鸽腺病毒Ⅰ型TaqMan探针实时荧光定量PCR检测方法的建立及遗传进化分析 被引量：1

1

作者 安乐乐 刘倩芸 +2 位作者 蓝秋菊 罗迅 赵永清 《江西农业大学学报》 北大核心 2025年第1期167-177,共11页

【目的】鸽腺病毒感染在全球鸽群中广泛分布,可引起多种临床症状,如呕吐、腹泻、肝脏损伤等,严重影响鸽的健康与养殖效益。建立一种快速高效检测鸽腺病毒Ⅰ型(PiAdV-Ⅰ)TaqMan探针实时荧光定量PCR方法,为鸽腺病毒Ⅰ型临床检测及流行病... 【目的】鸽腺病毒感染在全球鸽群中广泛分布,可引起多种临床症状,如呕吐、腹泻、肝脏损伤等,严重影响鸽的健康与养殖效益。建立一种快速高效检测鸽腺病毒Ⅰ型(PiAdV-Ⅰ)TaqMan探针实时荧光定量PCR方法,为鸽腺病毒Ⅰ型临床检测及流行病学调查提供技术平台。【方法】依据GenBank公布鸽腺病毒Ⅰ型Hexon基因保守区设计引物探针并构建重组质粒pCE2-TA-PiAdV-Ⅰ;优化反应体系和程序,绘制标准曲线、特异性、敏感性和重复性评价,建立鸽腺病毒Ⅰ型TaqMan探针实时荧光定量PCR检测方法;扩增测序阳性临床样品的Hexon基因,使用MEGA5.0进行进化树构建及同源性分析。【结果】该TaqMan探针实时荧光定量PCR方法标准曲线y=-3.1081x+37.374,线性相关系数R2为0.9977,线性关系良好;与鸽疱疹病毒、鸽圆环病毒等鸽子其他常见病毒无交叉反应,具有良好的特异性;最低检测拷贝数为14.6 copies/μL,敏感性是常规PCR方法的10倍,具有高敏感性;组内和组间变异系数均低于1.1%,重复性好。通过检测112份鸽子病料样品,该TaqMan探针实时荧光定量PCR方法检测阳性率为69.64%(78/112),并且高于常规PCR方法阳性检出率65.18%(73/112)。此外,建立的TaqMan探针实时荧光定量PCR方法与常规PCR方法的阳性符合率为100%,总体符合率为95.54%。3条测序毒株与Ⅰ型鸽腺病毒参考毒株同源性为99.47%~99.71%,遗传关系高度接近,表明可能由同一个原始毒株进化而来。【结论】研究建立的鸽腺病毒Ⅰ型TaqMan探针实时荧光定量PCR检测方法线性关系良好、特异性强、敏感性高及重复性好,可快速高效检测出临床样品中的PiAdV-Ⅰ。此外,所扩增序列能够用于分析临床毒株遗传进化特征,有助于快速准确诊断鸽腺病毒感染及疫苗研发提供参考依据。 展开更多

关键词 鸽腺病毒Ⅰ型 Hexon基因 TaqMan探针实时荧光定量pcr 遗传进化分析 临床检测 流行病学调查

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猪流行性腹泻病毒锁核酸探针荧光定量PCR检测方法的建立 被引量：4

2

作者 李艳 卞志标 +1 位作者 翟少伦 李春玲 《广东畜牧兽医科技》 2024年第2期30-36,共7页

为建立一种快速、灵敏的猪流行性腹泻病毒(porcine epidemic diarrhea virus,PEDV)早期痕量检测方法,该研究以PEDV的M基因为靶基因,设计了特异性引物和锁核酸(Locked Nucleic Acid,LNA)-TaqMan探针,经过条件优化,建立了基于LNA-TaqMan... 为建立一种快速、灵敏的猪流行性腹泻病毒(porcine epidemic diarrhea virus,PEDV)早期痕量检测方法,该研究以PEDV的M基因为靶基因,设计了特异性引物和锁核酸(Locked Nucleic Acid,LNA)-TaqMan探针,经过条件优化,建立了基于LNA-TaqMan探针的PEDV荧光定量PCR方法,并与常规TaqMan探针法进行了比对。结果显示,所建立的PEDV的LNA-Taq-Man探针荧光定量PCR方法最低检测限为3.2拷贝/微升,较常规TaqMan探针法提高了10倍;与猪传染性胃肠炎病毒、猪轮状病毒和猪德尔塔冠状病毒等多种病原不存在交叉反应,特异性良好;批内和批间重复性结果的变异系数均小于1%,重复性较好。应用该方法对103份临床样品进行检测,结果显示,共检出PEDV阳性样品47份,阳性率45.63%,与常规TaqMan探针法检测结果的阳性符合率为90.38%。本研究建立的基于LNA-TaqMan探针的荧光定量PCR方法为PEDV的精准检测和流行病学调查提供了一种新的技术选择。 展开更多

关键词 猪流行性腹泻病毒 M基因 LNA-TaqMan探针荧光定量pcr

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结核病与BCG疫苗接种个体TaqMan探针荧光定量PCR诊断方法的建立及初步应用 被引量：2

3

作者 王春雨 杨莉 +5 位作者 王振国 刘金华 宋占昀 周亮 王宝任 王全凯 《中国预防兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2010年第12期952-955,共4页

为快速鉴别诊断结核病(TB),本研究以GenBank登录的致病性结核分枝杆菌复合群、人型结核杆菌和牛分枝杆菌特有基因为对象,设计并合成引物及探针,建立TaqMan探针荧光定量PCR检测方法。实验结果表明,该方法对标准质控菌株反应呈阳性,对卡介... 为快速鉴别诊断结核病(TB),本研究以GenBank登录的致病性结核分枝杆菌复合群、人型结核杆菌和牛分枝杆菌特有基因为对象,设计并合成引物及探针,建立TaqMan探针荧光定量PCR检测方法。实验结果表明,该方法对标准质控菌株反应呈阳性,对卡介苗(BCG)及其他微生物样品反应呈阴性;对结核分枝杆菌或牛分枝杆菌标准菌株的检测灵敏度可达单个菌细胞水平。对45份结核菌素PPD皮肤试验结果为阳性的临床样本进行TaqMan探针荧光定量PCR检测,36份为阳性;而对PPD检测为阴性的50份临床样本进行检测时,7份为阳性。本研究结果表明,所建立的方法可用于TB的鉴别诊断,可对由BCG接种或环境中分枝杆菌引起的PPD检测假阳性样本进行鉴别,对TB的快速检测和早期诊断具有重要意义。 展开更多

关键词 结核病 鉴别检测 牛分枝杆菌 结核杆菌 TaqMan探针pcr

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PCR制备地高辛标记的探针检测禽流感病毒核酸 被引量：37

4

作者 黄庚明 辛朝安 《中国兽医杂志》 CAS 北大核心 2001年第12期3-7,共5页

用聚合酶链反应 (PCR)技术 ,制备了广东禽流感无致病力分离株 A/goose/China/2 4/96 (H7N3 )核蛋白基因片段(NPc)的地高辛标记的 c DNA探针。建立并优化了检测禽流感病毒核酸的探针杂交法 ,探针杂交法能鉴别出非免疫鸡胚和SPF鸡胚尿囊... 用聚合酶链反应 (PCR)技术 ,制备了广东禽流感无致病力分离株 A/goose/China/2 4/96 (H7N3 )核蛋白基因片段(NPc)的地高辛标记的 c DNA探针。建立并优化了检测禽流感病毒核酸的探针杂交法 ,探针杂交法能鉴别出非免疫鸡胚和SPF鸡胚尿囊液中的病毒 ,攻毒后第 3天的 SPF和非免疫鸡泄殖腔拭子中 AIV的最大检出率为 1/10 ,对临床样品中的 AIV的最大检出率为 1/7,而直接 HA和 HI法及 AGP试验检不出临床样品的 AIV。该探针具有较好的特异性和敏感性 ,为从分子水平探讨 AIV的发病机理、临床早期快速诊断提供了新的研究手段。 展开更多

关键词 地高辛标记 pcr探针 禽流感病毒 核酸检测 禽流感

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布鲁菌Cycling探针荧光定量PCR检测方法的建立 被引量：2

5

作者 许邹亮 南文龙 +4 位作者 陆明哲 周洁 谭鹏飞 陈义平 毛开荣 《中国兽医杂志》 CAS 北大核心 2012年第2期13-16,共4页

根据布鲁菌BCSP31基因序列设计布鲁菌通用检测引物和探针,建立了布鲁菌Cycling探针荧光定量PCR检测方法。以构建的含BCSP31基因的质粒标准品10倍递进稀释为模板检测其敏感性,结果显示,本方法能检测约10个拷贝的阳性质粒,且标准曲线的线... 根据布鲁菌BCSP31基因序列设计布鲁菌通用检测引物和探针,建立了布鲁菌Cycling探针荧光定量PCR检测方法。以构建的含BCSP31基因的质粒标准品10倍递进稀释为模板检测其敏感性,结果显示,本方法能检测约10个拷贝的阳性质粒,且标准曲线的线性关系良好。用本方法检测5株不同种的布鲁菌以及猪大肠杆菌K99、巴氏杆菌C48-1、猪链球菌ST171、绿脓杆菌等4株对照菌。结果显示,5株不同种的布鲁菌均出现典型的"S"型扩增曲线,4株对照菌40个循环内均无CT值出现。用本方法和B4/B5-PCR方法对来自布鲁菌病流行地区3个不同牛场的40份血样、奶样和血清样进行平行检测。结果显示,本方法和B4/B5-PCR方法的结果符合率为80.0%。B4/B5-PCR检测为阳性的27份样品经本方法检测均为阳性;B4/B5-PCR检测为阴性的13份样本,经本方法检测,其中8份呈阳性,5份为阴性。本方法的敏感性明显高于B4/B5-PCR方法。试验表明,所建立的Cycling探针荧光定量PCR方法具有敏感、特异、稳定等特点,可用于布鲁菌感染的快速检测。 展开更多

关键词 布鲁菌 Cycling探针荧光定量pcr

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犬瘟热病毒、犬细小病毒二重TaqMan MGB探针实时荧光定量PCR检测方法的建立与应用 被引量：6

6

作者 赵雪丽 刘毅 +5 位作者 班付国 闫若潜 王华俊 王淑娟 马震原 王东方 《中国畜牧兽医》 CAS 北大核心 2018年第8期2086-2094,共9页

为建立一种特异、高通量检测犬瘟热病毒(canine distemper virus,CDV)和犬细小病毒(canine parvovirus,CPV)的二重TaqMan MGB探针实时荧光定量PCR方法,本研究选取高度保守且具有型特异性的CDV H基因和CPVVP2基因序列,设计CDV和CPV特异... 为建立一种特异、高通量检测犬瘟热病毒(canine distemper virus,CDV)和犬细小病毒(canine parvovirus,CPV)的二重TaqMan MGB探针实时荧光定量PCR方法,本研究选取高度保守且具有型特异性的CDV H基因和CPVVP2基因序列,设计CDV和CPV特异性引物对及TaqMan MGB探针;经反应条件优化,建立了检测CDV和CPV的二重TaqMan MGB探针实时荧光定量PCR方法,并进行了敏感性、特异性和重复性试验。结果显示,该方法检测CDV、CPV的标准曲线线性相关系数(R^2)分别为0.997和0.993,最低检出限均为10拷贝/μL,具有较高的灵敏性;对犬副流感病毒等4种病原对照和阴性对照均未出现扩增,特异性良好;CDV、CPV标准品批间试验结果显示,该方法具有很好的重复性;对48份临床疑似CDV或CPV感染样品检测结果显示,14份为CDV阳性,19份为CPV阳性,4份为CDV/CPV双阳性,与CDV H基因、CPVVP2基因测序结果符合率为100%。本研究建立的二重TaqMan MGB探针实时荧光定量PCR方法具有灵敏、特异、高通量和可准确定量等优点,可用于临床CDV/CPV病毒感染各个时期的快速鉴别检测。 展开更多

关键词 犬瘟热病毒(CDV) H基因 犬细小病毒(CPV) VP2基因 二重TaqMan MGB探针实时荧光定量pcr

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牛传染性鼻气管炎gB基因TaqMan探针及SYBR Green 1荧光定量PCR方法的建立与比较 被引量：7

7

作者 张喜喜 许健 +1 位作者 李永清 周双海 《中国兽医杂志》 CAS 北大核心 2017年第5期42-47,共6页

为建立牛传染性鼻气管炎病毒(IBRV)荧光定量PCR检测方法,本研究利用IBRV g B基因序列设计引物及相应探针,分别建立Taq Man探针与SYBR Green 1荧光定量PCR方法,并对两种方法的敏感性等综合比较。结果显示,SYBR Green 1荧光定量PCR方法的... 为建立牛传染性鼻气管炎病毒(IBRV)荧光定量PCR检测方法,本研究利用IBRV g B基因序列设计引物及相应探针,分别建立Taq Man探针与SYBR Green 1荧光定量PCR方法,并对两种方法的敏感性等综合比较。结果显示,SYBR Green 1荧光定量PCR方法的相关系数(R2)为0.998,扩增效率(E)为95.7%;Taq Man探针荧光定量PCR方法的R2为0.999,E为108.3%;两种方法的敏感性均为0.2 TCID50,变异系数均小于3%。综合结果显示,两种检测方法无显著差异。最后,本研究成功建立了检测IBRV的荧光定量PCR,将为IBRV的临床检测提供方法。 展开更多

关键词 牛传染性鼻气管炎病毒 TaqMan探针荧光定量pcr SYBR Green 1荧光定量pcr 临床检测

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荧光PCR探针熔解曲线技术检测痰标本中结核分枝杆菌异烟肼耐药性的研究 被引量：7

8

作者 王嫩寒 赵琰枫 +5 位作者 田丽丽 陈双双 陈昊 任怡宣 李传友 代小伟 《实用医学杂志》 CAS 北大核心 2023年第20期2664-2670,共7页

目的评价荧光PCR探针熔解曲线(fluorescence polymerase chain reaction probe melting curve,Melt Pro)技术检测痰标本结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis,MTB)异烟肼耐药性的应用价值。方法收集2021年5月至2022年5月在北京市疾... 目的评价荧光PCR探针熔解曲线(fluorescence polymerase chain reaction probe melting curve,Melt Pro)技术检测痰标本结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis,MTB)异烟肼耐药性的应用价值。方法收集2021年5月至2022年5月在北京市疾病预防控制中心结核病门诊Gene Xpert MTB/RIF检测为MTB的(简称MTB阳性)患者痰标本,对每份标本同时进行涂片镜检、分枝杆菌分离培养、Melt Pro技术和线性探针技术(Geno Type MTBDRplus,简称Hain试验)异烟肼耐药检测。分析Melt Pro技术检测痰标本MTB异烟肼的耐药性,痰标本荷菌量对检测结果的影响;以培养阳性菌株异烟肼比例法药敏结果为参考标准,评价Melt Pro技术耐药检测效能。结果收集MTB阳性的合格痰标本157例,经分枝杆菌分离培养获得阳性菌株130株。Melt Pro技术痰标本MTB异烟肼耐药性检测成功率为84.1%(132/157)。不同痰涂片结果等级间,Melt Pro技术检测异烟肼耐药成功的比例差异存在有统计学意义(H=24.169,P=0.000),随痰涂片结果等级的升高,检测成功率由“阴性”标本的64.8%(35/54)升高到“3+”“4+”标本的100%(17/17,6/6);该比例也随Gene Xpert MTB/RIF检测MTB等级的升高而升高,由“极低”标本的54.8%(17/31),到“高”标本的96.4%(27/28),各等级间差异有统计学意义(H=27.763,P=0.000)。Melt Pro技术、Hain试验和药敏试验的异烟肼耐药检出率分别为22.0%(29/132),15.3%(19/124),和14.6%(19/130),三者差异无统计学意义(χ^(2)=2.997,P=0.223)。以培养阳性菌株比例法药敏试验结果为参考标准,Melt Pro技术检测异烟肼耐药的灵敏度、特异度、阳性预测值、阴性预测值分别为:84.6%(11/13)、91.2%(93/102)、55%(11/20)、97.9%(93/95),Kappa值为0.614;Hain试验检测异烟肼耐药的灵敏度、特异度、阳性预测值、阴性预测值分别为:55.6%(10/18)、92.3%(84/91)、58.8%(10/17)、91.3%(84/92),Kappa值为0.490。结论Melt Pro技术可直接检测痰标本MTB耐药性,快速准确筛查患者耐药情况,缩短耐药筛查时间。 展开更多

关键词 分枝杆菌 结核 荧光pcr探针熔解曲线 耐药性检测 痰

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水貂源牛分枝杆菌的分离与荧光PCR鉴定

9

作者 王春雨 杨莉 +4 位作者 王全凯 王海军 刘金华 周亮 王振国 《中国动物检疫》 CAS 2010年第9期31-33,共3页

目的探讨水貂源结核杆菌复合群的检测方法,并进行病原学调查。方法利用7H10培养基分离水貂结核病的病原,采用荧光探针PCR方法进行检测。结果经鉴定分离的病原菌为致病性牛分枝杆菌。结论通过荧光探针PCR能够直接对结核杆菌复合群进行亚... 目的探讨水貂源结核杆菌复合群的检测方法,并进行病原学调查。方法利用7H10培养基分离水貂结核病的病原,采用荧光探针PCR方法进行检测。结果经鉴定分离的病原菌为致病性牛分枝杆菌。结论通过荧光探针PCR能够直接对结核杆菌复合群进行亚种鉴定,该方法具有快速、敏感、特异性强的优点,能够减少动物检疫时间。 展开更多

关键词 水貂 结核病 检测 牛分枝杆菌 荧光探针pcr

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裂谷热病毒两种PCR检测方法的建立及比较分析 被引量：1

10

作者 冷依伊 王印 +5 位作者 项明源 张鹏飞 蒋子睿 江地科 杨泽晓 姚学萍 《中国预防兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2018年第6期504-508,共5页

裂谷热(RVF)具有较高的发病率与死亡率,极大危害着当地养殖业和生态系统的稳定。为建立一种能够快速有效检测裂谷热病毒(RVFV)的方法,本研究根据RVFV的保守序列设计了特异性引物与探针,分别建立了探针PCR和荧光PCR,并对这两种检测方法... 裂谷热(RVF)具有较高的发病率与死亡率,极大危害着当地养殖业和生态系统的稳定。为建立一种能够快速有效检测裂谷热病毒(RVFV)的方法,本研究根据RVFV的保守序列设计了特异性引物与探针,分别建立了探针PCR和荧光PCR,并对这两种检测方法进行比较分析。结果显示,两种检测方法均不存在非特异扩增;最低检测浓度分别为1.03×10^(-2)拷贝/μL和1.03×10~0拷贝/μL,前者比后者有更高的灵敏度;探针PCR和荧光PCR组内和组间变异系数均小于3%。实验表明,探针PCR具有特异性强、灵敏度高、稳定性好、准确度高、检测速度快等优点。因此,探针PCR是一种灵敏度和可靠性均较高的RVFV检测方法。 展开更多

关键词 裂谷热病毒 探针pcr 荧光pcr

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牛冠状病毒荧光定量PCR检测方法的建立及初步应用 被引量：10

11

作者 王莎莎 王吉 岳秉飞 《中国比较医学杂志》 CAS 北大核心 2019年第4期69-73,共5页

目的建立特异灵敏的牛冠状病毒(bovine coronavirus,BCV)荧光定量PCR检测方法,并对牛源性样本进行筛查。方法根据Genbank中登录的BCV的N基因序列设计Taq Man引物探针,建立基于Taq Man探针法的BCV PCR检测方法,对收集到的牛源样本进行BC... 目的建立特异灵敏的牛冠状病毒(bovine coronavirus,BCV)荧光定量PCR检测方法,并对牛源性样本进行筛查。方法根据Genbank中登录的BCV的N基因序列设计Taq Man引物探针,建立基于Taq Man探针法的BCV PCR检测方法,对收集到的牛源样本进行BCV筛查,并对部分阳性样本的PCR产物进行测序鉴定。结果建立了能够特异检测BCV的Taq Man探针法荧光定量PCR检测方法,其标准曲线相关系数Slope为-3.417,相关系数r2为0.999,,扩增效率Eff为96.195%。该方法检测BCV的敏感度为40 copies。使用该方法检测64份牛肛拭子样本检出率为1.5%,检测33份牛源生物制品检出率为6%,部分阳性样本的PCR产物经测序比对为BCV核酸序列,说明BCV在国内牛群中流行,牛源相关生物制品中有感染BCV的潜在风险。结论经测序验证,建立的方法能够灵敏的检测样本中的BCV核酸,应加强牛源相关生物制品中BCV的监测,避免人感染BCV的潜在风险。 展开更多

关键词 牛冠状病毒 TAQ Man探针法荧光定量pcr方法 检测和初步应用

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鼠痘病毒FQ-PCR检测方法的建立及初步应用 被引量：1

12

作者 王莎莎 付瑞 +1 位作者 王吉 岳秉飞 《中国比较医学杂志》 CAS 北大核心 2021年第1期101-105,共5页

目的建立鼠痘病毒(ECTV)的Taq Man探针法荧光定量PCR检测方法,并对实验室保存的裸鼹鼠组织样本、小鼠组织样本以及黄鼠组织样本进行检测。方法根据Gen Bank中鼠痘病毒的crm D基因序列设计引物探针,建立ECTV的FQ-PCR检测方法,对保存的样... 目的建立鼠痘病毒(ECTV)的Taq Man探针法荧光定量PCR检测方法,并对实验室保存的裸鼹鼠组织样本、小鼠组织样本以及黄鼠组织样本进行检测。方法根据Gen Bank中鼠痘病毒的crm D基因序列设计引物探针,建立ECTV的FQ-PCR检测方法,对保存的样本进行筛查,并对部分阳性样本进行测序鉴定。结果建立的ECTV FQ-PCR检测方法灵敏度高、特异性强,最低能检测到ECTV核酸浓度为10 copies/μL的样本,方法的标准曲线相关参数符合标准。使用该方法检测实验室63份裸鼹鼠脾组织样本和22份小鼠脾组织样本,结果全为阴性,检测4只黄鼠组织样本,结果阳性率为50%。阳性样本进行PCR检测后测序比对为ECTV核酸序列。结论经验证,建立的ECTV FQ-PCR检测方法能够灵敏特异的对样本中的ECTV进行筛查,实验室小鼠的日常监测不应忽视ECTV污染的潜在风险。 展开更多

关键词 鼠痘病毒 TaqMan探针法荧光定量pcr方法 裸鼹鼠 黄鼠

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SYBR Green荧光定量PCR法对BCL11B基因座位相互作用位点的验证分析

13

作者 任立成 孙元田 +3 位作者 张云霞 苏振宇 杨智 李冬娜 《海南医学院学报》 CAS 2013年第1期1-4,共4页

目的:研究在不同类型细胞核中,位于不同染色体上的BCL11B与ARHGAP6基因座位间的相互作用关系。方法:通过SYBR Green荧光实时定量PCR法,分别对MCF-7和Jurkat细胞的3C(染色体构象捕获)样品进行定量分析,分析分别位于不同染色体上的BCL11B... 目的:研究在不同类型细胞核中,位于不同染色体上的BCL11B与ARHGAP6基因座位间的相互作用关系。方法:通过SYBR Green荧光实时定量PCR法,分别对MCF-7和Jurkat细胞的3C(染色体构象捕获)样品进行定量分析,分析分别位于不同染色体上的BCL11B与ARHGAP6基因座位间的相互作用频率。结果:与TaqMan探针法相比较,基于SYBR Green荧光实时定量PCR法对3C样品的分析同样具有良好的特异性。在MCF-7和Jurkat细胞中,BCL11B与ARHGAP6基因座位间的相互作用频率存在很大的差异。结论:SYBR Green荧光实时定量PCR法在染色体构象捕获技术中具有很好的特异性;BCL11B与ARHGAP6基因座位间的相互作用具有细胞类型特异性。 展开更多

关键词 BCL11B基因座位 染色体构象捕获 TaqMan探针法定量pcr SYBR Green荧光实时定量pcr

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BVDV和IBRV双重实时荧光定量PCR检测方法建立 被引量：4

14

作者 刘梦瑶 张秋楠 +1 位作者 吴文学 李金祥 《中国兽医杂志》 CAS 北大核心 2019年第11期28-31,36,I0003,共6页

根据牛病毒性腹泻病毒(BVDV)5′端非编码区和牛传染性鼻气管炎病毒(IBRV)gB基因保守区基因序列,参考文献分别合成了2对特异性引物和探针。利用构建的包含BVDV和IBRV目标基因片段的阳性质粒,对退火温度、引物和探针的浓度以及反应条件进... 根据牛病毒性腹泻病毒(BVDV)5′端非编码区和牛传染性鼻气管炎病毒(IBRV)gB基因保守区基因序列,参考文献分别合成了2对特异性引物和探针。利用构建的包含BVDV和IBRV目标基因片段的阳性质粒,对退火温度、引物和探针的浓度以及反应条件进行了优化,构建了实时荧光定量PCR(qPCR)标准曲线,并对双重qPCR方法的特异性、敏感性和重复性进行了评价。试验结果显示,qPCR最适退火温度为54.0℃,BVDV引物浓度为0.2μmol/L,IBRV引物浓度为0.3μmol/L,BVDV探针浓度0.2μmol/L,IBRV探针浓度为0.1μmol/L。BVDV的RNA最低检测限为100拷贝/μL,IBRV的DNA最低检测限为1拷贝/μL,并具有良好的特异性和重复性,为BVDV和IBRV的同时、快速、定量检测提供了有效的方法。 展开更多

关键词 BVDV IBRV 实时荧光定量pcr(qpcr):探针

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利用实时荧光PCR快速筛查玉米中转基因成分 被引量：6

15

作者 张海波 刘冰 +2 位作者 杨娟妮 张田 张英 《西北农业学报》 CAS CSCD 北大核心 2017年第6期840-848,共9页

玉米是拥有转基因转化体数量最多的作物,多样的转化体增加了玉米中转基因成分筛查的难度。为了建立玉米中转基因成分的快速筛查方法,利用Taqman探针实时荧光PCR方法,通过对玉米样品中CaMV35S启动子(P-35S)和NOS终止子(T-NOS)2个元件组... 玉米是拥有转基因转化体数量最多的作物,多样的转化体增加了玉米中转基因成分筛查的难度。为了建立玉米中转基因成分的快速筛查方法,利用Taqman探针实时荧光PCR方法,通过对玉米样品中CaMV35S启动子(P-35S)和NOS终止子(T-NOS)2个元件组合的检测,完成对现有玉米转化体的筛查。建立的Taqman探针实时荧光PCR方法灵敏度可达到0.1%,检测时间较普通PCR方法缩短1h以上。同时提出了转基因玉米转化体鉴定路线图。该筛查方法可对玉米中的转基因成分进行快速、高灵敏度的筛查。 展开更多

关键词 转基因玉米 Taqman探针实时荧光pcr 快速筛查 CaMV35S启动子

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九味羌活丸和香砂养胃丸制剂米粉掺伪检测方法的建立和质量标准的制定 被引量：1

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作者 王菲菲 任秀 +5 位作者 李静 白继超 张聿梅 郑健 崔生辉 马双成 《暨南大学学报（自然科学与医学版）》 CAS CSCD 北大核心 2022年第1期97-105,共9页

目的:建立荧光探针PCR检测方法并拟定质量标准,旨在实现快速、准确地检出九味羌活丸(水丸)和香砂养胃丸(水丸)中的掺伪米粉。方法:通过优化样品提取方法,有效提取九味羌活丸和香砂养胃丸复方的基因组;通过文献检索和生物信息学分析,筛... 目的:建立荧光探针PCR检测方法并拟定质量标准,旨在实现快速、准确地检出九味羌活丸(水丸)和香砂养胃丸(水丸)中的掺伪米粉。方法:通过优化样品提取方法,有效提取九味羌活丸和香砂养胃丸复方的基因组;通过文献检索和生物信息学分析,筛选得到适用于本试验的米粉特异性引物和TaqMan探针,并优化PCR检测方法。实验对方法的特异性、检出限、精密度和重复性进行考察,对市售样品进行筛查,并拟定了中成药荧光探针PCR检测方法的检测标准。结果:本实验优化了样品的前处理方法,通过文献检索和生物信息学分析检索到3组特异性引物和探针,并筛选得到了适合本研究的引物和探针。荧光探针PCR方法的检出限为每克样品可检出0.001 g米粉。九味羌活丸精密度的C_(t)值为30.34,相对标准偏差(RSD)为1.23%;重复性的C_(t)值为29.88,RSD为1.98%。香砂养胃丸精密度的C_(t)值为35.43,RSD为2.63%;重复性的C_(t)值为35.09,RSD为2.11%。对市售的7个厂家13批次样品进行分析,检出来自A厂家的5批次九味羌活丸和2批次香砂养胃丸掺入了米粉。利用克隆测序的方法,对PCR产物进行再确认,经NCBI数据库比对,结果均为水稻(Oryza sativa L.)。本研究拟定了九味羌活丸(水丸)和香砂养胃丸(水丸)荧光探针PCR检测方法标准。结论:建立了米粉的荧光探针PCR检测方法,并拟定质量标准,可快速准确地鉴别出米粉掺伪的九味羌活丸和香砂养胃丸样品,为中成药荧光探针PCR方法的标准制订提供参考。 展开更多

关键词 九味羌活丸 香砂养胃丸 米粉 荧光探针pcr方法 克隆测序

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转基因玉米MIR162转化事件特异性检测方法及其标准化 被引量：9

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作者 张广远 孙红炜 +3 位作者 李凡 杨淑珂 路兴波 赵蕾 《作物学报》 CAS CSCD 北大核心 2013年第7期1141-1147,共7页

转基因玉米MIR162是美国先正达公司开发的新型抗鳞翅目昆虫的转基因玉米品种。本研究目的在于建立该品系转化事件特异性定性、定量检测方法并形成定性检测国家标准。定性PCR体系经实验室内部比对及实验室间循环验证结果表明,该体系特异... 转基因玉米MIR162是美国先正达公司开发的新型抗鳞翅目昆虫的转基因玉米品种。本研究目的在于建立该品系转化事件特异性定性、定量检测方法并形成定性检测国家标准。定性PCR体系经实验室内部比对及实验室间循环验证结果表明,该体系特异性强,灵敏度较高(0.1%),具有良好的重复性和再现性。TaqMan探针实时荧光PCR检测结果表明,所设计的探针特异性强,检测低限(LOD)在0.01%以下;定量标准曲线R2均为0.999,扩增效率为98.622%和99.602%,SD范围为0.014～0.209,RSD的范围为0.049%～0.879%,稳定性好;对转基因含量为1.0%、0.5%、0.1%的样品定量结果相对偏差在8.0%以内,结果较为准确。本研究建立的方法完全可用于含转基因玉米MIR162成分样品的检测。 展开更多

关键词 转化体特异性 MIR162 定性pcr TaqMan探针实时荧光pcr 标准化

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转基因甘蔗植株Southern杂交体系的优化 被引量：7

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作者 崔学强 张树珍 +1 位作者 沈林波 冯翠莲 《生物技术通报》 CAS CSCD 北大核心 2015年第12期105-109,共5页

对甘蔗Southern杂交体系的优化,旨为转基因甘蔗Southern杂交鉴定分析提供参考。以转基因甘蔗为材料,就探针不同标记方法的比较、甘蔗基因组DNA的提取、基因组DNA酶切量、酶切时间及杂交过程等方面,对地高辛标记的Southern杂交技术进行... 对甘蔗Southern杂交体系的优化,旨为转基因甘蔗Southern杂交鉴定分析提供参考。以转基因甘蔗为材料,就探针不同标记方法的比较、甘蔗基因组DNA的提取、基因组DNA酶切量、酶切时间及杂交过程等方面,对地高辛标记的Southern杂交技术进行了优化研究。结果表明,改良的CTAB法提取的甘蔗DNA能满足后期实验的要求;PCR法标记探针的效率较随机引物法标记探针的效率高,更适合用于Southern杂交;40μg的DNA在400μL酶切体系中,酶切10 h可获得良好的酶切效果;杂交温度40℃,杂交18 h,可获得清晰的杂交条带。 展开更多

关键词 甘蔗 SOUTHERN杂交 地高辛 pcr法标记探针 酶切

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全国海水浴场及经济贝类中腺病毒的分布 被引量：2

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作者 明红霞 樊景凤 +1 位作者 梁玉波 关道明 《海洋学报》 CAS CSCD 北大核心 2014年第2期108-114,共7页

为分析全国海水浴场、贝类增养殖区人类肠道腺病毒的污染状况，采用超滤浓缩方法，TaqM an探针实时定量PCR技术对其进行了定量。结果表明，全国10个海水浴场表层海水中腺病毒的阳性检出率为35％，含量为1.1×107～2.8×107 copi... 为分析全国海水浴场、贝类增养殖区人类肠道腺病毒的污染状况，采用超滤浓缩方法，TaqM an探针实时定量PCR技术对其进行了定量。结果表明，全国10个海水浴场表层海水中腺病毒的阳性检出率为35％，含量为1.1×107～2.8×107 copies/L。在离岸100 m和1000 m处腺病毒的分布无显著差别（ p＞0.05）；在调查的162份贝类样品中，腺病毒的阳性检出率为11.7％，含量为2.4×104～3.1×105 copies/g。6类经济贝类中牡蛎带病毒量最高。由此可见，全国范围内海水浴场表层海水和主要增养殖区经济贝类中腺病毒污染比较普遍，尤其以山东、辽宁和浙江三省最为严重，给洗浴者和消费者健康造成潜在威胁。人类肠道腺病毒可以很好地指示粪便污染，调查其在海水浴场和经济贝类中的分布，可以帮助公众预警胃肠道病毒的暴发流行，本研究为开展全国腺病毒的环境风险评估和分子流行病学调查奠定了良好的基础。 展开更多

关键词 人类肠道腺病毒 表层海水 经济贝类 TaqMan探针实时定量pcr技术

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五种方法检测临床标本中结核分支杆菌的比较分析 被引量：5

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作者 康润田 胡德华 +2 位作者 黄克峻 唐振良 朱庆义 《中国防痨杂志》 CAS 北大核心 2001年第1期60-60,共1页

关键词 结核分支杆菌 结核病 pcr pcr反向探针膜杂交法 病原体 抗酸染色 细菌培养 荧光染色

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