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基于新型昆虫杆状病毒flashBACTM表达系统表达鸭腺病毒3型Fiber-1蛋白
1
作者 肖雅清 孟凯 +4 位作者 董雯雯 袁小远 李桂明 刘明超 翟向和 《山东农业科学》 北大核心 2025年第7期139-144,共6页
鸭腺病毒3型(DAdV-3)近些年来被多地报道,给我国的养禽业带来较大损失。纤突蛋白(Fiber)在介导鸭腺病毒感染和诱导体液免疫中发挥着重要作用。本研究基于昆虫杆状病毒flashBACTM表达系统对DAdV-3的Fiber-1蛋白进行重组表达,获得目的蛋... 鸭腺病毒3型(DAdV-3)近些年来被多地报道,给我国的养禽业带来较大损失。纤突蛋白(Fiber)在介导鸭腺病毒感染和诱导体液免疫中发挥着重要作用。本研究基于昆虫杆状病毒flashBACTM表达系统对DAdV-3的Fiber-1蛋白进行重组表达,获得目的蛋白。因该系统将LacZ基因整合到苜蓿银纹蛾核型多角体病毒(AcMNPV),重组后开启LacZ表达,其借助蓝白斑实现对阳性病毒的筛选,免除空斑筛选过程,大大节省实验时间;通过Western blot验证Fiber-1蛋白在昆虫Sf9细胞中成功表达。本研究结果可为深入探究Fiber-1蛋白在DAdV-3感染机制中的作用以及相关的生物制品制备奠定基础。 展开更多
关键词 昆虫杆状病毒表达系统 鸭腺病毒3型 蛋白表达 Fiber-1
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猪流行性腹泻病毒N蛋白在昆虫杆状病毒系统中的表达及单克隆抗体制备
2
作者 柴茂 马震原 +8 位作者 杨海波 王淑娟 刘影 王东方 赵雪丽 王翠 谢彩华 王华俊 闫若潜 《中国动物传染病学报》 北大核心 2025年第2期124-131,共8页
利用昆虫杆状病毒表达系统(BEVS)表达猪流行性腹泻病毒(PEDV)N蛋白,并制备单克隆抗体。构建PEDV N基因重组穿梭质粒pFastBac-N,转化至感受态细胞DH10Bac中获取重组杆粒Bacmid-N,将Bacmid-N转染至SF9昆虫细胞中制备重组蛋白。将重组蛋白... 利用昆虫杆状病毒表达系统(BEVS)表达猪流行性腹泻病毒(PEDV)N蛋白,并制备单克隆抗体。构建PEDV N基因重组穿梭质粒pFastBac-N,转化至感受态细胞DH10Bac中获取重组杆粒Bacmid-N,将Bacmid-N转染至SF9昆虫细胞中制备重组蛋白。将重组蛋白免疫小鼠,经融合、筛选、纯化出单克隆抗体,并测定单克隆抗体相关特性。获得重组杆状病毒rBV-N,获得大小为59 kDa重组N蛋白(rN),制备出抗N蛋白单克隆抗体3C8E3,该单克隆抗体为IgG1亚类,效价为1∶1.024×10^(5),效价高、特异性强、稳定性好,更具实用性。本研究为PEDV抗原/抗体诊断试剂盒、PEDV亚单位疫苗研究奠定了基础。 展开更多
关键词 昆虫杆状病毒表达系统 猪流行腹泻病毒 单克隆抗体
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杆状病毒-昆虫表达系统(IBEVS)表达的动物病毒样颗粒及疫苗研究进展 被引量：1
3
作者 王炎 高婉宁 +3 位作者 范益阳 玉妹 张德荣 柏家林 《江苏农业学报》 北大核心 2025年第1期203-208,共6页
杆状病毒-昆虫表达系统(IBEVS)是一种高效的外源蛋白表达平台,具有可以容纳较大的外源基因片段、蛋白质表达量较高、支持蛋白质翻译后修饰、操作简便且安全性较高等优势,已被广泛用于兽用疫苗生产。病毒样颗粒(VLP)是一种由病毒蛋白自... 杆状病毒-昆虫表达系统(IBEVS)是一种高效的外源蛋白表达平台,具有可以容纳较大的外源基因片段、蛋白质表达量较高、支持蛋白质翻译后修饰、操作简便且安全性较高等优势,已被广泛用于兽用疫苗生产。病毒样颗粒(VLP)是一种由病毒蛋白自组装形成的纳米颗粒,由于缺乏病毒遗传物质,其安全性较高。VLP表面抗原排列高度有序,可有效诱导免疫反应,是一种新型的亚单位疫苗。本文综述了IBEVS在动物VLP疫苗中的应用现状,分析了当前IBEVS存在的问题及其解决策略,为动物VLP疫苗的进一步开发提供参考。 展开更多
关键词 病毒样颗粒 杆状病毒-昆虫表达系统(IBEVS) 动物病毒样颗粒疫苗
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鸭IFN-α昆虫杆状病毒表达系统的建立及其抗新型鸭呼肠孤病毒活性研究
4
作者 孔雨心 柳美玲 +4 位作者 于鲁娜 鹿益豪 张兆鹏 傅绩 李宁 《中国动物检疫》 2025年第3期119-126,共8页
为利用昆虫杆状病毒表达系统表达鸭干扰素α(inteferon-α,IFN-α),并研究其对新型鸭呼肠孤病毒(novel duck reovirus,NDRV)的抗病毒活性,针对鸭IFN-α序列构建重组质粒PFastBac-DuIFN-α,转化DH10Bac细胞后提取重组杆粒B acmid-DuIFN-... 为利用昆虫杆状病毒表达系统表达鸭干扰素α(inteferon-α,IFN-α),并研究其对新型鸭呼肠孤病毒(novel duck reovirus,NDRV)的抗病毒活性,针对鸭IFN-α序列构建重组质粒PFastBac-DuIFN-α,转化DH10Bac细胞后提取重组杆粒B acmid-DuIFN-α,然后将其转染Sf9昆虫细胞并收集上清,盲传3代后收集病变细胞,经超声纯化获得重组鸭IFN-α蛋白。Western blot鉴定结果显示,鸭IFN-α在细胞质中表达,大小约为23 kDa。经测定,重组鸭IFN-α蛋白效价为2.14×10^(5)U/mL,以其处理鸭胚成纤维细胞(DEF)后,可极显著刺激蛋白激酶R(protein kinase R,PKR)、抗黏病毒蛋白(myxovirus resistant,Mx)和寡腺苷酸合成酶(oligadenylate syntase,OAS)编码基因的表达(P<0.01)。进一步将鸭IFN-α蛋白接种5日龄樱桃谷鸭(2.14×10^(3) U/mL,0.2mL/只),2 d后再进行NDRV攻毒试验(1000 TCID_(50)/0.1 mL,0.2 mL/只),同时设置阴性对照组和仅NDRV攻毒组。组织病理学检测显示,仅肌注NDRV的攻毒组雏鸭脾出现大量淋巴细胞崩解坏死,数量减少;而先肌注鸭IFN-α蛋白后攻毒NDRV的试验组雏鸭病变较轻,仅有少量淋巴细胞坏死。实时荧光定量PCR(quantitative real-time PCR,qPCR)检测发现,试验组雏鸭的排毒量极显著低于攻毒组(P<0.01),且其肝和脾中NDRV载量也极显著低于攻毒组(P<0.01),同时试验组Mx和OAS表达量极显著升高(P<0.01)。结果表明,本研究通过昆虫杆状病毒系统成功表达出了重组鸭IFN-α蛋白,其具有较好的抗NDRV活性。本研究为进一步探索鸭IFN-α对NDRV感染等鸭病毒性疾病的防治机制提供了技术支持。 展开更多
关键词 干扰素Α 鸭 昆虫杆状病毒表达系统 新型鸭呼肠孤病毒 抗病毒活性
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基于杆状病毒-昆虫细胞表达系统的猪脑心肌炎病毒样颗粒的表达及鉴定
5
作者 王运航 景伟 +3 位作者 穆素雨 孙世琪 郭慧琛 白满元 《畜牧兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2024年第10期4571-4578,共8页
脑心肌炎(encephalomyocarditis)是由脑心肌炎病毒(encephalomyocarditis virus,EMCV)引起的以猪的脑炎、心肌炎为主要特征的病毒性人畜共患病,可感染多种哺乳动物,目前国内尚无有效疫苗。本研究旨在开发一款安全有效的疫苗以防控该病... 脑心肌炎(encephalomyocarditis)是由脑心肌炎病毒(encephalomyocarditis virus,EMCV)引起的以猪的脑炎、心肌炎为主要特征的病毒性人畜共患病,可感染多种哺乳动物,目前国内尚无有效疫苗。本研究旨在开发一款安全有效的疫苗以防控该病。采用P1、3CD共表达的构建策略,利用杆状病毒-昆虫细胞表达系统获得EMCV病毒样颗粒(virus-like particals,VLPs)并将其免疫小鼠,初步评价其在小鼠体内的免疫应答效果。结果显示,免疫组小鼠特异性抗体滴度达到1∶192以上,中和抗体滴度达到1∶64以上,且与ISA206佐剂混合使用可诱导机体产生更高的抗体水平。IL-4、IFN-γ、IL-5、TNF-α细胞因子水平均可达到20 pg·mL^(-1),且明显高于PBS组。综上,本研究获得的EMCV病毒样颗粒疫苗可以诱导机体产生良好的细胞免疫和体液免疫应答,还能诱导炎症细胞因子的产生,有助于激发机体的免疫反应,增强疫苗的保护效果,为EMCV的防控提供了理论依据和技术储备。 展开更多
关键词 杆状病毒-昆虫细胞表达系统 脑心肌炎病毒 病毒样颗粒
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ENO1蛋白及其相关活性位点缺失突变蛋白在昆虫杆状病毒表达系统中的表达与鉴定
6
作者 代鹏钰 杨蕊 +2 位作者 章婷婷 马昕芸 刘会玲 《中国肿瘤生物治疗杂志》 CAS CSCD 北大核心 2024年第7期669-674,共6页
目的:利用昆虫杆状病毒表达系统(昆虫BEVS)表达糖酵解酶α-烯醇化酶(ENO1)及其3种酶活性位点缺失突变的ENO1蛋白ENO1-M1、ENO1-M2和ENO1-M3,为后续宫颈癌的代谢治疗研究奠定基础。方法:利用分子克隆技术将优化后ENO1序列插入pFastBacTM... 目的:利用昆虫杆状病毒表达系统(昆虫BEVS)表达糖酵解酶α-烯醇化酶(ENO1)及其3种酶活性位点缺失突变的ENO1蛋白ENO1-M1、ENO1-M2和ENO1-M3,为后续宫颈癌的代谢治疗研究奠定基础。方法:利用分子克隆技术将优化后ENO1序列插入pFastBacTM1载体,获得含有目的基因的重组质粒pFastBac-ENO1。分别缺失ENO1发挥糖酵解酶功能的3个活性位点,进行优化后将其插入pFastBacTM1载体,获得3个活性位点缺失的重组质粒pFastBac-M1、pFastBac-M2和pFastBac-M3。通过转座、转染后获得重组杆状病毒rBV-ENO1、rBV-M1、rBV-M2和rBV-M3,利用WB法对目的蛋白的表达及特异性进行检测。结果:成功扩增重组杆粒rBacmid-ENO1、rBacmid-M1、rBacmid-M2和rBacmid-M3,获得大小约2000 bp的基因片段,与预期大小相符。昆虫BEVS可表达ENO1蛋白及其3个酶活位点缺失的重组蛋白ENO1-M1、ENO1-M2和ENO1-M3,其分子量约为52000,与预期相符。WB法鉴定这些蛋白能与特异性标签His-tag发生反应。结论:通过昆虫BEVS成功表达目的蛋白ENO1及其酶活性位点缺失蛋白ENO1-M1、ENO1-M2和ENO1-M3,这些蛋白具有反应原性,为后续测定这些蛋白与ENO1单抗亲和力创造了条件。 展开更多
关键词 α-烯醇化酶 昆虫杆状病毒表达系统 蛋白表达 酶活性位点缺失
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杆状病毒表达系统表达BCoV纤突蛋白及其对小鼠的免疫原性 被引量：4
7
作者 喻琦胜 朱庆 +6 位作者 周群 宋鑫 张家祺 陈涛云 徐林 张朝辉 张斌 《畜牧兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2024年第2期640-648,共9页
旨在为表达牛冠状病毒(bovine coronavirus,BCoV)的纤突蛋白(S蛋白),并评价其作为免疫原免疫小鼠后的免疫效果。本研究以BCoV/SWUN/HXD-4/2021株的全长S基因为模板,针对昆虫细胞进行密码子优化和合成,构建重组质粒pFastBac-Dual-S,与DH1... 旨在为表达牛冠状病毒(bovine coronavirus,BCoV)的纤突蛋白(S蛋白),并评价其作为免疫原免疫小鼠后的免疫效果。本研究以BCoV/SWUN/HXD-4/2021株的全长S基因为模板,针对昆虫细胞进行密码子优化和合成,构建重组质粒pFastBac-Dual-S,与DH10Bac同源重组后转染昆虫细胞收获重组杆状病毒rpFastBac-S,利用基因组PCR、免疫印迹法(Western blot)和间接免疫荧光试验对其进行鉴定,测定杆状病毒滴度。优化和筛选感染剂量对蛋白表达的影响,超速离心纯化蛋白,免疫小鼠和评估其免疫效果。结果显示:优化后全长4108 bp的BCoV S基因CAI(密码子适应指数)从0.39调整为0.87,平均GC含量从35.8%调整为50.6%。经双酶切、PCR验证,重组质粒与重组杆粒均构建成功。用5μg重组杆粒Bacmid-S转染Sf9细胞并传代至第四代后细胞病变趋于稳定,感染杆状病毒约20 h后产生典型病变,收获重组杆状病毒进行鉴定。PCR电泳结果显示重组杆粒携带S目的蛋白基因;间接免疫荧光试验显示,试验组观察到特异性绿色荧光;Western blot结果显示重组杆状病毒rpFastBac-S所表达的蛋白为S目的蛋白,目的条带位于250 ku左右,感染剂量MOI=0.5时蛋白表达量最高。将50μg蛋白、20μg CpG免疫增强剂与等体积MF59佐剂充分混合乳化后,肌肉注射免疫小鼠,间接ELISA试验结果显示,小鼠免疫蛋白后产生了IgG特异性抗体,且抗体水平高于佐剂对照组(P<0.001),最高抗体效价达1∶12800;微量中和试验结果显示,小鼠血清中和效价最高达1∶224,试验组中和效价平均值高于灭活病毒组,但统计学差异不显著(P>0.05)。本研究利用杆状病毒表达系统表达了牛冠状病毒S蛋白,并对S蛋白免疫保护效果做了进一步评价,为后续牛冠状病毒疫苗研究提供了理论依据。 展开更多
关键词 牛冠状病毒 S蛋白 杆状病毒表达系统 免疫原性
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融合蛋白E^(MP)-VP2在杆状病毒表达系统中的表达与免疫原性鉴定
8
作者 张欣雅 杨扬 +7 位作者 田羽彤 李宗杰 李蓓蓓 刘珂 邵东华 邱亚峰 魏建超 马志永 《中国动物传染病学报》 北大核心 2024年第6期25-35,共11页
日本脑炎病毒(JEV)和猪细小病毒(PPV)是引起猪繁殖障碍的2种重要病原体,严重影响养猪业经济效益。本研究将日本脑炎病毒E基因上的多个B细胞及T细胞抗原表位与猪细小病毒VP2基因进行融合表达,构建pFastBac Dual-E^(MP)-VP2载体,转化到DH1... 日本脑炎病毒(JEV)和猪细小病毒(PPV)是引起猪繁殖障碍的2种重要病原体,严重影响养猪业经济效益。本研究将日本脑炎病毒E基因上的多个B细胞及T细胞抗原表位与猪细小病毒VP2基因进行融合表达,构建pFastBac Dual-E^(MP)-VP2载体,转化到DH10Bac感受态细胞后,通过蓝白斑筛选成功构建了rBacmid E^(MP)-VP2重组杆粒,并在昆虫细胞Sf9中成功拯救了重组杆状病毒,实现了E^(MP)-VP2高效表达。SDS-PAGE和Western blot分析表明,表达产物分子量与预期相符,且可以和JEV及PPV阳性血清反应,表明重组E^(MP)-VP2蛋白具有良好的免疫反应性。表达的蛋白可以通过亲和层析成功纯化,用纯化后的E^(MP)-VP2蛋白免疫小鼠和豚鼠,可以分别激活小鼠和豚鼠JEV和PPV特异性体液免疫反应,证明E^(MP)-VP2蛋白具有免疫原性,为后续JEV和PPV的防控以及二联亚单位疫苗的研发奠定了基础。 展开更多
关键词 日本脑炎病毒 猪细小病毒 杆状病毒表达系统 免疫反应性 免疫原性
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猪传染性胃肠炎病毒S基因杆状病毒/昆虫细胞表达系统重组质粒的构建 被引量：8
9
作者 任晓峰 李一经 +1 位作者 李广兴 刘宝全 《东北农业大学学报》 CAS CSCD 2002年第4期359-363,共5页
用限制性内切酶从克隆质粒pUC—s中回收猪传染性胃肠炎病毒中国分离株,TH-98株完整的病毒保护性抗原基因,即S基因。按照预定的阅读框架,将S基因克隆于供体质粒pFASTBACHTb的EcoRI、PstI多克隆位点上,并进行酶切鉴定,得到阳性重组质粒BAC... 用限制性内切酶从克隆质粒pUC—s中回收猪传染性胃肠炎病毒中国分离株,TH-98株完整的病毒保护性抗原基因,即S基因。按照预定的阅读框架,将S基因克隆于供体质粒pFASTBACHTb的EcoRI、PstI多克隆位点上,并进行酶切鉴定,得到阳性重组质粒BAC—S。用DH10BAC对BAC—S进行转位,获得重组质粒pBAC—S。根据S基因酶切位点分析结果及杆状病毒(Bac-ulovirus)转位区结构特点,用相应的限制性内切酶进行酶切鉴定,并用特异性和通用引物进行PCR分析,证明该重组质粒为含有TH-98株完整S基因的可直接在昆虫细胞进行表达的感染性重组质粒。 展开更多
关键词 猪 传染性胃肠炎病毒 S基因 杆状病毒 昆虫细胞 表达系统 重组质粒
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利用昆虫-杆状病毒表达系统制备HPV16E6蛋白 被引量：5
10
作者 郑瑾 任斐 +2 位作者 余翔 来宝长 王一理 《西北大学学报（自然科学版）》 CAS CSCD 北大核心 2008年第5期775-778,共4页
目的利用昆虫-杆状病毒表达系统高效表达HPV16E6蛋白。方法将HPV16E6基因克隆入供体质粒pFastBac-HTb,然后再重组入杆状病毒基因组;用带有目的基因的杆状病毒转染昆虫(Sf-9)细胞,27℃培养72 h,收集被转染细胞,SDS-PAGE,Western-blot分... 目的利用昆虫-杆状病毒表达系统高效表达HPV16E6蛋白。方法将HPV16E6基因克隆入供体质粒pFastBac-HTb,然后再重组入杆状病毒基因组;用带有目的基因的杆状病毒转染昆虫(Sf-9)细胞,27℃培养72 h,收集被转染细胞,SDS-PAGE,Western-blot分析鉴定表达蛋白。结果SDS-PAGE分析显示所表达蛋白分子量约为24KD,Western-blot结果表明表达产物为HPV16E6蛋白。结论利用昆虫杆状病毒表达系统获得HPV16E6蛋白的高效表达。 展开更多
关键词 昆虫杆状病毒表达系统 重组DAN技术 HPV16E6
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昆虫杆状病毒表达系统研究进展及其应用展望 被引量：17
11
作者 朱江 吴祥甫 《蚕业科学》 CAS CSCD 2003年第2期114-119,共6页
昆虫杆状病毒表达系统作为四大表达系统之一,已广泛应用于重组蛋白的合成。该系统具有如多角体启动子控制下的高效表达,比较完善的转译后加工修饰,容易从无血清培养上清中纯化,无内毒素污染等特点。杆状病毒表达载体系统研究的最新进展... 昆虫杆状病毒表达系统作为四大表达系统之一,已广泛应用于重组蛋白的合成。该系统具有如多角体启动子控制下的高效表达,比较完善的转译后加工修饰,容易从无血清培养上清中纯化,无内毒素污染等特点。杆状病毒表达载体系统研究的最新进展:高强度早期启动子群杆状病毒转移载体的成功合成,以扩大寄主范围和增进重组蛋白稳定性为目的的亲本病毒的改造;通用的昆虫细胞培养基配方的不断优化,特定昆虫细胞株培养基的研制和适用于大规模悬浮培养的无血清培养基的商品化;旨在进行复杂糖基化及提供相对稳定细胞环境的宿主细胞工程;以新标记物(tag)载体和相关亲和层析方法为代表的蛋白质高效纯化方法的进步。昆虫杆状病毒表达载体系统在基础研究、医药卫生和农业上具有广阔的应用前景。 展开更多
关键词 昆虫杆状病毒表达系统 研究进展 应用 改进 蛋白质 昆虫细胞培养 纯化
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鸭圆环病毒Cap基因在昆虫细胞杆状病毒系统中的表达及鉴定 被引量：4
12
作者 张兴晓 邹金峰 +4 位作者 相琪旺 王鑫 陈琳 谢之景 姜世金 《西北农业学报》 CAS CSCD 北大核心 2012年第3期7-11,共5页
通过PCR方法扩增完整的鸭圆环病毒Cap基因,按正确的阅读框架将其克隆入pFastBacTM HTB杆状病毒载体,将筛选的阳性重组载体pF-CP转化至含有杆状病毒穿梭载体和辅助载体的DH10Bac大肠杆菌感受态细胞,经过蓝白斑筛选和PCR鉴定,获得重组表... 通过PCR方法扩增完整的鸭圆环病毒Cap基因,按正确的阅读框架将其克隆入pFastBacTM HTB杆状病毒载体,将筛选的阳性重组载体pF-CP转化至含有杆状病毒穿梭载体和辅助载体的DH10Bac大肠杆菌感受态细胞,经过蓝白斑筛选和PCR鉴定,获得重组表达载体rBacmid-CP。在脂质体的介导下转染Sf9昆虫细胞,72h后获得重组杆状病毒。Western blot和间接免疫荧光(IFA)试验结果表明,表达的蛋白与原核表达Cap蛋白免疫小鼠采集的血清具有良好的反应原性,为进一步研究Cap蛋白的功能奠定基础。 展开更多
关键词 鸭圆环病毒 Cap基因 昆虫细胞-杆状病毒表达系统 IFA
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意大利蜜蜂蜂毒磷脂酶A_2基因在杆状病毒-昆虫细胞系统中的表达 被引量：4
13
作者 沈立荣 邢丽苹 +1 位作者 张传溪 程家安 《昆虫学报》 CAS CSCD 北大核心 2006年第3期367-372,共6页
利用BactoBac系统将意大利蜜蜂蜂毒磷脂酶A2(AmPLA2)基因cDNA克隆至转移载体pFastBacHTa中,得到pBacHT-AmPLA2,再将其转化入含穿梭载体Bacmid的受体大肠杆菌DH10Bac中,通过转座作用,得到含AmPLA2基因的重组病毒rBacmid-AmPLA2的DNA。提... 利用BactoBac系统将意大利蜜蜂蜂毒磷脂酶A2(AmPLA2)基因cDNA克隆至转移载体pFastBacHTa中,得到pBacHT-AmPLA2,再将其转化入含穿梭载体Bacmid的受体大肠杆菌DH10Bac中,通过转座作用,得到含AmPLA2基因的重组病毒rBacmid-AmPLA2的DNA。提取其基因组DNA,用脂质体介导转染粉纹夜蛾细胞Tn-5B1-4,得到重组病毒rACV-Bac-AmPLA2。用此重组病毒感染Tn-5B1-4细胞,在细胞中表达AmPLA2。SDS-PAGE电泳结果显示,与6×HisTag融合表达的产物蛋白分子量约为18kD左右,表达量约占细胞总蛋白的5·35%。Westernblot印迹显示,融合表达产物能与意大利蜜蜂蜂毒AmPLA2抗血清发生免疫反应。生物活性测定显示,含表达产物的细胞蛋白粗提物对底物蛋黄的酶活力约为6·13μmol·min-1·mg-1。 展开更多
关键词 意大利蜜蜂 蜂毒 磷脂酶A2基因 杆状病毒-昆虫细胞系统 表达
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鳜弹状病毒糖蛋白在杆状病毒表达系统中的表达与鉴定
14
作者 张彦冰 叶加鑫 +2 位作者 孙威 刘晓丹 林强 《水产科学》 CAS CSCD 北大核心 2024年第2期281-288,共8页
近年来,鳜弹状病毒引起的病害频发,该病毒传播快,致病性强,是引起鳜病害的主要病原之一。鳜弹状病毒基因组编码5个结构蛋白,其中糖蛋白G是病毒表面的主要抗原,为实现该抗原蛋白的大量表达,利用分子克隆技术将鳜弹状病毒糖蛋白G片段插入... 近年来,鳜弹状病毒引起的病害频发,该病毒传播快,致病性强,是引起鳜病害的主要病原之一。鳜弹状病毒基因组编码5个结构蛋白,其中糖蛋白G是病毒表面的主要抗原,为实现该抗原蛋白的大量表达,利用分子克隆技术将鳜弹状病毒糖蛋白G片段插入杆状病毒穿梭载体pFastBac1中转化至大肠杆菌DH5α感受态细胞后,筛选阳性克隆获得重组转移载体pFastBac-G,再将其转化至大肠杆菌DH10Bac感受态细胞,经蓝白斑与抗性筛选后获取重组杆粒rBacmid-G,随后利用脂质体转染法将重组杆粒转染Sf9昆虫细胞制备重组杆状病毒。将获取到的P3代重组病毒感染Sf9昆虫细胞进行重组蛋白的SDS-PAGE检测,成功表达后利用镍离子亲和层析柱纯化目的蛋白,随后对重组蛋白进行Western blot鉴定,结果显示在大于50 ku处有一条特异性条带,而对照组无条带,表明制备的抗原能与抗体特异性结合。结果表明,鳜弹状病毒糖蛋白G在杆状病毒表达系统成功表达。本试验结果可为鳜弹状病毒糖蛋白G疫苗的研发和大规模生产提供技术支撑。 展开更多
关键词 鳜弹状病毒 糖蛋白 杆状病毒表达系统 重组杆状病毒
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昆虫杆状病毒表达系统的研究进展 被引量：11
15
作者 朱帮福 卢兹凡 《细胞与分子免疫学杂志》 CAS CSCD 北大核心 2002年第6期681-684,共4页
关键词 杆状病毒 研究进展 昆虫细胞表达系统 生物学特性 病毒载体
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HSV-2糖蛋白D在昆虫-杆状病毒表达系统中的表达及免疫原性分析 被引量：3
16
作者 刘微 罗晓华 +7 位作者 陈文婧 董媛 朱洁 郭健 姜勇 张磊 孟桂先 王会岩 《吉林大学学报（医学版）》 CAS CSCD 北大核心 2017年第4期720-724,共5页
目的:在昆虫细胞中表达2型单纯疱疹病毒(HSV-2)糖蛋白D(gD2)胞外区基因,检测其免疫原性。方法:以HSV-2病毒基因组为模板,PCR扩增得到gD2片段,构建至杆状病毒质粒Bacmind中,转染sf9细胞,包装重组杆状病毒,收集后连续感染sf9细胞,收获第4... 目的:在昆虫细胞中表达2型单纯疱疹病毒(HSV-2)糖蛋白D(gD2)胞外区基因,检测其免疫原性。方法:以HSV-2病毒基因组为模板,PCR扩增得到gD2片段,构建至杆状病毒质粒Bacmind中,转染sf9细胞,包装重组杆状病毒,收集后连续感染sf9细胞,收获第4代重组杆状病毒(P4),通过Western blotting法鉴定蛋白表达情况,采用空斑实验检测重组病毒滴度,将P4代重组病毒作为种子大量感染sf9细胞,上清经镍柱亲和层析进行纯化,将纯化后的蛋白在第0、2和4周免疫BALB/c小鼠(gD2组),以PBS作为阴性对照(PBS组),ELISA检测小鼠血清中gD2特异性IgG滴度。结果:PCR鉴定和DNA测序,重组表达质粒gD2-Bacmind构建正确,空斑实验检测重组病毒滴度为2.0×109 pfu·mL-1,纯化的gD2重组蛋白在相对分子质量37 000处出现目标条带,纯度达90%以上。第6周gD2组小鼠免疫血清中gD2特异性IgG抗体滴度Log10平均值达到4.34,与PBS组比较差异有统计学意义(P<0.01)。结论:利用昆虫-杆状病毒表达系统表达的gD2胞外区蛋白具有良好的免疫原性,可作为HSV-2疫苗的候选。 展开更多
关键词 生殖器疱疹 疱疹病毒2型 人 糖蛋白D 昆虫-杆状病毒表达系统
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仙台病毒F基因在昆虫/杆状病毒系统中的表达及抗原性分析 被引量：5
17
作者 曲连东 蒋良丰 +6 位作者 刘家森 司昌德 郭东春 姜骞 林欢 韩凌霞 刘娣 《中国预防兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2010年第5期347-350,共4页
为真核表达仙台病毒(SeV)融合蛋白(F)基因,本研究根据GenBank登录的SeV F基因序列设计合成一对特异性引物,以pMD18-T-F阳性重组质粒为模板扩增F基因,并将其克隆至杆状病毒穿梭质粒pFastBac HTa中,经酶切、PCR及测序鉴定正确后,转化感受... 为真核表达仙台病毒(SeV)融合蛋白(F)基因,本研究根据GenBank登录的SeV F基因序列设计合成一对特异性引物,以pMD18-T-F阳性重组质粒为模板扩增F基因,并将其克隆至杆状病毒穿梭质粒pFastBac HTa中,经酶切、PCR及测序鉴定正确后,转化感受态细胞DH10Bac,提取重组杆粒rBacmid-F,经PCR鉴定正确将rBacmid-F转染Sf9细胞,连续传代后,细胞病变明显。经SDS-PAGE分析,成功表达了相对分子量为65ku左右的F蛋白,western blot和ELISA分析表明重组F蛋白具有良好的抗原性。 展开更多
关键词 仙台病毒 F基因 重组杆状病毒表达系统
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昆虫杆状病毒表达系统在病毒性家禽疾病研究中的应用进展 被引量：3
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作者 孙新宽 宋丽丽 +2 位作者 韦平 韦天超 磨美兰 《中国家禽》 北大核心 2014年第1期39-43,共5页
昆虫杆状病毒表达系统作为四大表达系统之一,具有安全性高、对外源基因克隆容量大、重组病毒易于筛选、具有完备的翻译后加工修饰系统和高效表达外源基因的能力等特点,已成功表达了近千种高价值蛋白,在很多领域都得到较广泛的应用。本... 昆虫杆状病毒表达系统作为四大表达系统之一,具有安全性高、对外源基因克隆容量大、重组病毒易于筛选、具有完备的翻译后加工修饰系统和高效表达外源基因的能力等特点,已成功表达了近千种高价值蛋白,在很多领域都得到较广泛的应用。本文对该表达系统在主要病毒性家禽疾病方面的相关应用研究进展进行综述,旨在为相关研究提供参考。 展开更多
关键词 昆虫杆状病毒 表达 家禽病毒病 应用
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ORFV-Yulin株的分离鉴定及其B2L基因在昆虫杆状病毒系统中的表达 被引量：3
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作者 冯平 李云章 +2 位作者 孙丰廷 屈雷 闫海龙 《西北农林科技大学学报（自然科学版）》 CSCD 北大核心 2017年第9期32-38,共7页
【目的】从榆林市具有典型羊口疮症状的陕北白绒山羊唇结痂病料中分离羊口疮病毒(Orf virus,ORFV),克隆分析其B2L基因序列,并通过昆虫杆状病毒表达B2L基因。【方法】利用牛肾传代细胞进行ORFV的分离培养,通过PCR的方法从分离到的病毒中... 【目的】从榆林市具有典型羊口疮症状的陕北白绒山羊唇结痂病料中分离羊口疮病毒(Orf virus,ORFV),克隆分析其B2L基因序列,并通过昆虫杆状病毒表达B2L基因。【方法】利用牛肾传代细胞进行ORFV的分离培养,通过PCR的方法从分离到的病毒中扩增出B2L全长基因,测序后进行序列及遗传进化分析。利用扩增所得的B2L基因构建昆虫杆状病毒表达载体,包装出杆状病毒后侵染sf9细胞,并通过SDS-PAGE、Western-blot以及质谱鉴定等方法验证目的基因的表达情况。【结果】成功分离出1株羊口疮病毒,命名为ORFV-Yulin株;扩增的B2L全长基因长度为1 137bp,与Hub13和GY-AHF10株亲缘关系最近,核苷酸序列和氨基酸序列的相似性分别为99%和99.2%。通过昆虫杆状病毒表达系统成功表达了B2L基因,获得了47ku的重组蛋白。【结论】从榆林市陕北白绒山羊中获得了羊口疮病毒分离株(ORFV-Yulin);通过昆虫杆状病毒表达系统成功表达了ORFV-Yulin株的B2L基因。 展开更多
关键词 羊口疮病毒 B2L基因 昆虫杆状病毒表达系统
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羊口疮病毒榆林株B2L和F1L串联基因在昆虫杆状病毒系统的表达 被引量：4
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作者 冯平 李云章 +2 位作者 孙丰廷 屈雷 闫海龙 《西北农林科技大学学报（自然科学版）》 CSCD 北大核心 2018年第6期1-8,共8页
【目的】克隆分析羊口疮病毒(ORFV)榆林株(ORFV-Yulin)的F1L基因序列,通过昆虫杆状病毒表达B2L和F1L串联基因。【方法】采用PCR方法扩增ORFV-Yulin株F1L全长基因,测序后对其进行序列分析和遗传进化分析。扩增ORFV-Yulin株B2L融合基因(r ... 【目的】克隆分析羊口疮病毒(ORFV)榆林株(ORFV-Yulin)的F1L基因序列,通过昆虫杆状病毒表达B2L和F1L串联基因。【方法】采用PCR方法扩增ORFV-Yulin株F1L全长基因,测序后对其进行序列分析和遗传进化分析。扩增ORFV-Yulin株B2L融合基因(r B2L)和F1L融合基因(c F1L),利用碱基linker连接,通过重叠PCR方法扩增获得ORFV r B2L-linker-c F1L重组基因(r B2Lc F1L),将其与昆虫杆状病毒表达载体pBac5连接构建表达载体pBac-rB2LcF1L。将pBac-rB2LcF1L包装出杆状病毒,侵染sf9细胞,通过SDS-PAGE、Western-blotting以及质谱鉴定等方法验证目的基因r B2Lc F1L的表达。【结果】克隆获得了1 029bp的F1L全长基因,该基因高度保守,与FJ-MH2015株的序列相似性最高,核苷酸和氨基酸的相似性分别为99.0%和99.4%。系统进化分析表明,ORFV-Yulin株与XP(KU199840.1)、FJ-MH2015(KM675409.1)以及Shanxi(HQ221964.1)株同处于一个分支。PCR扩增获得了855bp的c F1L基因、1 180bp的r B2L基因及1 983bp的r B2Lc F1L基因,成功构建了pBacrB2LcF1L载体,并包装出相应的杆状病毒。B2L和F1L串联基因通过昆虫杆状病毒表达系统获得成功表达,表达产物的分子质量为80ku,且有部分重组蛋白能分泌到细胞培养基中。【结论】ORFV-Yulin株的B2L和F1L串联基因在昆虫杆状病毒系统表达成功。 展开更多
关键词 羊口疮病毒 F1L基因 F1L+B2L串联表达 昆虫杆状病毒 基因表达
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