脑脊液细胞中结核早期分泌性靶抗原6的检测及其早期诊断价值 被引量：7

1

作者 职瑾 史明 +6 位作者 冯国栋 杨毅宁 代文 刘婷婷 边婷 袁子文 赵钢 《细胞与分子免疫学杂志》 CAS CSCD 北大核心 2015年第3期387-390,共4页

目的探讨免疫荧光染色法检测脑脊液细胞中结核早期分泌性靶抗原6(ESAT-6)对结核性脑膜炎诊断的价值。方法收集36例确诊结核性脑膜炎患者的脑脊液为病例组,45例非结核性脑膜炎患者脑脊液为对照组。用双盲法对2组脑脊液细胞进行ESAT-6免... 目的探讨免疫荧光染色法检测脑脊液细胞中结核早期分泌性靶抗原6(ESAT-6)对结核性脑膜炎诊断的价值。方法收集36例确诊结核性脑膜炎患者的脑脊液为病例组,45例非结核性脑膜炎患者脑脊液为对照组。用双盲法对2组脑脊液细胞进行ESAT-6免疫荧光染色,统计分析灵敏度和特异度等。结果病例组ESAT-6存在于中性粒细胞、单核细胞及淋巴细胞中,对照组脑脊液细胞中无ESAT-6表达。灵敏度为88.89%、特异度为93.33%;阳性预测值为91.43%、阴性预测值为91.30%;阳性似然比为13.33、阴性似然比为0.12;Youden指数为82.22%,ROC曲线下面积为0.94。结论免疫荧光染色检测脑脊液细胞中ESAT-6的灵敏度及特异度均较高,是结核性脑膜炎诊断的有效方法。 展开更多

关键词 免疫荧光染色法 早期分泌性靶抗原6 结核性脑膜炎 诊断

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6 kD早期分泌型抗原靶点(ESAT6)抑制巨噬细胞的自噬并促进BCG的增殖 被引量：1

2

作者 徐雪维 赵润鹏 +5 位作者 张荣波 吴静 胡东 邢应如 倪升发 铁保贤 《细胞与分子免疫学杂志》 CAS CSCD 北大核心 2017年第3期310-314,共5页

目的 6 kD早期分泌型抗原靶点(ESAT6)能够促进卡介苗(BCG)的增殖,巨噬细胞的自噬功能能有效杀伤BCG,研究ESAT6与自噬的相互作用,为揭示ESAT6介导的免疫逃逸提供实验依据。方法分别观察对照质粒pCMV-HA和重组质粒pCMV-HA-ESAT6转染以及Ea... 目的 6 kD早期分泌型抗原靶点(ESAT6)能够促进卡介苗(BCG)的增殖,巨噬细胞的自噬功能能有效杀伤BCG,研究ESAT6与自噬的相互作用,为揭示ESAT6介导的免疫逃逸提供实验依据。方法分别观察对照质粒pCMV-HA和重组质粒pCMV-HA-ESAT6转染以及Earle平衡盐溶液(EBSS)处理的小鼠RAW264.7巨噬细胞中BCG的生长情况,Western blot法检测转染pCMV-HA-ESAT6的RAW264.7细胞0、8、12、24、32 h后,微管相关蛋白1轻链3(LC3)蛋白水平。转染pCMV-HA、pCMV-HA-ESAT6、氯喹(CQ)单独处理和CQ与pCMV-HA-ESAT6转染联合处理条件下,Western blot法检测LC3的水平,Lyso Tracker Red染料法计数溶酶体数量,观察罗琴培养基上BCG的情况。结果 pCMV-HA-ESAT6转染的RAW264.7细胞中BCG的生长旺盛,而EBSS处理组生长受抑制;在0、8、12、24、32 h,pCMV-HA-ESAT6转染的RAW264.7细胞中LC3Ⅰ向LC3Ⅱ转换逐渐增强;与对照组相比,溶酶体荧光探针Lyso Tracker Red染色法显示pCMV-HA-ESAT6、CQ以及CQ与pCMV-HA-ESAT6转染处理组的溶酶体较多且体积大,但后三组间均无显著性差异;pCMV-HA-ESAT6、CQ以及CQ与pCMV-HA-ESAT6转染处理组的BCG生长旺盛。结论 ESAT6抑制RAW264.7细胞内的自噬水平,并且能够促进RAW264.7细胞中感染BCG的生长。 展开更多

关键词 早期分泌型抗原靶点6(ESAT6) 巨噬细胞 自噬 卡介苗(BCG)

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抗原85B-6kDa早期分泌靶抗原(Ag85B-ESAT-6)亚单位疫苗黏膜免疫对结核分枝杆菌的免疫应答 被引量：5

3

作者 宁唤唤 张芳琳 +7 位作者 康健 王立飞 路延之 任瑞 白鹭 梁璇 谢燕玲 柏银兰 《细胞与分子免疫学杂志》 CAS CSCD 北大核心 2022年第10期886-892,共7页

目的评价抗原85B-6kDa早期分泌靶抗原融合蛋白(AE)亚单位疫苗经黏膜免疫小鼠诱导的免疫应答及其对结核分枝杆菌(MTB)感染的保护力。方法分别用AE、AE联合环二腺苷酸(c-di-AMP)亚单位疫苗经鼻黏膜免疫小鼠,ELISA检测抗体水平以及1型辅助T... 目的评价抗原85B-6kDa早期分泌靶抗原融合蛋白(AE)亚单位疫苗经黏膜免疫小鼠诱导的免疫应答及其对结核分枝杆菌(MTB)感染的保护力。方法分别用AE、AE联合环二腺苷酸(c-di-AMP)亚单位疫苗经鼻黏膜免疫小鼠,ELISA检测抗体水平以及1型辅助T(Th1)细胞的细胞因子γ干扰素(IFN-γ)、白细胞介素2(IL-2)和Th2细胞的IL-10分泌水平,实时荧光定量PCR检测IFN-γ、IL-2、IL-10和肿瘤坏死因子α(TNF-α)的mRNA水平。MTB静脉感染免疫小鼠,ELISA检测感染小鼠血清抗体及脾细胞细胞因子分泌水平,HE染色分析肺病理改变,平板法计数菌落形成单位(CFU)检测脾和肺荷菌数。结果AE和AE联合c-di-AMP经鼻黏膜免疫可诱导小鼠产生高水平的特异性抗体,促进脾细胞增殖、脾和肺脏Th1/Th2型细胞因子和TNF-α转录增加、脾Th1/Th2型细胞因子分泌增加。小鼠MTB感染后,与对照组相比,AE和AE联合c-di-AMP免疫小鼠特异性抗体水平仍升高,Th1/Th2型细胞免疫应答增强,肺组织呈炎症反应,肺、脾荷菌数显著降低,且AE联合c-di-AMP免疫小鼠肺、脾荷菌数进一步降低。结论AE亚单位疫苗经黏膜接种可诱导小鼠产生体液与细胞免疫应答,并提供对MTB感染的保护力;c-di-AMP为佐剂可在一定程度上提高AE的免疫原性。 展开更多

关键词 结核分枝杆菌(MTB) 亚单位疫苗 抗原85B(Ag85B) 6kDa早期分泌靶抗原(ESAT-6) 环二腺苷酸(c-di-AMP) 黏膜免疫

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PstS1-ESAT-6抗原血清学和γ-干扰素释放试验辅助诊断结核病的价值 被引量：5

4

作者 何秀云 黄香玉 +5 位作者 朱传智 陈红兵 张翠英 肖漓 高钰 孔祥瑞 《中国防痨杂志》 CAS 2016年第10期805-812,共8页

目的分析重组融合蛋白PstS1-ESAT-6抗原血清学和r干扰素释放试验辅助诊断结核病的潜在价值。方法选取40只无特定病原体（specific pathogen free，SPF）级BALB／c小鼠和18只SPF级豚鼠，均分别注射卡介苗（BCG）或热灭活结核分枝杆菌。... 目的分析重组融合蛋白PstS1-ESAT-6抗原血清学和r干扰素释放试验辅助诊断结核病的潜在价值。方法选取40只无特定病原体（specific pathogen free，SPF）级BALB／c小鼠和18只SPF级豚鼠，均分别注射卡介苗（BCG）或热灭活结核分枝杆菌。选取解放军第三0九医院全军结核病研究所于2012年3—8月收治入院的129例结核病患者（结核病组）、54例非结核性肺部相关疾病患者（非结核病组）和194名健康者（健康对照组）作为研究对象。研究对象均采集外周静脉血。外周血单个核细胞（PBMC）和免疫的小鼠脾淋巴细胞经重组融合蛋白PstS1-ESAT-6体外刺激，应用酶联免疫斑点法（ELISPOT）检测经抗原刺激后释放r干扰素（IFN-γ）的效应T淋巴细胞即斑点形成细胞（SFC）；应用酶联免疫吸附法（ELISA）检测外周血血浆和免疫小鼠血清抗重组融合蛋白PstS1-ESAT-6的IgG；应用孟都法（Mantoux）检测健康者BCG-PPD皮试、免疫豚鼠BCG-PPD皮试及重组融合蛋白PstS1-ESAT-6皮试。结果结核病组PBMC体外经重组融合蛋白PstS1-ESAT-6刺激，分泌IFN-γ的SFC数为（45．02±68．03）／z．5x10。个PBMC，高于非结核病组的（11．87±38．63）／2．5×10。个PBMC和健康对照组的（5．24±15．46）／2．5×10。个PBMC（F=32．96，P=0．000）。ELISPOT诊断结核病患者的敏感度为82．2％（106／lZ9），诊断非结核病组患者和健康者的特异度分别为87．0％（47／54）和90．2％（175／194），两者特异度比较差异无统计学意义（χ^2=0.45，P=0．500）。结核病组血浆中抗重组融合蛋白PstS1-ESAT-6的IgG水平（平均A492值为0.82±0.66）高于非结核病组[平均A492值为（0.60±0.30）]和健康对照组[平均A492为（0．36±0．20）1（F=43．60，P=0.000）；ROC分析确定检测临界值为0.49，其用于诊断结核病的敏感度为62．2％（69／111）、诊断非结核病组的特异度为40．4％（19／47）、诊断健康者的特异度为84．5％（164／192），诊断非结核病组与健康组的特异度比较，差异有统计学意义（χ^2=42．60，P〈0．01）。热灭活结核分枝杆菌免疫豚鼠均产生BCG-PPD和重组融合蛋白PstS1-ESAT-6皮试反应，所有豚鼠皮肤出现红肿或硬结平均直径〉5mm；热灭活结核分枝杆菌免疫小鼠，重组融合蛋白PstS1-ESAT-6的ELISPOT和ELISA检测均为阴性。BCG免疫豚鼠只产生BCG-PPD皮试反应，硬结平均直径为（10．08±0．36）mm，不产生重组融合蛋白PstS1-ESAT-6皮试反应；BCG免疫小鼠，重组融合蛋白PstS1-ESAT-6的ELISPOT检测阴性，而ELISA检测为阳性。结论ELISPOT用于结核病诊断优于血清学诊断，但其诊断活动I生结核病价值还需进一步论证。 展开更多

关键词 结核 早期分泌抗原靶6 结核菌素试验 酶联免疫斑点检测 酶联免疫吸附测定 对比研究

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结核分枝杆菌CFP10-ESAT6融合蛋白免疫小鼠效果初步评价 被引量：2

5

作者 栾秀丽 范雪亭 +9 位作者 王瑞欢 李马超 于晋杰 钱程宇 曹斌 赵秀芹 刘志广 刘海灿 李桂莲 万康林 《中国人兽共患病学报》 CAS CSCD 北大核心 2022年第7期589-596,共8页

目的融合表达和纯化结核分枝杆菌(MTB)CFP10-ESAT6(CE),初步评价免疫效果。方法构建pET32a(+)-CE重组质粒,E.coli BL21(DE3)中融合表达,Ni-NTA层析纯化。用CE加铝佐剂,50μg CE/只/次,分3次免疫BALB/c小鼠。ELISA测定血清IgG抗体;ELISpo... 目的融合表达和纯化结核分枝杆菌(MTB)CFP10-ESAT6(CE),初步评价免疫效果。方法构建pET32a(+)-CE重组质粒,E.coli BL21(DE3)中融合表达,Ni-NTA层析纯化。用CE加铝佐剂,50μg CE/只/次,分3次免疫BALB/c小鼠。ELISA测定血清IgG抗体;ELISpot与Luminex检测细胞因子,进行MTB体外生长抑制试验。卡介苗(BCG)为阳性对照。结果CE免疫小鼠,能诱导产生高效价的IgG、IgG1和IgG2a,且IgG1(t=19.1,P<0.0001)和IgG2a(t=8.7,P<0.0001)抗体水平均高于BCG组。CE组与BCG组诱导产生的分泌IFN-γ的斑点形成细胞(SFC)数量差异无统计学意义(t=0.4,P>0.05),但诱导分泌IL-4的SFC数量高于BCG组(t=8.0,P<0.0001)。CE组诱导分泌GM-CSF(t=8.4,P<0.05)、IL-6(t=8.3,P<0.05)、IL-10(t=2.5,P<0.05)和IL-4(t=7.0,P<0.05)均高于BCG组,而CE组诱导分泌IFN-γ(t=1.4,P>0.05)、TNF-α(t=1.8,P>0.05)、IL-2(t=2.0,P>0.05)、IL-12(t=0.9,P>0.05)和IL-17(t=1.3,P>0.05)均与BCG组相似,差异无统计学意义。CE组小鼠脾细胞的MTB体外生长抑制结果与BCG组相似(t=0.8,P>0.05)。结论CE免疫小鼠可诱导较强的Th1与Th2混合型免疫反应,且有较强的体外抑制MTB生长的能力,表明CE具有良好的结核疫苗研制应用价值。 展开更多

关键词 结核分枝杆菌 培养滤液蛋白10 早期分泌抗原靶6 重组融合蛋白CE 疫苗

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脑脊液单核细胞内ESAT-6对结核性脑膜炎的诊断价值 被引量：5

6

作者 杨笑 郭旻 谢鹏 《中国神经精神疾病杂志》 CAS CSCD 北大核心 2012年第6期330-333,共4页

目的通过检测结核性脑膜炎(tuberculous meningitis,TBM)患者脑脊液单核细胞中的早期分泌抗原靶蛋白6(early secreted antigenic target,ESAT-6),探讨ESAT-6在TBM诊断中的价值。方法将42例TBM患者与47例对照组患者进行脑脊液生化、细胞... 目的通过检测结核性脑膜炎(tuberculous meningitis,TBM)患者脑脊液单核细胞中的早期分泌抗原靶蛋白6(early secreted antigenic target,ESAT-6),探讨ESAT-6在TBM诊断中的价值。方法将42例TBM患者与47例对照组患者进行脑脊液生化、细胞学、抗酸染色检查,同时用免疫荧光细胞化学染色法检测脑脊液单核细胞内的ESAT-6。结果在临床诊断TBM的42例患者中有38例脑脊液单核细胞中检出ESAT-6,47例对照组中检出4例。TBM组ESAT-6的检出率明显高于对照组(P<0.05)。该方法诊断TBM的敏感性为90.48%,特异性为91.49%。约登指数达到0.82。结论检测脑脊液单核细胞内结核特异性抗原ESAT-6用于诊断TBM,具有灵敏度、特异度高的特点,而且简单易行,有望成为诊断TBM的一种新的辅助方法。 展开更多

关键词 结核性脑膜炎 脑脊液 早期分泌抗原靶蛋白6

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结核分枝杆菌Hsp65-Esat6与hGM-CSF联合DNA疫苗的构建与体外研究 被引量：1

7

作者 王森林 张梦媛 +2 位作者 王学坤 周曙光 江振友 《暨南大学学报（自然科学与医学版）》 CAS CSCD 北大核心 2016年第1期29-35,共7页

目的:应用分子生物学技术,构建p IHsp65-Esat6GM共表达质粒,并在真核细胞中表达.方法:以p EGHsp65Esat-6为模板经聚合酶链反应(PCR)扩增出Hsp65-Esat6基因,同时从质粒p ORF-h GM-CSF中扩增出基因佐剂h GM-CSF,分别克隆到真核表达载体p I... 目的:应用分子生物学技术,构建p IHsp65-Esat6GM共表达质粒,并在真核细胞中表达.方法:以p EGHsp65Esat-6为模板经聚合酶链反应(PCR)扩增出Hsp65-Esat6基因,同时从质粒p ORF-h GM-CSF中扩增出基因佐剂h GM-CSF,分别克隆到真核表达载体p IRES的多克隆位点A(MCSA)和B(MCSB)中,构建p IHsp65-Esat6GM共表达质粒,并转染Hep G-2细胞中表达和检测.结果:酶切鉴定提示插入的基因片段大小分别为1.93 kb和0.47kb,测序分析表明克隆的Hsp65-Esat6和人粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(h GM-CSF)序列与Gen Bank上公布序列完全一致;Western-bolt检测到Hsp65-Esat6融合蛋白相对分子质量(Mr)为75 000 k Da;RT-PCR方法检测出p IGM,p IHsp65GM和p IHsp65-Esat6GM转染组细胞均有h GM-CSF mRNA表达,三组细胞中h GM-CSF基因mRNA的表达量差异无统计学意义(P>0.05).ELISA方法检测到p IHsp65-Esat6GM转染组细胞培养上清中h GM-CSF的表达,且与空载体对照组比较差异有统计学意义(P<0.01).结论:成功构建和表达了p IHsp65-Esat6GM质粒,为研制优于卡介苗(BCG)的新型抗结核病的DNA疫苗奠定了基础. 展开更多

关键词 热休克蛋白65kd-早期分泌性抗原靶6kd 人粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子 双顺反子 基因佐剂

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ESAT-6刺激结核患者CD4^+ T淋巴细胞前后释放IFN-γ mRNA差异表达及信号通路变化 被引量：1

8

作者 张焰 王晓玮 +1 位作者 程筱雯 徐元宏 《安徽医科大学学报》 CAS 北大核心 2016年第12期1727-1732,共6页

目的利用全基因组表达谱芯片对早期分泌靶向抗原6(ESAT-6)刺激结核患者外周血CD4^+T淋巴细胞前后释放γ-干扰素(IFN-γ)mRNA进行检测,并对mRNA在刺激过程中可能涉及到的信号通路变化进行分析。方法抽取3例初诊结核患者外周静脉血各10 ml... 目的利用全基因组表达谱芯片对早期分泌靶向抗原6(ESAT-6)刺激结核患者外周血CD4^+T淋巴细胞前后释放γ-干扰素(IFN-γ)mRNA进行检测,并对mRNA在刺激过程中可能涉及到的信号通路变化进行分析。方法抽取3例初诊结核患者外周静脉血各10 ml,密度梯度离心法分离获得外周血单个核细胞(PBMC),ESAT-6刺激PBMC,6 h后磁珠法分选CD4^+T淋巴细胞,提取细胞总RNA,全基因组表达谱芯片检测刺激前后差异表达基因。利用GO分析对差异表达的基因进行功能分类,KEGG进行信号通路分析。结果 ESAT-6刺激后差异表达的mRNA共有2 297条,相对高表达的mRNA有1 071条,相对低表达的mRNA有1 226条(>2倍变化且P<0.05)。信号通路分析显示差异表达的mRNA参与了17条信号通路的调控,其中JAK-STAT信号通路、Toll样受体信号通路、NF-κB信号通路、MAPK信号通路、PI3K-Akt信号通路等5条信号通路与结核释放IFN-γ关系密切。结论 ESAT-6刺激后的CD4^+T淋巴细胞有大量mRNA发生差异表达,其在多个与结核释放IFN-γ密切相关的信号通路中发挥着重要的调控作用。 展开更多

关键词 早期分泌靶向抗原6 Γ-干扰素 基因芯片 信号通路 结核

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小鼠巨噬细胞内表达结核分枝杆菌CFP10-ESAT6融合蛋白对细胞增殖和凋亡的影响 被引量：6

9

作者 任琳 李轶 +2 位作者 王山梅 师娟 郭思 《中国病理生理杂志》 CAS CSCD 北大核心 2013年第10期1809-1814,共6页

目的:建立培养滤液蛋白10-早期分泌性抗原靶6(CFP10-ESAT6)真核表达质粒并转染RAW264.7巨噬细胞,观察胞内表达CFP10-ESAT6对细胞活性及凋亡的影响,并初步探讨其机制。方法:将CFP10-ESAT6融合基因插入真核表达质粒pEGFP-N1,构建重组质粒... 目的:建立培养滤液蛋白10-早期分泌性抗原靶6(CFP10-ESAT6)真核表达质粒并转染RAW264.7巨噬细胞,观察胞内表达CFP10-ESAT6对细胞活性及凋亡的影响,并初步探讨其机制。方法:将CFP10-ESAT6融合基因插入真核表达质粒pEGFP-N1,构建重组质粒,转染RAW264.7巨噬细胞。采用MTT的方法测定CFP10-ESAT6融合蛋白对RAW264.7巨噬细胞活性的影响,采用结核分枝杆菌19 kD脂蛋白和十字孢碱(staurosporine)处理RAW264.7巨噬细胞,并以流式细胞术检测细胞凋亡率以及Toll样受体2(TLR2)的表达。结果:成功构建了重组质粒pEGFP-N1/CFP10-ESAT6并转染至RAW264.7巨噬细胞;与对照组相比,胞内表达CFP10-ESAT6不能影响巨噬细胞的活性,但可以明显抑制结核分枝杆菌19 kD脂蛋白所造成的凋亡(P<0.05),并显著抑制了TLR2的表达(P<0.05)。结论:巨噬细胞内表达的CFP10-ESAT6融合蛋白不具有细胞毒性作用,但可以通过下调TLR2的表达来抑制结核分枝杆菌19 kD脂蛋白所造成的凋亡。 展开更多

关键词 结核分枝杆菌 培养滤液蛋白10 早期分泌性抗原靶6 巨噬细胞 细胞增殖 细胞凋亡

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CFP10-ESAT6-PPE68融合基因原核表达质粒的构建和表达 被引量：1

10

作者 冯鑫 杨静 +5 位作者 张春燕 穆柳青 徐蕾 何永林 董志玲 杨春 《重庆医科大学学报》 CAS CSCD 北大核心 2013年第4期408-412,共5页

目的:构建结核分枝杆菌(mycobacterium tuberculosis,M.tb)CFP10-ESAT6-PPE68融合基因原核表达质粒,并且在大肠杆菌中表达融合蛋白。方法:以M.tb H37Rv株DNA作为模板,PCR法扩增ESAT6和PPE68基因,利用基因拼接技术中的Gene-SOEing法扩增E... 目的:构建结核分枝杆菌(mycobacterium tuberculosis,M.tb)CFP10-ESAT6-PPE68融合基因原核表达质粒,并且在大肠杆菌中表达融合蛋白。方法:以M.tb H37Rv株DNA作为模板,PCR法扩增ESAT6和PPE68基因,利用基因拼接技术中的Gene-SOEing法扩增ESAT6-PPE68融合基因,克隆至原核表达质粒pET-32a(+)中,构建重组表达质粒pET-32a(+)-ESAT6-PPE68。再分别以H37Rv株DNA和重组质粒pET-32a(+)-ESAT6-PPE68为模板扩增CFP10和ESAT6-PPE68基因,Gene-SOEing法获取目的基因CFP10-ESAT6-PPE68,克隆至pET-32a(+)载体,构建重组表达质粒pET-32a(+)-CFP10-ESAT6-PPE68,转化入大肠杆菌BL21(DE3),IPTG诱导表达。结果:CFP10-ESAT6-PPE68酶切片段大小与理论值符合,基因测序结果显示融合基因CFP10-ESAT6-PPE68的序列与Genbank中序列一致,并在大肠杆菌中成功诱导表达了目的蛋白,经SDS-PAGE分析和Western blot鉴定,相对分子量约为77 kD。结论:成功构建了M.tb CFP10-ESAT6-PPE68融合基因的原核表达质粒,并诱导表达出了融合蛋白,为该融合蛋白在结核病血清诊断学中的应用奠定了实验基础。 展开更多

关键词 结核分枝杆菌 培养滤液蛋白10 6kD早期分泌抗原靶 戊糖-5-磷酸-3差向异构酶 融合蛋白

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结核分支杆菌ESAT-6基因蛋白的表达

11

作者 王敏 罗琴芳 黄韧 《中国比较医学杂志》 2008年第7期16-19,共4页

目的构建致病性结核分枝杆菌早期分泌性抗原靶(Early secretary antigenic target,ESAT-6)基因的pET原核表达载体,诱导表达并初步鉴定该蛋白。方法设计特异性引物,用PCR方法从结核分枝杆菌标准株H37Rv基因组中扩增ESAT-6基因,产物通过... 目的构建致病性结核分枝杆菌早期分泌性抗原靶(Early secretary antigenic target,ESAT-6)基因的pET原核表达载体,诱导表达并初步鉴定该蛋白。方法设计特异性引物,用PCR方法从结核分枝杆菌标准株H37Rv基因组中扩增ESAT-6基因,产物通过双酶切克隆入pET-32a(+)质粒,经PCR、酶切、测序等方法鉴定后,转入大肠杆菌BL21菌体中IPTG诱导表达,并经镍柱纯化、Western-blotting鉴定。结果所获得ESAT-6基因序列与GenBank公布的完全一致;表达融合蛋白相对分子质量约2.5×104,并能与特异性单抗结合,具有一定免疫学活性。结论成功表达纯化并鉴定构建了ESAT-6融合蛋白。 展开更多

关键词 结核分枝杆菌 早期分泌性抗原靶ESAT-6 载体构建 融合表达

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评价γ干扰素释放分析T-SPOT.TB在肺外结核病诊断中的敏感性 被引量：46

12

作者 霍霏霏 张丽帆 刘晓清 《中国医学科学院学报》 CAS CSCD 北大核心 2009年第4期449-452,共4页

目的评价γ干扰素释放分析T-SPOT.TB检测在肺外结核病诊断中的敏感性。方法对北京协和医院根据细菌学或/和组织学诊断的肺外结核患者31例,应用酶联免疫斑点技术检测6kD早期分泌靶向抗原和10kD培养滤过蛋白肽段库刺激后外周血中释放γ-... 目的评价γ干扰素释放分析T-SPOT.TB检测在肺外结核病诊断中的敏感性。方法对北京协和医院根据细菌学或/和组织学诊断的肺外结核患者31例,应用酶联免疫斑点技术检测6kD早期分泌靶向抗原和10kD培养滤过蛋白肽段库刺激后外周血中释放γ-干扰素的特异性T细胞。结果31例肺外结核患者中29例T-SPOT.TB检测阳性,敏感性为93.5%(95%CI84.8%～100%),6kD早期分泌靶向抗原肽段库刺激后斑点形成细胞数中位数为196/106PB-MCs(4分位间距72～532/106PBMCs),10kD培养滤过蛋白肽段库刺激后斑点形成细胞数中位数为276/106PBMCs(4分位间距72～568/106PBMCs),对两个肽段库总的斑点形成细胞中位数为612/106PBMCs(4分位间距192～1152/106PBMCs)。结论T-SPOT.TB检测对肺外结核诊断具有较高的敏感性。 展开更多

关键词 肺外结核 敏感性 T-SPOT.TB 6kD早期分泌靶向抗原肽段库 10kD培养滤过蛋白肽段库 γ干扰素释放分析

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结核分枝杆菌EsxV亚单位疫苗黏膜免疫诱导的免疫应答 被引量：3

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作者 白鹭 宁唤唤 +6 位作者 康健 梁璇 谢燕玲 彭钰君 张婧瑶 路延之 柏银兰 《中国人兽共患病学报》 CAS CSCD 北大核心 2022年第5期379-386,共8页

目的研究结核分枝杆菌抗原Rv3619c(EsxV)黏膜免疫小鼠诱导的免疫应答水平。方法PCR法扩增esxV基因克隆入原核表达载体pET28a(+),获得的重组E.coli诱导表达目的蛋白,SDS-PAGE电泳和Western Blot鉴定蛋白的表达,亲和层析法纯化EsxV蛋白。... 目的研究结核分枝杆菌抗原Rv3619c(EsxV)黏膜免疫小鼠诱导的免疫应答水平。方法PCR法扩增esxV基因克隆入原核表达载体pET28a(+),获得的重组E.coli诱导表达目的蛋白,SDS-PAGE电泳和Western Blot鉴定蛋白的表达,亲和层析法纯化EsxV蛋白。以EsxV和/或联合环二腺苷酸(c-di-AMP)经鼻黏膜免疫BALB/c小鼠,ELISA法检测小鼠特异性抗体水平及亚类,MTS法检测脾细胞增殖,qRT-PCR检测脾和肺脏细胞因子表达水平,ELISA法检测脾细胞因子分泌水平。结果成功构建EsxV的原核表达载体pET28a(+)-esxV并诱导表达目的蛋白,亲和层析法获得了纯化的重组EsxV蛋白。EsxV经黏膜免疫可诱导显著的体液免疫应答,但诱导的细胞免疫应答水平不高。EsxV与c-di-AMP经黏膜接种可诱导特异性IgG水平增加,EsxV蛋白特异的脾细胞增殖,脾和肺细胞的IFN-γ转录增加。c-di-AMP显著提高EsxV特异的IFN-γ、IL-2、IL-10和IL-17细胞因子分泌,而不诱导炎症因子TNF-α和IL-6表达。结论EsxV与c-di-AMP佐剂构建的亚单位疫苗可诱导特异性体液和细胞免疫应答,可进一步用于新型结核病亚单位疫苗的研制。 展开更多

关键词 结核分枝杆菌 6kDa早期分泌靶抗原分泌系统蛋白V(EsxV) 亚单位疫苗 黏膜免疫 环二腺苷酸

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