bac细胞后提取重组杆粒B acmid-DuIFN-... 为利用昆虫杆状病毒表达系统表达鸭干扰素α(inteferon-α,IFN-α),并研究其对新型鸭呼肠孤病毒(novel duck reovirus,NDRV)的抗病毒活性,针对鸭IFN-α序列构建重组质粒PFastBac-DuIFN-α,转化DH10Bac细胞后提取重组杆粒B acmid-DuIFN-α,然后将其转染Sf9昆虫细胞并收集上清,盲传3代后收集病变细胞,经超声纯化获得重组鸭IFN-α蛋白。Western blot鉴定结果显示,鸭IFN-α在细胞质中表达,大小约为23 kDa。经测定,重组鸭IFN-α蛋白效价为2.14×10^(5)U/mL,以其处理鸭胚成纤维细胞(DEF)后,可极显著刺激蛋白激酶R(protein kinase R,PKR)、抗黏病毒蛋白(myxovirus resistant,Mx)和寡腺苷酸合成酶(oligadenylate syntase,OAS)编码基因的表达(P<0.01)。进一步将鸭IFN-α蛋白接种5日龄樱桃谷鸭(2.14×10^(3) U/mL,0.2mL/只),2 d后再进行NDRV攻毒试验(1000 TCID_(50)/0.1 mL,0.2 mL/只),同时设置阴性对照组和仅NDRV攻毒组。组织病理学检测显示,仅肌注NDRV的攻毒组雏鸭脾出现大量淋巴细胞崩解坏死,数量减少;而先肌注鸭IFN-α蛋白后攻毒NDRV的试验组雏鸭病变较轻,仅有少量淋巴细胞坏死。实时荧光定量PCR(quantitative real-time PCR,qPCR)检测发现,试验组雏鸭的排毒量极显著低于攻毒组(P<0.01),且其肝和脾中NDRV载量也极显著低于攻毒组(P<0.01),同时试验组Mx和OAS表达量极显著升高(P<0.01)。结果表明,本研究通过昆虫杆状病毒系统成功表达出了重组鸭IFN-α蛋白,其具有较好的抗NDRV活性。本研究为进一步探索鸭IFN-α对NDRV感染等鸭病毒性疾病的防治机制提供了技术支持。 展开更多

关键词 干扰素Α 鸭 昆虫杆状病毒表达系统 新型鸭呼肠孤病毒 抗病毒活性

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基于杆状病毒-昆虫细胞表达系统的猪脑心肌炎病毒样颗粒的表达及鉴定

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作者 王运航 景伟 +3 位作者 穆素雨 孙世琪 郭慧琛 白满元 《畜牧兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2024年第10期4571-4578,共8页

脑心肌炎(encephalomyocarditis)是由脑心肌炎病毒(encephalomyocarditis virus,EMCV)引起的以猪的脑炎、心肌炎为主要特征的病毒性人畜共患病,可感染多种哺乳动物,目前国内尚无有效疫苗。本研究旨在开发一款安全有效的疫苗以防控该病... 脑心肌炎(encephalomyocarditis)是由脑心肌炎病毒(encephalomyocarditis virus,EMCV)引起的以猪的脑炎、心肌炎为主要特征的病毒性人畜共患病,可感染多种哺乳动物,目前国内尚无有效疫苗。本研究旨在开发一款安全有效的疫苗以防控该病。采用P1、3CD共表达的构建策略,利用杆状病毒-昆虫细胞表达系统获得EMCV病毒样颗粒(virus-like particals,VLPs)并将其免疫小鼠,初步评价其在小鼠体内的免疫应答效果。结果显示,免疫组小鼠特异性抗体滴度达到1∶192以上,中和抗体滴度达到1∶64以上,且与ISA206佐剂混合使用可诱导机体产生更高的抗体水平。IL-4、IFN-γ、IL-5、TNF-α细胞因子水平均可达到20 pg·mL^(-1),且明显高于PBS组。综上,本研究获得的EMCV病毒样颗粒疫苗可以诱导机体产生良好的细胞免疫和体液免疫应答,还能诱导炎症细胞因子的产生,有助于激发机体的免疫反应,增强疫苗的保护效果,为EMCV的防控提供了理论依据和技术储备。 展开更多

关键词 杆状病毒-昆虫细胞表达系统 脑心肌炎病毒 病毒样颗粒

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猫传染性腹膜炎病毒N蛋白在昆虫细胞-杆状病毒系统中的表达与鉴定 被引量：10

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作者 李双星 刘业兵 +7 位作者 柳方远 吉婧 杜吉革 李倩琳 朱真 李启红 陈小云 印春生 《中国畜牧兽医》 CAS 北大核心 2021年第1期273-279,共7页

本研究旨在利用昆虫细胞-杆状病毒表达系统表达猫传染性腹膜炎病毒(Feline infectious peritonitis virus,FIPV)N蛋白,并制备抗该蛋白的多克隆抗体,用于FIPV临床抗原/抗体诊断及N蛋白功能研究。参考GenBank中FIPV的N基因序列,选择FIPV毒... 本研究旨在利用昆虫细胞-杆状病毒表达系统表达猫传染性腹膜炎病毒(Feline infectious peritonitis virus,FIPV)N蛋白,并制备抗该蛋白的多克隆抗体,用于FIPV临床抗原/抗体诊断及N蛋白功能研究。参考GenBank中FIPV的N基因序列,选择FIPV毒株N基因(登录号:KC461235.1),并对该N基因进行密码子优化、基因合成,酶切后将N基因连接至pFastBac1载体,转化大肠杆菌DH5α感受态细胞,经氨苄西林抗性筛选阳性克隆,提取质粒经酶切及测序鉴定正确后,转化大肠杆菌DH10Bac感受态细胞,经蓝白斑筛选及PCR鉴定后,最终成功构建重组杆状病毒质粒Bacmid-N,转染Sf9细胞包装杆状病毒,于28℃温箱培养4 d后收集感染Sf9细胞上清,并通过镍离子亲和层析纯化获得重组N蛋白。经SDS-PAGE及Western blotting鉴定结果表明,本研究成功利用昆虫细胞-杆状病毒表达系统表达出大小约为51 ku的FIPV重组N蛋白。将该蛋白与弗氏佐剂按一定比例混合后,免疫6周龄BALB/c小鼠。用间接ELISA方法检测小鼠血清抗体效价可达1∶102400;利用Western blotting和间接免疫荧光试验对N蛋白多克隆抗体进行检测分析,结果表明,真核表达的重组蛋白免疫原性良好,多克隆抗体具有良好的反应原性,可特异识别FIPV感染细胞。本研究为FIPV抗原/抗体诊断试剂盒的研发奠定了基础。 展开更多

关键词 猫传染性腹膜炎病毒(FIPV) 核衣壳蛋白 昆虫细胞-杆状病毒表达系统

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蜂王浆主蛋白2在昆虫细胞-杆状病毒系统中的表达与鉴定

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作者 段香媛 武江利 +1 位作者 魏俏红 冯毛 《中国畜牧兽医》 CAS 北大核心 2021年第10期3779-3786,共8页

本研究旨在利用昆虫细胞-杆状病毒表达系统表达蜂王浆主蛋白2(MRJP2),为后续MRJP2功能的深入研究提供材料。根据GenBank中意大利蜜蜂(Apis mellifera L.)MRJP2基因序列,经PCR扩增、克隆至真核表达载体pFastBac1,构建重组杆状病毒质粒MRJ... 本研究旨在利用昆虫细胞-杆状病毒表达系统表达蜂王浆主蛋白2(MRJP2),为后续MRJP2功能的深入研究提供材料。根据GenBank中意大利蜜蜂(Apis mellifera L.)MRJP2基因序列,经PCR扩增、克隆至真核表达载体pFastBac1,构建重组杆状病毒质粒MRJP2-Bacmid并转染至Sf9昆虫细胞,以P2代杆状病毒感染Sf9细胞进行诱导表达,利用层析柱和离子交换柱对表达产物进行纯化,并通过SDS-PAGE、Western blotting及四极杆静电场轨道阱高分辨质谱仪(Q Exactive)对目的蛋白进行分析验证。结果显示,本试验成功构建杆状病毒质粒MRJP2-Bacmid,转染至Sf9昆虫细胞并获得表达产物。SDS-PAGE和Western blotting验证结果表明,本研究成功利用昆虫细胞-杆状病毒表达系统表达出大小约为52 ku的MRJP2重组蛋白,且纯度较高;质谱分析结果显示,该重组蛋白匹配到蜜蜂蛋白质数据库中MRJP2的特异性肽段为39个,序列覆盖率为61%,且与MRJP2的匹配得分最高,进一步确认该重组蛋白为MRJP2。本研究利用昆虫细胞-杆状病毒表达系统成功表达出MRJP2,为后续该蛋白生物学功能的深入研究奠定了基础。 展开更多

关键词 蜂王浆主蛋白2(MRJP2) 昆虫细胞-杆状病毒表达系统 蛋白纯化

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犬瘟热病毒囊膜糖蛋白在杆状病毒-昆虫细胞系统中的表达及鉴定 被引量：1

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作者 虞一聪 冯娜 +9 位作者 闫飞虎 盖微微 王铁成 王化磊 郑学星 赵永坤 黄耕 杨松涛 高玉伟 夏咸柱 《畜牧兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2015年第6期981-988,共8页

为表达具有天然构象的犬瘟热病毒(CDV)囊膜糖蛋白融合蛋白(F)和血凝素蛋白(H),本研究扩增小熊猫源CDV驯化致弱株LP的F、H基因,克隆至pFastBacTM1载体中,测序验证后转化至DH10BacTM感受态细胞,同源重组获得穿梭质粒rBacmid-F、rBacmid-H... 为表达具有天然构象的犬瘟热病毒(CDV)囊膜糖蛋白融合蛋白(F)和血凝素蛋白(H),本研究扩增小熊猫源CDV驯化致弱株LP的F、H基因,克隆至pFastBacTM1载体中,测序验证后转化至DH10BacTM感受态细胞,同源重组获得穿梭质粒rBacmid-F、rBacmid-H,将其分别转染Sf9细胞获得重组杆状病毒rpFB-F、rpFB-H,并将表达的重组融合蛋白(rF)和血凝素蛋白(rH)进行IFA和Western blot鉴定。以犬抗CDV高免血清对重组杆状病毒感染细胞进行IFA鉴定,在感染细胞的细胞膜上可见特异性荧光反应;以鼠抗F、H蛋白的主要抗原表位区多克隆抗体对重组杆状病毒感染细胞进行Western blot检测,可见相对分子质量为63和68ku左右的条带,分别为重组融合蛋白(rF)和血凝素蛋白(rH),大小与预期相符。两种囊膜糖蛋白在杆状病毒-昆虫细胞系统中均成功表达,且具有良好的反应原性。本研究为CDV病毒样颗粒疫苗的开发等工作奠定了基础。 展开更多

关键词 犬瘟热病毒 融合蛋白 血凝素蛋白 杆状病毒-昆虫细胞系统

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兔出血症病毒衣壳蛋白VP60在杆状病毒表达系统中的表达及细胞内定位 被引量：6

6

作者 陈柳 云涛 +3 位作者 刘光清 倪征 余斌 宋毅 《浙江农业学报》 CSCD 北大核心 2010年第2期135-139,共5页

为了探讨兔出血症病毒(RHDV)衣壳蛋白的细胞内定位,利用杆状病毒表达系统构建了表达RHDV结构蛋白(VP60)的重组杆状病毒。间接免疫荧光(IFA)和Western blot检测以及电子显微镜观察结果表明,VP60不仅能在昆虫细胞中正确表达,而且能自组装... 为了探讨兔出血症病毒(RHDV)衣壳蛋白的细胞内定位,利用杆状病毒表达系统构建了表达RHDV结构蛋白(VP60)的重组杆状病毒。间接免疫荧光(IFA)和Western blot检测以及电子显微镜观察结果表明,VP60不仅能在昆虫细胞中正确表达,而且能自组装形成病毒样颗粒(VLPs)。进一步对表达蛋白进行细胞内定位观察发现,表达蛋白定位于Sf9细胞的细胞膜上。 展开更多

关键词 兔出血症病毒 结构蛋白 昆虫—杆状病毒表达系统 细胞内定位

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杆状病毒表达系统在兽用亚单位疫苗领域应用的研究进展 被引量：11

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作者 刘春菊 任炜杰 王志亮 《中国畜牧兽医》 CAS 北大核心 2013年第9期101-105,共5页

杆状病毒表达系统是以杆状病毒为蛋白质表达载体,昆虫细胞或幼虫为受体的真核表达系统。与原核细胞相比,昆虫细胞可对外源蛋白进行翻译后修饰,如多肽折叠、糖基化、酰基化、磷酸化、二硫键形成及蛋白质水解等。因杆状病毒对畜禽无致病性... 杆状病毒表达系统是以杆状病毒为蛋白质表达载体,昆虫细胞或幼虫为受体的真核表达系统。与原核细胞相比,昆虫细胞可对外源蛋白进行翻译后修饰,如多肽折叠、糖基化、酰基化、磷酸化、二硫键形成及蛋白质水解等。因杆状病毒对畜禽无致病性,这使得杆状病毒表达系统成为一种安全有效的兽用亚单位疫苗生产平台。作者对杆状病毒表达系统在兽用亚单位疫苗领域中的应用作了简要综述。 展开更多

关键词 杆状病毒表达系统 杆状病毒 昆虫细胞 兽用亚单位疫苗 病毒样颗粒 生产加工

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昆虫杆状病毒表达系统生产流感疫苗的研究进展 被引量：4

8

作者 李晶梅 靖志强 +4 位作者 秦红刚 薛霜 漆世华 谢红玲 吴玉石 《中国兽药杂志》 2012年第12期67-70,共4页

综述了昆虫杆状病毒表达系统生产流感疫苗的研究进展,同时分析了昆虫杆状病毒表达系统表达流感病毒样颗粒用于流感疫苗的优势和前景,以期为兽用流感病毒VLPs疫苗研发提供参考。

关键词 昆虫杆状病毒表达系统 流感病毒样颗粒 流感疫苗

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利用杆状病毒系统表达重组HBV聚合酶RT区段

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作者 李晖 王程 +3 位作者 余治健 耿书英 王景玲 侯金林 《山东医药》 CAS 北大核心 2009年第13期73-74,共2页

目的利用杆状病毒表达载体系统制备重组HBV聚合酶RT区段蛋白。方法构建含有HBV P基因RT区段的杆状病毒转移载体pFastBac HT-RT,转化大肠埃希菌DH10B-ac进行重组,提取重组Bacmid DNA质粒,转染昆虫细胞Sf9获得含有HBVP基因RT区段的重组杆... 目的利用杆状病毒表达载体系统制备重组HBV聚合酶RT区段蛋白。方法构建含有HBV P基因RT区段的杆状病毒转移载体pFastBac HT-RT,转化大肠埃希菌DH10B-ac进行重组,提取重组Bacmid DNA质粒,转染昆虫细胞Sf9获得含有HBVP基因RT区段的重组杆状病毒。重组的杆状病毒再感染Sf9细胞进行HBVP基因RT区段蛋白表达,通过Western blot检测表达情况。结果成功构建了含HBV P基因RT区段的重组杆状病毒,昆虫细胞Sf9中能检测到HBV P基因RT区段蛋白的表达。结论利用杆状病毒表达系统能成功地表达HBVP基因RT区段蛋白。 展开更多

关键词 HBV P基因 杆状病毒表达载体系统 昆虫细胞

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CDV强毒BJ16B2株H基因在昆虫杆状病毒中的表达与鉴定 被引量：1

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作者 陈美荣 林伟东 +4 位作者 宋天琪 鑫婷 郭晓宇 黄克和 贾红 《中国畜牧兽医》 CAS 北大核心 2018年第8期2041-2048,共8页

试验旨在获得具有天然构象且抗原性良好的犬瘟热病毒(canine distemper virus,CDV)强毒株的H蛋白。以分离的CDV强毒株BJ16B2为模板,RT-PCR特异扩增H基因,克隆至表达载体pFastBacTMHTA上,酶切及测序鉴定正确后比对分析H基因同源性,并将... 试验旨在获得具有天然构象且抗原性良好的犬瘟热病毒(canine distemper virus,CDV)强毒株的H蛋白。以分离的CDV强毒株BJ16B2为模板,RT-PCR特异扩增H基因,克隆至表达载体pFastBacTMHTA上,酶切及测序鉴定正确后比对分析H基因同源性,并将重组质粒pFastBacTMHTA-H转化大肠杆菌DH10BacTM感受态细胞,同源重组构建穿梭质粒rBacmid-H,将重组穿梭质粒转染Sf9昆虫细胞,拯救重组杆状病毒。利用IFA和Western blotting对获得的重组蛋白进行鉴定及抗原性分析。结果显示,重组质粒pFastBacTMHTA-H酶切测序鉴定正确,该H基因属于Asia-1强毒株,与参考毒株的核苷酸和氨基酸同源性分别为89.8%~99.3%和89.6%~99.5%。在杆状病毒中所表达的H蛋白能与CDV阳性血清及His-tag抗体发生特异性反应,IFA鉴定能够产生特异性绿色荧光,且在68ku左右出现蛋白条带,表明H蛋白成功表达且具有良好的反应原性。本研究获得了具有天然构象及良好抗原性的CDV重组H蛋白,为后续蛋白结构和抗原特性差异分析、单抗制备、CDV亚单位疫苗的开发奠定了基础。 展开更多

关键词 犬瘟热病毒(CDV) H基因 昆虫杆状病毒表达系统

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A型塞内卡病毒VP1结构蛋白在昆虫杆状病毒中的表达与鉴定 被引量：4

11

作者 张斌 刘建奇 +5 位作者 张杰 韩宇 巨敏莹 乌吉斯古楞 宋庆庆 关平原 《中国动物检疫》 CAS 2020年第12期114-119,共6页

目前在昆虫杆状病毒表达系统(baculovirus expression vector system,BEVS)中表达A型塞内卡病毒(Senecavirus A,SVA)结构蛋白VP1尚未见报道。本研究将VP1基因通过限制性酶切位点插入杆状病毒载体pFastBac I,然后将鉴定正确的重组载体转... 目前在昆虫杆状病毒表达系统(baculovirus expression vector system,BEVS)中表达A型塞内卡病毒(Senecavirus A,SVA)结构蛋白VP1尚未见报道。本研究将VP1基因通过限制性酶切位点插入杆状病毒载体pFastBac I,然后将鉴定正确的重组载体转化至DH10Bac感受态细胞,经蓝白斑筛选,对鉴定正确的菌落提取质粒。将质粒转染Sf9昆虫细胞,待有明显细胞病变后收获重组杆状病毒rBac-I-VP1,并进行病毒滴度测定。随后通过蛋白免疫印记(Western Blot)和间接免疫荧光(IFA)鉴定VP1蛋白表达情况。结果显示,重组杆状病毒rBac-I-VP1滴度为6.8×105 pfu/mL;Western Blot可检测到相对分子质量约27 kDa的表达产物,且其能够被SVA兔阳性多克隆血清识别;IFA试验显示,VP1蛋白能够在Sf9细胞内表达。结果表明,本研究利用BEVS表达的SVA VP1蛋白具有良好的免疫反应性,为其后期功能研究及SVA诊断试剂研制提供了技术基础。 展开更多

关键词 猪塞内卡病毒 VP1蛋白 昆虫杆状病毒表达系统

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杆状病毒表达载体系统研究进展 被引量：4

12

作者 曾铮 吴大洋 《中国蚕业》 2005年第3期4-7,共4页

关键词 表达载体系统 杆状病毒 苜蓿银纹夜蛾核型多角体病毒 研究进展 环状DNA分子 多角体蛋白基因 昆虫病毒 ACMNPV Virus

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小反刍兽疫病毒N基因在昆虫细胞中的表达 被引量：6

13

作者 龙云凤 祝贺 +6 位作者 杨建明 陈朝银 徐维佳 周晓黎 董俊 叶玲玲 艾军 《动物医学进展》 CSCD 北大核心 2011年第12期1-5,共5页

为了研发小反刍兽疫病毒ELISA检测试剂盒中替代全病毒的抗原物质,参照GenBank公布的小反刍兽疫疫苗株Nigeria75/1的全基因组序列(GenBank登录号:X74443),人工合成表达核蛋白的N基因开放阅读框序列,通过PCR扩增、经引物设计引入的EcoRⅠ... 为了研发小反刍兽疫病毒ELISA检测试剂盒中替代全病毒的抗原物质,参照GenBank公布的小反刍兽疫疫苗株Nigeria75/1的全基因组序列(GenBank登录号:X74443),人工合成表达核蛋白的N基因开放阅读框序列,通过PCR扩增、经引物设计引入的EcoRⅠ和KpnⅠ特异性酶切位点,将N基因克隆于昆虫杆状病毒表达载体pFastBacHTA,阳性重组质粒命名为pFastBacHTA-PPRV-N,测序结果显示N基因片段长度为1 578bp。将该重组质粒转化含有杆状病毒穿梭载体的DH10Bac感受态细胞,得到重组穿梭质粒Bacmid-PPRV-N,将该重组穿梭质粒在脂质体介导下转染昆虫细胞Sf9,获得重组杆状病毒。通过SDS-PAGE和Western blot分析表明该蛋白得到表达产物,具有与抗体反应的活性,大小约为61.3ku。 展开更多

关键词 小反刍兽疫病毒 N基因 杆状病毒表达载体 昆虫细胞 表达

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牛病毒性腹泻病毒E2基因在昆虫细胞中的表达 被引量：4

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作者 范晴 谢芝勋 +5 位作者 刘加波 庞耀珊 邓显文 谢志勤 谢丽基 罗思思 《动物医学进展》 CSCD 北大核心 2013年第4期9-12,共4页

为了获得具有良好抗原性的牛病毒性腹泻病毒E2囊膜蛋白,利用PCR方法扩增牛病毒性腹泻病毒E2基因,连接于昆虫杆状病毒表达载体中,构建pFastBacHTA-E2重组质粒。将该重组质粒转化入DH10BAC感受态细胞,经PCR鉴定获得转座杆粒Bacmid-E2。转... 为了获得具有良好抗原性的牛病毒性腹泻病毒E2囊膜蛋白,利用PCR方法扩增牛病毒性腹泻病毒E2基因,连接于昆虫杆状病毒表达载体中,构建pFastBacHTA-E2重组质粒。将该重组质粒转化入DH10BAC感受态细胞,经PCR鉴定获得转座杆粒Bacmid-E2。转座杆粒Bacmid-E2转染sf9昆虫细胞,获得重组杆状病毒,感染细胞后,收获得到目的蛋白,用SDS-PAGE和Western blot对重组的表达蛋白进行分析。结果表明,重组E2蛋白大小为43.6ku,与预期值相符,该蛋白能与牛病毒性腹泻病毒阳性血清发生特异性反应,为进一步研发牛病毒性腹泻病毒ELISA抗体检测试剂盒奠定基础。 展开更多

关键词 牛病毒性腹泻病毒 E2蛋白 杆状病毒表达体系 昆虫细胞

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杆状病毒表达载体系统研究进展

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作者 李青兵 《广东蚕业》 1998年第4期60-64,共5页

昆虫杆状病毒科(Baculoviridae)因包埋于多角体中的病毒粒子呈棒状而得名,迄今为止,用于基因工程的杆状病毒均属核型多角体病毒(nuclear polyhedrosis virus,NPV)。NPV是一类双链DNA病毒,它的DNA是90—230Kb的环状分子。利用NPV作为外... 昆虫杆状病毒科(Baculoviridae)因包埋于多角体中的病毒粒子呈棒状而得名,迄今为止,用于基因工程的杆状病毒均属核型多角体病毒(nuclear polyhedrosis virus,NPV)。NPV是一类双链DNA病毒,它的DNA是90—230Kb的环状分子。利用NPV作为外源基因表达载体的设想最初是由Miller 1981年提出。 展开更多

关键词 杆状病毒表达载体系统 启动子序列 外源基因 昆虫杆状病毒 多角体蛋白 转移载体 研究进展 重组病毒 核型多角体病毒 病毒粒子

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施马伦贝格病毒核蛋白在昆虫细胞中的表达 被引量：1

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作者 秦敏 郝俊虎 +7 位作者 祝贺 邹丰才 杨云庆 杨素 叶玲玲 张永宁 周晓黎 艾军 《中国动物检疫》 CAS 2016年第1期76-80,共5页

参照NCBI公布的施马伦贝格病毒(SBV)的N基因开放阅读框序列,设计了一对含特异性酶切位点的引物,扩增SBV N基因,将其克隆于昆虫杆状病毒表达载体p Fast Bac HTB,然后以该重组质粒转化DH10Bac感受态细胞,得到重组穿梭质粒Bacmid-SBV-N,将... 参照NCBI公布的施马伦贝格病毒(SBV)的N基因开放阅读框序列,设计了一对含特异性酶切位点的引物,扩增SBV N基因,将其克隆于昆虫杆状病毒表达载体p Fast Bac HTB,然后以该重组质粒转化DH10Bac感受态细胞,得到重组穿梭质粒Bacmid-SBV-N,将该重组穿梭质粒在脂质体介导下转染Sf 9昆虫细胞,得到表达SBV重组N蛋白的杆状病毒。通过SDS-PAGE和Western blot对重组N蛋白进行鉴定,表明该蛋白得到表达。本研究为以SBV核蛋白为基础的相关检测方法的建立提供了物质基础。 展开更多

关键词 施马伦贝格病毒 核蛋白 杆状病毒 昆虫细胞 表达

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经密码子优化的猪Ficolin α在昆虫细胞的表达及其体外抗病毒作用初步分析

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作者 李兰 乔绪稳 +3 位作者 张元鹏 陈瑾 郑其升 侯继波 《畜牧兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2017年第12期2358-2364,共7页

利用Bac-to-Bac昆虫杆状病毒表达系统表达具有天然构象的猪Ficolinα。首先构建重组穿梭质粒rBacmid-Ficolinα,转染sf9细胞获得重组杆状病毒rBV-Ficolinα;通过Image J软件对优化表达的Western blot图片进行灰度分析确定较佳表达条件;... 利用Bac-to-Bac昆虫杆状病毒表达系统表达具有天然构象的猪Ficolinα。首先构建重组穿梭质粒rBacmid-Ficolinα,转染sf9细胞获得重组杆状病毒rBV-Ficolinα;通过Image J软件对优化表达的Western blot图片进行灰度分析确定较佳表达条件;纯化目的蛋白质后,进一步评价其体外抗病毒活性。Western blot结果显示以7.5MOI接种量感染的sf9细胞在96h时获得了较高的表达,同时获得的重组猪Ficolinα具有抗猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)活性。猪Ficolinα在sf9昆虫细胞中获得成功表达,且具有良好的抗PRRSV活性。本研究可以为猪Ficolinα的抗病毒活性及作用机制研究提供物质基础。 展开更多

关键词 猪Ficolin 杆状病毒-昆虫细胞表达系统 抗病毒作用

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昆虫杆状病毒在生物技术研究中的应用 被引量：2

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作者 郭锡杰 吴友良 《常熟高专学报》 2001年第4期52-58,共7页

随着昆虫杆状病毒分子生物学研究的不断深入 ,昆虫杆状病毒在生物技术研究中也得到了应用。利用杆状病毒作为载体 ,在昆虫细胞和虫体内表达外源基因 ,形成了昆虫杆状病毒载体表达系统 ,利用杆状病毒携带外源基因 ,通过同源重组将外源基... 随着昆虫杆状病毒分子生物学研究的不断深入 ,昆虫杆状病毒在生物技术研究中也得到了应用。利用杆状病毒作为载体 ,在昆虫细胞和虫体内表达外源基因 ,形成了昆虫杆状病毒载体表达系统 ,利用杆状病毒携带外源基因 ,通过同源重组将外源基因导入到家蚕的基因组构建了转基因家蚕 ;通过向杆状病毒基因组中插入毒素、激素、酶抑制剂等的基因或从杆状病毒基因组中删除某个基因 ,或通过不同杆状病毒间的杂交 ,使子代病毒的宿主域扩大 ,从而提高了杆状病毒作为生物杀虫剂的杀虫效果。 展开更多

关键词 昆虫杆状病毒 生物技术 杆状病毒载体表达系统 杆状病毒杀虫剂 基因表达 应用

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C端带多聚组氨酸标签的重组小鼠基质细胞衍生因子-1α原核系统的表达及分离纯化

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作者 蔡绍晖 杜军 +2 位作者 任先达 谭毅 李新平 《高技术通讯》 EI CAS CSCD 2003年第9期47-52,共6页

在构建SDF-1原核表达系统的基础上,探索对其活性表达产物分离纯化的技术路线。将从小鼠骨髓组织克隆出的SDF-1α成熟肽基因插入原核表达质粒pET101/D-TOPO,用以转化大肠杆菌BL21Star^(TM)菌株,经IPTG进行诱导表达。SDS-PAGE和Western B... 在构建SDF-1原核表达系统的基础上,探索对其活性表达产物分离纯化的技术路线。将从小鼠骨髓组织克隆出的SDF-1α成熟肽基因插入原核表达质粒pET101/D-TOPO,用以转化大肠杆菌BL21Star^(TM)菌株,经IPTG进行诱导表达。SDS-PAGE和Western Blot检测证实:其表达产物在约11.6kD处有明显条带显示,其大小与预测的重组SDF-1α/His分子量一致。采用Ni^2+-Resin固相亲和层析法对由该系统表达的C端带6Xhis标签的重组SDF-1α/His进行分离纯化,纯度达92％。体外活性检测结果表明:重组小鼠SDF-1α/His对T细胞有明显趋化和促生存作用;能有效诱导Jurkat细胞ERK磷酸化。 展开更多

关键词 多聚组氨酸 基质细胞衍生因子-1Α 原核系统 表达 分离 纯化 趋化因子 基因重组 固相亲和层析 基因转染

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非洲马瘟病毒VP7基因的克隆及其在昆虫细胞中的表达 被引量：6

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作者 李富祥 杨仕标 +3 位作者 艾军 周晓黎 赵文华 王金萍 《中国畜牧兽医》 CAS 北大核心 2012年第1期28-31,共4页

为了获得具有天然活性的非洲马瘟病毒重组VP7蛋白,制备针对非洲马瘟VP7蛋白的单克隆抗体及建立快速抗体检测方法,本试验通过PCR扩增、胶回收纯化后经XbaⅠ和HindⅢ特异性酶切,将VP7基因克隆于昆虫杆状病毒表达载体pFastBacHTB,经PCR、... 为了获得具有天然活性的非洲马瘟病毒重组VP7蛋白,制备针对非洲马瘟VP7蛋白的单克隆抗体及建立快速抗体检测方法,本试验通过PCR扩增、胶回收纯化后经XbaⅠ和HindⅢ特异性酶切,将VP7基因克隆于昆虫杆状病毒表达载体pFastBacHTB,经PCR、酶切、测序鉴定后,成功构建了携带VP7基因的重组质粒pFastBacHTB-AHSV-VP7。该重组质粒转化含有杆状病毒穿梭载体的DH10Bac感受态细胞,经抗生素、PCR筛选,获得转座的杆粒Bacmid-AHSV-VP7,并在脂质体介导下转染Sf9昆虫细胞,获得重组杆状病毒,再感染Sf9昆虫细胞,收获表达产物。表达产物经Western blotting分析表明,VP7重组蛋白得到表达,其分子质量大小约为45ku,且具有良好的生物活性。 展开更多

关键词 非洲马瘟病毒 VP7基因 杆状病毒表达 昆虫细胞

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