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印楝素A无细胞合成体系构建及其合成前体
被引量：
1
1
作者
谢婷婷
汤锋
+2 位作者
高全
王煜炜
王越
《林业科学》
EI
CAS
CSCD
北大核心
2019年第9期50-60,共11页
【目的】印楝素是一种植物源杀虫剂,印楝素A是印楝素的主要活性成分。本研究通过对印楝素A无细胞合成体系制备条件和反应条件的优化,以及印楝素A合成前体的筛选,探讨印楝素A的离体生物合成途径,以为指导构建印楝素异源生物合成平台,实...
【目的】印楝素是一种植物源杀虫剂,印楝素A是印楝素的主要活性成分。本研究通过对印楝素A无细胞合成体系制备条件和反应条件的优化,以及印楝素A合成前体的筛选,探讨印楝素A的离体生物合成途径,以为指导构建印楝素异源生物合成平台,实现印楝素的异源生物合成奠定基础。【方法】通过对缓冲液类型、浓度、起始pH、提取时间及料液比进行单因素试验及正交试验优化,构建印楝素A无细胞合成体系;从反应终止试剂及稳定剂、反应温度、反应时间、底物浓度以及辅助因子5个方面优化无细胞合成体系的反应条件。利用印楝素A无细胞合成体系分别以2,3-环氧鲨烯、羊毛甾醇、大戟二烯醇、丁酰鲸鱼醇、nimbin、茄碱苷和脱乙酰茄碱苷为底物,以印楝素A相对产量为评价标准,探讨印楝素A合成前体。【结果】印楝素A无细胞合成体系的构建:以pH7.0的200 mmol·L^-1 Tris-HCl缓冲液,按1∶20(g·mL^-1)料液比加入印楝叶片,提取1 h。优化的印楝素A无细胞合成条件为:反应总体积800μL,其中含印楝无细胞提取物300μL(相当于印楝叶0.015 g),100μL 250μmol·L^-1的底物(鲨烯)和400μL含有1 mmol·L^-1 Mg2+、1 mmol·L^-1 Mn2+、0.1 mmol·L^-1 ATP、0.1 mmol·L^-1 NADPH+和5 mmol·L^-1抗坏血酸的缓冲液,在30℃下反应60 min,迅速加入200μL乙酸终止反应。分别以2,3-环氧鲨烯、丁酰鲸鱼醇、大戟二烯醇、nimbin、茄碱苷和脱乙酰茄碱苷为底物,反应完成后,印楝素A含量均有不同程度的增加;羊毛甾醇抑制体系中印楝素A的合成。【结论】羊毛甾醇不是印楝素A的合成前体,2,3-环氧鲨烯和丁酰鲸鱼醇是印楝素A的前体,nimbin、大戟二烯醇、脱乙酰茄碱苷和茄碱苷极可能是印楝素A的合成前体,且茄碱苷位于合成途径较下游的位置。
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关键词
印楝素A
无细胞合成体系
前体筛选
生物
合成
途径
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职称材料
β_2肾上腺素受体基因的改造及在无细胞合成体系中的表达
2
作者
王健
刘媛
+5 位作者
王玮
刘洋
韩正政
曲丽洁
杨立亭
王若敏
《食品科学》
EI
CAS
CSCD
北大核心
2018年第12期179-184,共6页
依据大肠杆菌密码子偏好性,设计合成β_2肾上腺素受体(β_2 adrenergic receptor,β_2AR)基因序列,应用大肠杆菌无细胞系统对其进行高效表达,经负载镍离子的顺磁颗粒Magne His?Ni-Particles纯化后,对受体蛋白进行十二烷基硫酸钠-聚丙烯...
依据大肠杆菌密码子偏好性,设计合成β_2肾上腺素受体(β_2 adrenergic receptor,β_2AR)基因序列,应用大肠杆菌无细胞系统对其进行高效表达,经负载镍离子的顺磁颗粒Magne His?Ni-Particles纯化后,对受体蛋白进行十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis,SDS-PAGE)和活性鉴定。结果表明:改造后的β_2AR基因密码子适应指数(codon adaptation index,CAI)为0.96,GC含量从58%降低到46.17%,更有利于该基因在大肠杆菌系统中的表达。表达体系中优化后的Mg^(2+)浓度为22 mmol/L,此时表达量为1 250μg/mL。SDS-PAGE分析显示,纯化蛋白在47 k Da左右出现清晰的特异性条带,与预期结果一致,纯度大于90%。直接酶受体分析检测结果显示,当纯化受体蛋白1∶500稀释包被时,该重组受体与盐酸克伦特罗、沙丁胺醇及莱克多巴胺的酶标记物结合的OD值分别为0.976、0.836和0.728,亲和活性依次降低。β_2AR蛋白在无细胞体系中的成功表达,为研发基于受体的β激动剂多残留快速检测技术提供了理论支持。
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关键词
Β2肾上腺素受体
密码子优化
大肠杆菌
无细胞合成体系
表达
β激动剂检测
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职称材料
题名
印楝素A无细胞合成体系构建及其合成前体
被引量：
1
1
作者
谢婷婷
汤锋
高全
王煜炜
王越
机构
国际竹藤中心国家林业和草原局竹藤科学与技术重点实验室
安徽农业大学
国家林业和草原局森林和草原病虫害防治总站
出处
《林业科学》
EI
CAS
CSCD
北大核心
2019年第9期50-60,共11页
基金
国家自然科学基金项目(31670581)
文摘
【目的】印楝素是一种植物源杀虫剂,印楝素A是印楝素的主要活性成分。本研究通过对印楝素A无细胞合成体系制备条件和反应条件的优化,以及印楝素A合成前体的筛选,探讨印楝素A的离体生物合成途径,以为指导构建印楝素异源生物合成平台,实现印楝素的异源生物合成奠定基础。【方法】通过对缓冲液类型、浓度、起始pH、提取时间及料液比进行单因素试验及正交试验优化,构建印楝素A无细胞合成体系;从反应终止试剂及稳定剂、反应温度、反应时间、底物浓度以及辅助因子5个方面优化无细胞合成体系的反应条件。利用印楝素A无细胞合成体系分别以2,3-环氧鲨烯、羊毛甾醇、大戟二烯醇、丁酰鲸鱼醇、nimbin、茄碱苷和脱乙酰茄碱苷为底物,以印楝素A相对产量为评价标准,探讨印楝素A合成前体。【结果】印楝素A无细胞合成体系的构建:以pH7.0的200 mmol·L^-1 Tris-HCl缓冲液,按1∶20(g·mL^-1)料液比加入印楝叶片,提取1 h。优化的印楝素A无细胞合成条件为:反应总体积800μL,其中含印楝无细胞提取物300μL(相当于印楝叶0.015 g),100μL 250μmol·L^-1的底物(鲨烯)和400μL含有1 mmol·L^-1 Mg2+、1 mmol·L^-1 Mn2+、0.1 mmol·L^-1 ATP、0.1 mmol·L^-1 NADPH+和5 mmol·L^-1抗坏血酸的缓冲液,在30℃下反应60 min,迅速加入200μL乙酸终止反应。分别以2,3-环氧鲨烯、丁酰鲸鱼醇、大戟二烯醇、nimbin、茄碱苷和脱乙酰茄碱苷为底物,反应完成后,印楝素A含量均有不同程度的增加;羊毛甾醇抑制体系中印楝素A的合成。【结论】羊毛甾醇不是印楝素A的合成前体,2,3-环氧鲨烯和丁酰鲸鱼醇是印楝素A的前体,nimbin、大戟二烯醇、脱乙酰茄碱苷和茄碱苷极可能是印楝素A的合成前体,且茄碱苷位于合成途径较下游的位置。
关键词
印楝素A
无细胞合成体系
前体筛选
生物
合成
途径
Keywords
azadirachtin A
cell-free system
precursor screen
biosynthetic pathway
分类号
S718.43 [农业科学—林学]
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职称材料
题名
β_2肾上腺素受体基因的改造及在无细胞合成体系中的表达
2
作者
王健
刘媛
王玮
刘洋
韩正政
曲丽洁
杨立亭
王若敏
机构
河北北方学院食品安全研究中心河北省农产品食品质量安全分析检测重点实验室
河北北方学院农林科技学院食品研究所
出处
《食品科学》
EI
CAS
CSCD
北大核心
2018年第12期179-184,共6页
基金
河北省高等学校科学技术研究青年基金项目(QN2018264)
河北北方学院博士科研启动基金项目(201706)
文摘
依据大肠杆菌密码子偏好性,设计合成β_2肾上腺素受体(β_2 adrenergic receptor,β_2AR)基因序列,应用大肠杆菌无细胞系统对其进行高效表达,经负载镍离子的顺磁颗粒Magne His?Ni-Particles纯化后,对受体蛋白进行十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis,SDS-PAGE)和活性鉴定。结果表明:改造后的β_2AR基因密码子适应指数(codon adaptation index,CAI)为0.96,GC含量从58%降低到46.17%,更有利于该基因在大肠杆菌系统中的表达。表达体系中优化后的Mg^(2+)浓度为22 mmol/L,此时表达量为1 250μg/mL。SDS-PAGE分析显示,纯化蛋白在47 k Da左右出现清晰的特异性条带,与预期结果一致,纯度大于90%。直接酶受体分析检测结果显示,当纯化受体蛋白1∶500稀释包被时,该重组受体与盐酸克伦特罗、沙丁胺醇及莱克多巴胺的酶标记物结合的OD值分别为0.976、0.836和0.728,亲和活性依次降低。β_2AR蛋白在无细胞体系中的成功表达,为研发基于受体的β激动剂多残留快速检测技术提供了理论支持。
关键词
Β2肾上腺素受体
密码子优化
大肠杆菌
无细胞合成体系
表达
β激动剂检测
Keywords
β2 adrenergic receptor
codon optimization
E. coli-based cell-free protein synthesis system
expression
detection of β-agonists
分类号
TS201.6 [轻工技术与工程—食品科学]
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职称材料
题名
作者
出处
发文年
被引量
操作
1
印楝素A无细胞合成体系构建及其合成前体
谢婷婷
汤锋
高全
王煜炜
王越
《林业科学》
EI
CAS
CSCD
北大核心
2019
1
在线阅读
下载PDF
职称材料
2
β_2肾上腺素受体基因的改造及在无细胞合成体系中的表达
王健
刘媛
王玮
刘洋
韩正政
曲丽洁
杨立亭
王若敏
《食品科学》
EI
CAS
CSCD
北大核心
2018
0
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职称材料
已选择
0
条
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参考文献
引证文献
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