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拟南芥原生质体瞬时表达快速验证重组酶外源基因删除
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作者 池俊杰 戴绍军 +1 位作者 魏建华 王宏芝 《生物技术通报》 CAS CSCD 北大核心 2014年第7期86-92,共7页
通过在拟南芥原生质体中瞬时表达重组酶删除系统,以拟南芥热激蛋白Hsp18.2基因的启动子诱导加入马铃薯StLs1基因第2个内含子的重组酶表达,证明瞬时转化质粒DNA中位于识别位点之间的基因元件可以被有效删除。建立了一种快速验证重组酶外... 通过在拟南芥原生质体中瞬时表达重组酶删除系统,以拟南芥热激蛋白Hsp18.2基因的启动子诱导加入马铃薯StLs1基因第2个内含子的重组酶表达,证明瞬时转化质粒DNA中位于识别位点之间的基因元件可以被有效删除。建立了一种快速验证重组酶外源基因删除系统的方法。 展开更多
关键词 位点特异性重组系统 热激蛋白Hsp18 2启动子 拟南芥原生质体瞬时表达
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棉花叶肉原生质体分离及目标基因瞬时表达体系的建立 被引量:31
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作者 李妮娜 丁林云 +1 位作者 张志远 郭旺珍 《作物学报》 CAS CSCD 北大核心 2014年第2期231-239,共9页
以棉花幼嫩子叶为材料,分析影响棉花叶肉原生质体分离及目标基因转化的主要因素,以棉花叶肉原生质体为受体,建立了稳定、高效的目标基因瞬时表达与鉴定体系。技术体系包括,选择自然生长12 d的棉花幼嫩子叶为材料,混合1.5%纤维素酶、0.4... 以棉花幼嫩子叶为材料,分析影响棉花叶肉原生质体分离及目标基因转化的主要因素,以棉花叶肉原生质体为受体,建立了稳定、高效的目标基因瞬时表达与鉴定体系。技术体系包括,选择自然生长12 d的棉花幼嫩子叶为材料,混合1.5%纤维素酶、0.4%离析酶、0.5 mol L–1甘露醇、20 mmol L–1 KCl、20 mmol L–1 MES、0.1 mol L–1 CaCl2和1.0 g L–1 BSA,在28℃黑暗条件下振荡酶解8 h,可游离出浓度达1.0×106 mL–1以上的纯净棉花叶肉原生质体。利用该方法将棉花锌指蛋白基因GhZFP2整合到pJIT166-GFP质粒载体,构建了GhZFP2:GFP融合载体,采用40%PEG-4000介导转化,获得高转化率的棉花叶肉原生质体。对目标基因瞬时表达产物检测表明,GhZFP2蛋白清晰定位在细胞核上。 展开更多
关键词 棉花 原生质 PEG介导 转化 目标基因 瞬时表达
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华南象草原生质体分离及基因瞬时表达研究 被引量:6
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作者 唐然 彭小群 解新明 《草地学报》 CAS CSCD 北大核心 2015年第3期571-579,共9页
以华南象草(Pennisetum purpureum)幼叶鞘为材料,采用L_(16)(4~5)正交试验设计,对分离原生质体过程中的纤维素酶浓度、离析酶浓度、酶解液pH、甘露醇浓度、酶解时间5个因素进行筛选,建立了高效的象草叶鞘原生质体分离体系,并进行目标基... 以华南象草(Pennisetum purpureum)幼叶鞘为材料,采用L_(16)(4~5)正交试验设计,对分离原生质体过程中的纤维素酶浓度、离析酶浓度、酶解液pH、甘露醇浓度、酶解时间5个因素进行筛选,建立了高效的象草叶鞘原生质体分离体系,并进行目标基因的瞬时转化,以期为象草基因功能研究奠定基础。结果表明:叶鞘在含有1.5%纤维素酶R-10,0.75%离析酶R-10,0.5 mol·L^(-1)甘露醇,pH为5.8的酶解液中酶解4 h,原生质体产量达5.11×10~6个·g FW^(-1),活力达91.08%,酶解时间对象草原生质体产量和活力的影响最大。用PEG介导法将2个分别带有绿色荧光蛋白和红色荧光蛋白的载体转入原生质体中,转化效率最高可达77.47%,共转化效率为8.79%。所分离的原生质体可用于基因的瞬时表达研究。 展开更多
关键词 象草 原生质 PEG介导 瞬时表达
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甘蓝型油菜异三聚体G蛋白原生质体瞬时表达体系的建立
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作者 陈云 于一帆 +3 位作者 潘淑芬 周研 葛会敏 刘立军 《华北农学报》 CSCD 北大核心 2016年第6期21-25,共5页
为建立甘蓝型油菜异三聚体G蛋白各组分原生质体瞬时表达体系,以油菜叶片为试材,从试材选取、平摇时间和聚乙二醇浓度方面优化了油菜原生质体制备条件和转化条件。结果表明,选取30 d苗龄叶片、平摇10 min时原生质体游离状态最佳,产量为10... 为建立甘蓝型油菜异三聚体G蛋白各组分原生质体瞬时表达体系,以油菜叶片为试材,从试材选取、平摇时间和聚乙二醇浓度方面优化了油菜原生质体制备条件和转化条件。结果表明,选取30 d苗龄叶片、平摇10 min时原生质体游离状态最佳,产量为10.73×10~6/m L,活力可达96.4%。采用30%PEG转化原生质体时,目的蛋白表达量最高。Western Bolt的检测分析表明,异三聚体G蛋白各组分均参与了甘蓝型油菜对ABA的应答反应,当ABA浓度分别为100,150,100,50 mmol/L时,Bn GA1、Bn GB1、Bn GG2和BnRGS1蛋白的表达量最高。 展开更多
关键词 油菜 原生质瞬时表达 异三聚G蛋白
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小麦叶肉细胞原生质体制备参数解析及在基因瞬时表达上的应用 被引量:8
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作者 杜晓敏 王均 +2 位作者 安子玄 裴丹 王华忠 《华北农学报》 CSCD 北大核心 2015年第6期52-60,共9页
为建立一套稳定高效的小麦叶肉细胞原生质体制备技术流程,以小麦幼苗叶片为材料,采用正交和随机设计试验分析了影响小麦叶肉细胞原生质体产量的制备因素。结果发现,酶解条件相关因素对制备原生质体产量的影响由大到小依次为酶解液甘露... 为建立一套稳定高效的小麦叶肉细胞原生质体制备技术流程,以小麦幼苗叶片为材料,采用正交和随机设计试验分析了影响小麦叶肉细胞原生质体产量的制备因素。结果发现,酶解条件相关因素对制备原生质体产量的影响由大到小依次为酶解液甘露醇浓度、纤维素酶浓度、酶解时间和离析酶浓度;甘露醇浓度和纤维素酶浓度对原生质体产量的增长表现相互促进模式,延长酶解时间情况下低纤维素酶浓度产出的原生质体较高纤维素酶浓度破碎情况少,峰值过后的产量下降慢。研究还发现取材幼苗苗龄、光照条件和取材叶位等因素对原生质体产量也有影响。综合以上结果确定了一套优化的参数组合:以黑暗培养条件下的10 d苗龄小麦幼苗第2片真叶为材料,酶解液中的纤维素酶浓度为0.5%、离析酶浓度为0.6%、甘露醇浓度为0.5 mol/L,酶解时间为6 h,使用此参数组合制备的原生质体形状均一、破碎情况轻,产量可达(7.28±2.18)×106个/g,有活性原生质体的比例可达(95.06±2.66)%。采用PEG-Ca^(2+)介导的方法将目标基因导入制备的原生质体,结果表明GFP基因的转化效率可达(61.31±5.74)%,小麦基因Ta ATG8h和异源植物拟南芥基因At PIP2;1的蛋白质产物均定位于正确的亚细胞结构处。 展开更多
关键词 小麦 原生质 基因转化 瞬时表达
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PEG介导的柳枝稷叶肉细胞原生质体瞬时表达体系的建立 被引量:5
6
作者 祁泽文 孙鑫博 +3 位作者 樊波 张雪 袁建波 韩烈保 《草业学报》 CSCD 北大核心 2017年第9期113-120,共8页
为了建立以PEG介导的柳枝稷叶肉细胞原生质体瞬时表达体系,本研究以柳枝稷Alamo品种的叶片为材料,通过设计梯度实验确定柳枝稷原生质体分离的最佳条件,每组梯度实验重复3次,方案如下:1)对植物培养的时间进行优化。酶解时间固定在8h,甘... 为了建立以PEG介导的柳枝稷叶肉细胞原生质体瞬时表达体系,本研究以柳枝稷Alamo品种的叶片为材料,通过设计梯度实验确定柳枝稷原生质体分离的最佳条件,每组梯度实验重复3次,方案如下:1)对植物培养的时间进行优化。酶解时间固定在8h,甘露醇浓度为0.6mol/L,将培养了1,2,3和4周的黄化苗用作实验材料;2)渗透压优化。选取2周的黄化苗为实验材料,酶解时间固定在8h,甘露醇浓度分别为0.4,0.5,0.6,0.7和0.8mol/L;3)酶解时间优化。选取2周的黄化苗为实验材料,甘露醇浓度为0.6mol/L,酶解时间分别为6,7,8,9和10h。通过对比分析发现,苗龄为2周的柳枝稷黄化苗叶片在甘露醇为0.6mol/L的酶解液中,黑暗,28℃并裂解8h后分离的原生质体最为理想。接下来构建了能够在植物细胞内表达GFP-MYB103融合蛋白(GFP为绿色荧光蛋白)的重组质粒LN-OsMYB103,利用PEG介导法将质粒LN-OsMYB103转化进入柳枝稷原生质体,并且在激光共聚焦显微镜下观察到了强烈的绿色荧光蛋白信号。该结果表明,分离的原生质体可以行使正常生物学功能。综上所述,利用柳枝稷叶片建立了一套完整的柳枝稷叶肉细胞原生质体瞬时表达体系。这将为深入开展柳枝稷的功能基因组学研究奠定了基础。 展开更多
关键词 柳枝稷 PEG 原生质 瞬时表达
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沙冬青子叶原生质体瞬时表达体系的建立及其AmDREB1蛋白的亚细胞定位 被引量:7
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作者 楠迪娜 薛敏 +2 位作者 唐宽刚 任美艳 王茅雁 《植物科学学报》 CAS CSCD 北大核心 2018年第4期562-568,共7页
以沙冬青(Ammopiptanthus mongolicus(Maxim.ex Kom.)Cheng f.)幼苗的子叶为材料,对其原生质体的分离、纯化和瞬时表达体系进行了研究。结果表明,子叶原生质体分离的最佳酶解液组成为CPW溶液+3.0%纤维素酶R-10+0.5%离析酶R-10+0.3%半纤... 以沙冬青(Ammopiptanthus mongolicus(Maxim.ex Kom.)Cheng f.)幼苗的子叶为材料,对其原生质体的分离、纯化和瞬时表达体系进行了研究。结果表明,子叶原生质体分离的最佳酶解液组成为CPW溶液+3.0%纤维素酶R-10+0.5%离析酶R-10+0.3%半纤维素酶+9.0%甘露醇(p H5.8);最佳酶解条件为室温、避光、40 r/min轻摇14 h。采用W5溶液作为漂洗液将酶解物稀释后进行过滤,将过滤液在4℃、700 r/min条件下离心5 min,所得纯化原生质体的产量约为2.50×106cells/g,活力达到90%;以纯化的原生质体作为受体,利用聚乙二醇(PEG)介导法成功将植物瞬时表达载体p BI-GFP导入其中,转化效率达到50.8%。利用本研究建立的原生质体瞬时表达体系,检测到沙冬青脱水应答转录因子Am DREB1定位于细胞核内。 展开更多
关键词 沙冬青 原生质 瞬时表达 DREB转录因子 亚细胞定位
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匍匐翦股颖叶肉细胞原生质体瞬时表达体系的建立 被引量:2
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作者 李鑫 高佩然 +5 位作者 边秀举 王丽宏 李会彬 刘畅 董康挺 孙鑫博 《草地学报》 CAS CSCD 北大核心 2021年第9期2091-2097,共7页
为了建立稳定、高效的匍匐翦股颖(Agrostis stolonifera L.)叶肉细胞原生质体瞬时表达体系,本研究以匍匐翦股颖‘Penn-A4’的叶片为材料,分析不同因素对其叶肉细胞原生质体分离的影响,确定其原生质体分离的最佳条件。结果表明:苗龄为4... 为了建立稳定、高效的匍匐翦股颖(Agrostis stolonifera L.)叶肉细胞原生质体瞬时表达体系,本研究以匍匐翦股颖‘Penn-A4’的叶片为材料,分析不同因素对其叶肉细胞原生质体分离的影响,确定其原生质体分离的最佳条件。结果表明:苗龄为4周的翦股颖无菌苗叶片在甘露醇为0.6 mol·L^(-1)的酶解液中,28℃酶解4 h后,可分离得到较高活力原生质体、提取量约为6.75×106个·g^(-1);为进一步检测该原生质体是否可有效的应用在蛋白功能研究中,构建了热激蛋白基因AsHSP26.8-GFP重组质粒,并在聚乙二醇(PEG-4000)介导下将其导入叶肉细胞原生质体中进行了亚细胞定位;通过激光共聚焦显微镜观察到AsHSP26.8定位于叶绿体。综上所述,本研究建立了一套较为完整的匍匐翦股颖叶肉细胞原生质体分离与瞬时表达体系,为探究匍匐翦股颖的功能基因组学研究奠定了基础。 展开更多
关键词 匍匐翦股颖 原生质 瞬时表达 亚细胞定位
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转基因在菊花叶肉原生质体瞬时表达及亚细胞定位分析 被引量:1
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作者 丁林云 万可 +4 位作者 杨丹 王同 王春梅 郭书巧 杨霞 《江苏农业学报》 CSCD 北大核心 2023年第2期518-524,共7页
为探究用于亚细胞定位研究的菊花叶肉原生质体分离的最适条件,本研究以菊花无菌苗叶片为受体材料,分析不同叶龄叶片和酶解时间对菊花原生质体细胞产量的影响,并利用外源质粒的导入验证了聚乙二醇(PEG)介导的菊花原生质体瞬时转化体系。... 为探究用于亚细胞定位研究的菊花叶肉原生质体分离的最适条件,本研究以菊花无菌苗叶片为受体材料,分析不同叶龄叶片和酶解时间对菊花原生质体细胞产量的影响,并利用外源质粒的导入验证了聚乙二醇(PEG)介导的菊花原生质体瞬时转化体系。结果表明,以组织培养14 d的菊花无菌苗叶片为外植体材料,在含1.5%纤维素酶、0.4%离析酶和0.8 mol/L甘露醇的酶解液中振荡酶解6 h,能获得高产的原生质体细胞。采用PEG介导的瞬时转化含绿色荧光蛋白(GFP)的表达载体,在菊花原生质体细胞中观察到强烈的绿色荧光信号。结果显示,稗草乙烯转录因子基因(EcERF)在菊花原生质体中与本氏烟草叶片中的瞬时表达一致,EcERF基因定位于细胞核中。 展开更多
关键词 菊花 原生质 瞬时表达 亚细胞定位
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浮萍原生质体瞬时表达体系的建立及其应用研究 被引量:2
10
作者 宋乐元 方扬 +2 位作者 田润 杜安平 王海燕 《西南农业学报》 CSCD 北大核心 2020年第8期1792-1798,共7页
【目的】建立浮萍原生质体瞬时表达体系,以加快浮萍生物反应器工程的开发进程。【方法】采用酶解法制备浮萍原生质体,通过对愈伤组织类型、渗透压、预处理方法等一系列参数的优化调整,建立了浮萍原生质体制备方法。利用农杆菌介导外源... 【目的】建立浮萍原生质体瞬时表达体系,以加快浮萍生物反应器工程的开发进程。【方法】采用酶解法制备浮萍原生质体,通过对愈伤组织类型、渗透压、预处理方法等一系列参数的优化调整,建立了浮萍原生质体制备方法。利用农杆菌介导外源基因进入浮萍愈伤组织,并制备原生质体观察瞬时表达情况,通过对农杆菌种类、菌浓度、乙酰丁香酮浓度及共培养时间等参数进行调整,筛选最佳的浸染条件。最后利用该瞬时表达体系进行亚细胞定位研究和启动子功能验证。【结果】原生质体制备的最佳条件为:以4℃过夜培养的浮萍悬浮培养愈伤组织为制备材料,用酶液(2%纤维素酶、0.5%离析酶、0.5%果胶酶、0.1 mol/L CaCl2、0.2 mol/L KCl、1%BSA、20 mmol/L MES pH 5.8、0.5 mol/L甘露醇)于25℃避光消化16 h(40 r/min);农杆菌浸染最佳条件为:农杆菌GV301在菌浓度(OD600)为1、乙酰丁香酮浓度为100μmol/L时,浸染悬浮培养愈伤有最大转化率。【结论】成功建立了浮萍原生质体瞬时表达体系,并证明其可用于亚细胞定位和启动子功能验证等方面的研究。 展开更多
关键词 浮萍Lemna gibba 原生质 瞬时表达 亚细胞定位 启动子功能
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柱花草叶肉原生质体提取与瞬时表达体系构建 被引量:2
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作者 高静 杨丽云 +1 位作者 张世子 蒋凌雁 《草地学报》 CAS CSCD 北大核心 2023年第3期893-902,共10页
柱花草(Stylosanthes guianensis)是一种重要的热区豆科牧草,为利用原生质体瞬时表达体系开展柱花草基因功能研究,以20 d龄期‘热研5号’柱花草子叶为试验材料,通过正交试验考察不同因素对原生质体分离及转化效率的影响。结果表明:采用1... 柱花草(Stylosanthes guianensis)是一种重要的热区豆科牧草,为利用原生质体瞬时表达体系开展柱花草基因功能研究,以20 d龄期‘热研5号’柱花草子叶为试验材料,通过正交试验考察不同因素对原生质体分离及转化效率的影响。结果表明:采用1.5%纤维素酶、1.25%离析酶、0.5 mol·L^(-1)甘露醇和4 mmol·L^(-1)MES酶解液组合,酶解时间为16 h时,原生质体的产量和活性均达到最佳,分别为(4.567×10^(6))个·g^(-1)和92.271%;原生质体浓度为(6×10^(5))个·mL^(-1)、质粒浓度为0.6μg·μL^(-1),PEG-4000浓度为50%、转化时间为5 min时,转化效率最高,可达52.524%。构建了目标蛋白SgRKL1表达载体pA7-BIUTNT::SgRKL1-GFP,利用PEG介导法将其转入柱花草原生质体,激光扫描共聚焦显微镜检测结果显示SgRKL1蛋白定位于细胞膜上,说明所建立的柱花草叶肉原生质体瞬时表达体系可应用于目标基因的瞬时表达和亚细胞定位研究。 展开更多
关键词 柱花草 叶肉原生质 酶解 PEG介导 瞬时表达
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结缕草叶肉细胞原生质体瞬时基因表达系统的构建 被引量:1
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作者 管瑾 郭一荻 +2 位作者 刘凌云 尹淑霞 滕珂 《草业学报》 CSCD 北大核心 2023年第7期61-71,共11页
为了结合转基因方法探索结缕草基因功能,建立高效、快速的结缕草原生质体制备及瞬时基因表达系统,利用正交试验对影响原生质体制备的主要因素进行优化,同时利用原生质体进行亚细胞定位和蛋白互作研究。结果表明,当酶配比为2%(w/v) cellu... 为了结合转基因方法探索结缕草基因功能,建立高效、快速的结缕草原生质体制备及瞬时基因表达系统,利用正交试验对影响原生质体制备的主要因素进行优化,同时利用原生质体进行亚细胞定位和蛋白互作研究。结果表明,当酶配比为2%(w/v) cellulase R10和1.5%(w/v) macerozyme R10,酶解时间为7 h时,原生质体产量和活性均达到最高,分别为1.23×107个·mL^(-1)和98%以上,满足后续转化所需。多次重复试验表明,加入5~10μg质粒,原生质体转化率可达75%以上。利用原生质体转化体系进行了亚细胞定位检测,结果发现结缕草ZjNOL和ZjNYC1定位在叶绿体中,ZjZFN定位在细胞核中。双分子荧光互补分析证明ZjNOL和ZjNYC1在叶绿体中相互作用。原生质体制备及转化方法与遗传学和组学技术相结合,能够为结缕草基因功能研究和基因编辑提供支持。 展开更多
关键词 结缕草 原生质 瞬时基因表达 亚细胞定位 蛋白互作
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利用R基因RRS1/RPS4探索水稻原生质体瞬时表达转化体系的研究 被引量:8
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作者 李丽 赵彦丰 +1 位作者 吴琪琦 黄燕 《四川农业大学学报》 CSCD 北大核心 2021年第3期297-306,315,共11页
【目的】将拟南芥TNL型R基因RRS1/RPS4转入水稻原生质体中,探索瞬时表达转化体系的最佳条件,并分析AtRRS1/AtRPS4对水稻内源ETI下游抗病基因表达的影响,为揭示水稻EDS1是否参与ETI反应途径提供实验依据。【方法】以日本晴两叶一心期幼... 【目的】将拟南芥TNL型R基因RRS1/RPS4转入水稻原生质体中,探索瞬时表达转化体系的最佳条件,并分析AtRRS1/AtRPS4对水稻内源ETI下游抗病基因表达的影响,为揭示水稻EDS1是否参与ETI反应途径提供实验依据。【方法】以日本晴两叶一心期幼苗为植物材料,设计不同梯度的PEG浓度(30%、35%、40%)、转化时的质粒浓度(0.5、1、2μg/μL)以及PEG介导的转化温度(0、18、37℃),利用Box-Benhnken设计三因素三水平来分析不同参数组合条件下对转化效果的影响,并对原生质体转化效率进行预测和试验验证。随后,利用该瞬时系统表达拟南芥TNL型R基因RRS1/RPS4,并通过检测水稻内源抗病标志基因的表达水平来揭示其对水稻抗病能力的影响。【结果】经过试验验证得到水稻原生质体转化最佳条件:PEG浓度36.16%、质粒浓度1.72μg/μL、转化温度37℃,该组合条件下转化效率可达75%;利用该优化体系开展的瞬转研究发现拟南芥TNL型R基因/基因对RRS1/RPS4能显著提高水稻原生质体中抗病相关基因的表达。【结论】构建了高效的水稻原生质体瞬时转化系统,并以此为平台,研究揭示了拟南芥TNL型R基因RRS1/RPS4可能通过水稻内源的EDS1去诱导ETI下游抗病免疫反应的发生。 展开更多
关键词 水稻 原生质 瞬时表达 R基因 转化
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葡萄原生质体分离及瞬时转化体系的建立 被引量:25
14
作者 舒小娟 温腾建 +2 位作者 邢佳毅 卢龙 胡建芳 《西北植物学报》 CAS CSCD 北大核心 2015年第6期1262-1268,共7页
为了建立葡萄原生质体进行遗传转化的技术,该研究以葡萄品种‘黑香蕉’的叶片和愈伤组织为材料,分析纤维素酶和离析酶的浓度与配比、渗透压和酶解时间等主要因素对葡萄原生质体分离的影响,探讨建立稳定、高效的葡萄原生质体分离与瞬时... 为了建立葡萄原生质体进行遗传转化的技术,该研究以葡萄品种‘黑香蕉’的叶片和愈伤组织为材料,分析纤维素酶和离析酶的浓度与配比、渗透压和酶解时间等主要因素对葡萄原生质体分离的影响,探讨建立稳定、高效的葡萄原生质体分离与瞬时转化体系,为鉴定目标基因的功能奠定基础。结果表明:(1)葡萄叶片原生质体的分离以3.0%纤维素酶和0.75%离析酶的酶组合,在0.6mol/L甘露醇溶液中,酶解14h为宜,每克游离产量为4.09×106个原生质体,活力为83.12%。(2)葡萄愈伤组织原生质体的分离以2.0%纤维素酶和0.5%离析酶的酶组合,在0.5mol/L甘露醇溶液中,酶解14h为宜,每克游离产量为6.05×106个原生质体,活力为84.13%。(3)利用该方法得到的葡萄原生质体为受体,采用40%PEG-4000介导转化质粒载体pEZS-NL,目标基因瞬时表达产物检测表明,GFP蛋白表达稳定、清晰。该研究建立的葡萄原生质体制备和转化体系,可以用较少量的质粒DNA获得外源基因在原生质体内的表达,为葡萄功能基因的研究提供技术支持。 展开更多
关键词 葡萄 原生质 叶片 愈伤组织 遗传转化 瞬时表达
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油棕叶肉原生质体分离及瞬时转化体系的建立 被引量:7
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作者 王一菲 刘新星 +2 位作者 张青 郑育声 李东栋 《华中农业大学学报》 CAS CSCD 北大核心 2021年第1期154-159,共6页
以油棕试管苗幼嫩叶片(发芽后25 d)为材料,建立油棕叶肉原生质体分离及瞬时转化体系。取幼嫩油棕叶片在30 g/L纤维素酶和8 g/L离析酶的作用下,酶解3.5 h后,2000 r/min、4℃离心5 min得到油棕叶肉原生质体。借助绿色荧光蛋白和红色荧光... 以油棕试管苗幼嫩叶片(发芽后25 d)为材料,建立油棕叶肉原生质体分离及瞬时转化体系。取幼嫩油棕叶片在30 g/L纤维素酶和8 g/L离析酶的作用下,酶解3.5 h后,2000 r/min、4℃离心5 min得到油棕叶肉原生质体。借助绿色荧光蛋白和红色荧光蛋白双质粒瞬时共转化,对油棕叶肉原生质体瞬时体系的相关参数进行优化,结果显示:当瞬时转化过程中质粒含量比为8∶1,PEG/Mg^2+溶液中PEG4000的质量浓度为200 g/L、Mg^2+溶液质量浓度为100 g/L,热激20 min,再经过20 min室温孵育,最后加入的洗液体积为2 mL时,原生质体的转化效率最高。 展开更多
关键词 油棕 试管苗 同源表达 原生质 瞬时转化 功能验证 植株再生 亚细胞定位 蛋白质互作
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两种瞬时表达体系研究拟南芥Profilin-1的亚细胞定位 被引量:4
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作者 张晓慧 韩榕 《生物技术通报》 CAS CSCD 北大核心 2017年第5期57-62,共6页
使用两种瞬时表达方法研究Profilin-1(PRF1)的亚细胞定位,并比较了2种瞬时表达体系在亚细胞定位研究中的优缺点。利用拟南芥幼叶作为材料,提取叶片的RNA,采用特异性引物RT-PCR的方法克隆PRF1基因,连接到p CAMBIA1300-GFP的改造载体上,... 使用两种瞬时表达方法研究Profilin-1(PRF1)的亚细胞定位,并比较了2种瞬时表达体系在亚细胞定位研究中的优缺点。利用拟南芥幼叶作为材料,提取叶片的RNA,采用特异性引物RT-PCR的方法克隆PRF1基因,连接到p CAMBIA1300-GFP的改造载体上,成功的构建p CAMBIA1300-GFP-PRF1的表达载体。然后分别利用PEG转化拟南芥原生质体、农杆菌浸染烟草叶片两种技术进行了瞬时表达,并在激光共聚焦显微镜下观察绿色荧光蛋白(GFP)融合蛋白的表达。研究结果表明,将PRF1基因导入拟南芥的原生质体和烟草表皮细胞后,融合蛋白绿色荧光均能被观察到,PRF1基因与GFP融合蛋白的产物在烟草表皮细胞中主要定位在细胞质和外周细胞器中,在拟南芥的原生质体中的细胞核和细胞质中都有定位。两种不同的瞬时表达体系中PRF1蛋白的定位出现了不同,这可能与同源或异源表达的植物的特性相关。 展开更多
关键词 拟南芥 PRF1 瞬时表达 原生质 GFP
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普通小麦幼苗叶肉细胞原生质体分离方法的优化 被引量:5
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作者 席海秀 艾可筠 佟少明 《生物技术通报》 CAS CSCD 北大核心 2016年第4期68-73,共6页
以7日龄小麦幼苗的叶肉细胞为材料,采用正交试验分析了纤维素酶浓度、离析酶浓度、酶解时间、甘露醇浓度对原生质体分离时的产量和活力的影响;采用瞬时表达技术通过PEG-Ca^(2+)介导法转化小麦的原生质体,分析了PEG浓度对转化效率的影响... 以7日龄小麦幼苗的叶肉细胞为材料,采用正交试验分析了纤维素酶浓度、离析酶浓度、酶解时间、甘露醇浓度对原生质体分离时的产量和活力的影响;采用瞬时表达技术通过PEG-Ca^(2+)介导法转化小麦的原生质体,分析了PEG浓度对转化效率的影响。结果表明,小麦叶片原生质体分离的最佳条件为纤维素酶1.5%,离析酶0.75%,甘露醇0.4 mol/L,酶解时间3 h,得到的原生质体的产量可达到7.2×10~6个/g·FW,活力超过95%;瞬时表达实验结果表明,在25%PEG浓度下,小麦原生质体的转化效率最高。 展开更多
关键词 普通小麦 原生质 分离 瞬时表达
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玉米转录因子ABP9瞬时表达体系的建立 被引量:1
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作者 陈晓晶 潘振 赵军 《安徽农业科学》 CAS 2014年第9期2554-2558,共5页
[目的]研究玉米抗逆相关转录因子ABP9在玉米抗逆应答中的功能及其表达调控机理。[方法]以2叶期玉米叶片为材料分离原生质体,通过PEG介导的转化方法,建立玉米叶肉原生质体瞬时表达ABP9的系统。利用该系统,通过反转录PCR和Western blot分... [目的]研究玉米抗逆相关转录因子ABP9在玉米抗逆应答中的功能及其表达调控机理。[方法]以2叶期玉米叶片为材料分离原生质体,通过PEG介导的转化方法,建立玉米叶肉原生质体瞬时表达ABP9的系统。利用该系统,通过反转录PCR和Western blot分别检测ABP9genomic∷FLAG融合基因在原生质体中的转录和翻译;并通过转化ABP9∷GFP融合表达载体和GFP荧光检测,对ABP9进行亚细胞定位。[结果]玉米原生质体瞬时表达ABP9系统中,ABP9genomic∷FLAG融合基因能够正确转录出mRNA并翻译出蛋白质;利用该系统进行亚细胞定位结果显示ABP9定位于细胞核中。[结论]玉米原生质体瞬时表达ABP9体系的建立,为进一步探究玉米中ABP9的表达和调控提供了良好的实验系统。 展开更多
关键词 玉米(Zea mays L ) 转录因子 ABP9(ABRE BINDING PROTEIN 9) 原生质瞬时表达
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植物原生质体的廉价电激装置 被引量:1
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作者 朱遐 《生物技术通报》 CAS CSCD 1991年第6期14-14,共1页
能够直接将遗传物质导入原生质体的商品化电激装置,工作原理是由电子产生指数衰变或矩形电脉冲.这种电激装置相当昂贵. 在Danisco AIS,M.Joersbo和J.Brunstedt研究了利用壁孔使植物原生质体电激过程中电流改变(AC)的可行性.他们用220V... 能够直接将遗传物质导入原生质体的商品化电激装置,工作原理是由电子产生指数衰变或矩形电脉冲.这种电激装置相当昂贵. 在Danisco AIS,M.Joersbo和J.Brunstedt研究了利用壁孔使植物原生质体电激过程中电流改变(AC)的可行性.他们用220V输电线提供AC脉冲. 展开更多
关键词 电激 植物原生质 电子产生 壁孔 工作原理 瞬时表达
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牧草原生质体的分离培养及应用
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作者 周蝶 王慧 +1 位作者 蔺孟卓 毕晓静 《草学》 2023年第4期53-59,共7页
原生质体是指利用一定方法去除细胞壁的裸露细胞,是一种无细胞壁的良好研究材料,在基因组学、转录组学、蛋白质组学、代谢组学和表观遗传学分析上均有广泛应用。原生质体培养体系的构建包括制备材料的选择和预处理、原生质体的分离和纯... 原生质体是指利用一定方法去除细胞壁的裸露细胞,是一种无细胞壁的良好研究材料,在基因组学、转录组学、蛋白质组学、代谢组学和表观遗传学分析上均有广泛应用。原生质体培养体系的构建包括制备材料的选择和预处理、原生质体的分离和纯化、原生质体的培养与再生。牧草原生质体的相关研究较少,紫花苜蓿等常用牧草也尚未建立稳定的原生质体体系。本文对牧草原生质体分离纯化、培养再生及其应用的研究进展进行综述,旨在为牧草原生质体相关的研究提供参考。 展开更多
关键词 牧草 原生质 培养 瞬时表达 细胞杂交
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