人源性抗SARS-CoV-2单链抗体文库的构建及广谱中和抗体的筛选与鉴定

1

作者 尹慧敏 吕海 +3 位作者 迟莹 刘静娴 焦永军 卫平民 《细胞与分子免疫学杂志》 北大核心 2025年第2期154-160,共7页

目的构建人源性抗严重急性呼吸综合征冠状病毒2(SARS-CoV-2)单链可变片段(scFv)抗体文库,并筛选具有广谱中和活性的抗体,为诊断和治疗制剂的开发提供候选分子。方法从新型冠状病毒感染康复者外周血中分离单个核淋巴细胞(PBMC),提取总RNA... 目的构建人源性抗严重急性呼吸综合征冠状病毒2(SARS-CoV-2)单链可变片段(scFv)抗体文库,并筛选具有广谱中和活性的抗体,为诊断和治疗制剂的开发提供候选分子。方法从新型冠状病毒感染康复者外周血中分离单个核淋巴细胞(PBMC),提取总RNA,逆转录成cDNA,以此为模板构建人源性抗SARS-CoV-2 scFv抗体文库;利用噬菌体展示技术筛选对SARS-CoV-2 S蛋白具有特异性的scFv抗体。通过序列分析和人源IgG抗体表达,合成IgG全抗体,并评估其对SARS-CoV-2的结合能力及中和活性。结果成功构建了库容量为1.56×10^(7)CFU的SARS-CoV-2人源性scFv抗体文库,筛选出两种特异性scFv抗体;并将scFv抗体表达成IgG形式的全抗体(IgG-A10和IgG-G6),其中IgG-A10对SARS-CoV-2原始株(WT)和奥密克戎亚型变异毒株XBB(XBB)毒株均具有较好中和活性,对奥密克戎BA.2.86变异株的第二代亚分支JN.1(JN.1)毒株中和效果一般。结论本研究从康复者外周血中成功构建了人源性抗SARS-CoV-2 scFv抗体文库,并筛选表达出具有中和活性的抗SARS-CoV-2 IgG抗体,为SARS-CoV-2感染的预防、诊断和治疗奠定了基础。 展开更多

关键词 SARS-CoV-2 单链可变片段(scFv) 噬菌体展示技术 中和抗体

在线阅读 下载PDF 职称材料

丙型肝炎病毒包膜蛋白E2人源单链可变区抗体的筛选与鉴定 被引量：3

2

作者 钟彦伟 成军 +2 位作者 施双双 王刚 陈菊梅 《解放军医学杂志》 CAS CSCD 北大核心 2003年第1期53-54,共2页

采用噬菌体表面展示技术 ,以重组的HCV结构蛋白E2为固相包被抗原 ,从半合成的噬菌体单链可变区抗体库中经过 3轮“吸附 洗脱 扩增”筛选过程 ,获得抗原特异性和结合活性较强的HCVE2人源单链可变区抗体 (ScFv)片段 ,片段为 771bp,阳性克... 采用噬菌体表面展示技术 ,以重组的HCV结构蛋白E2为固相包被抗原 ,从半合成的噬菌体单链可变区抗体库中经过 3轮“吸附 洗脱 扩增”筛选过程 ,获得抗原特异性和结合活性较强的HCVE2人源单链可变区抗体 (ScFv)片段 ,片段为 771bp,阳性克隆 ,对其进行免疫学检测 ,并对HCVE2特异性ScFv的编码基因序列进行测定分析。结果筛选得到的HCVE2ScFv片段 (771bp) 展开更多

关键词 丙型肝炎病毒 包膜蛋白E2 人源单链可变区抗体 筛选 鉴定

在线阅读 下载PDF 职称材料

丙型肝炎病毒核心蛋白抗独特型人源单链可变区抗体的筛选与鉴定 被引量：5

3

作者 钟彦伟 成军 +5 位作者 王刚 洪源 王琳 李莉 张玲霞 陈菊梅 《解放军医学杂志》 CAS CSCD 北大核心 2003年第1期28-30,共3页

为制备抗丙型肝炎病毒核心蛋白的抗独特型单链可变区抗体 (抗 IdscFv) ,采用噬菌体表面展示技术 ,将抗 HCV核心蛋白的单克隆抗体固相包被于Nunc板 ,从噬菌体单链可变区抗体库中经过 5轮“吸附 洗脱 扩增”筛选过程 ,获得可与HCV核心蛋... 为制备抗丙型肝炎病毒核心蛋白的抗独特型单链可变区抗体 (抗 IdscFv) ,采用噬菌体表面展示技术 ,将抗 HCV核心蛋白的单克隆抗体固相包被于Nunc板 ,从噬菌体单链可变区抗体库中经过 5轮“吸附 洗脱 扩增”筛选过程 ,获得可与HCV核心蛋白单克隆抗体结合的抗独特型人源单链可变区抗体的噬菌体集落。随机挑选 6 0个克隆 ,利用酶联免疫吸附法 (ELISA)、交叉反应和竞争抑制实验 ,对其进行免疫学检测和鉴定。获得与HCV核心蛋白单克隆抗体结合活性较强的抗 IdscFv阳性克隆 ,并对HCV核心蛋白特异性抗 IdscFv的编码序列进行测定分析。结果经过 5轮“吸附 洗脱 扩增”筛选 ,在随机挑选的 6 0个克隆中 ,有 2 0株克隆ELISA的吸光度(A4 5 0nm)值较高 ,这些噬菌体上清与牛血清白蛋白 (BSA)进行交叉反应后 ,确定了其中有 6株交叉反应较弱 ,结合 2次ELISA重复实验的A值及竞争抑制实验结果 ,最后确定 1株阳性克隆 ,提取质粒 ,进行DNA序列测定 ,DNA大小为 76 8bp。本实验结果提示用噬菌体抗体库技术能够成功地获得抗 HCV核心蛋白的抗 IdscFv ,为开展用抗 展开更多

关键词 丙型肝炎病毒 核心蛋白 抗独特型人源单链可变区抗体 筛选 鉴定

在线阅读 下载PDF 职称材料

丙型肝炎病毒NS4A抗独特型人源单链可变区抗体的筛选与鉴定 被引量：4

4

作者 钟彦伟 成军 +5 位作者 王刚 洪源 王琳 李莉 张玲霞 陈菊梅 《解放军医学杂志》 CAS CSCD 北大核心 2003年第1期37-39,共3页

为探索新型治疗方法 ,制备抗丙型肝炎病毒(HCV)非结构蛋白NS4A的抗独特型人源单链可变区抗体 (抗 IdscFv) ,采用噬菌体表面展示技术 ,将抗HCVNS4A单克隆抗体固相包被于Nunc板 ,应用半合成的人源单链可变区抗体文库技术 ,从噬菌体单链可... 为探索新型治疗方法 ,制备抗丙型肝炎病毒(HCV)非结构蛋白NS4A的抗独特型人源单链可变区抗体 (抗 IdscFv) ,采用噬菌体表面展示技术 ,将抗HCVNS4A单克隆抗体固相包被于Nunc板 ,应用半合成的人源单链可变区抗体文库技术 ,从噬菌体单链可变区抗体库中经过 5轮“吸附 洗脱 扩增”筛选过程 ,随机挑选 82个克隆 ,利用酶联免疫吸附法 (ELISA)、交叉反应和竞争抑制实验 ,对其进行免疫学检测和鉴定 ,获得与HCVNS4A单克隆抗体结合活性较强的抗 IdscFv阳性克隆 ,并对HCVNS4A特异性抗 IdscFv的编码基因进行序列测定分析。结果 ,经过筛选 82个克隆中有 4 0株克隆ELISA的吸光度 (A4 5 0nm)值较高 ,将这些噬菌体上清与牛血清白蛋白 (BSA)进行交叉反应 ,确定其中有 7株交叉反应较弱 ,结合 2次ELISA重复实验的A值及竞争抑制实验结果 ,最后确定 1株阳性克隆。提取质粒 ,进行DNA序列测定 ,DNA为 789bp。本实验结果提示 ,用噬菌体抗体库技术能够成功地获得抗HCVNS4A的抗 IdscFv,为开展用抗 展开更多

关键词 丙型肝炎病毒 NS4A 抗独特型人源单链可变区抗体 筛选 鉴定

在线阅读 下载PDF 职称材料

丙型肝炎病毒核心蛋白人源抗独特型单链抗体在大肠杆菌中的表达 被引量：1

5

作者 钟彦伟 成军 +3 位作者 张忠东 李强 李莉 陈菊梅 《解放军医学杂志》 CAS CSCD 北大核心 2004年第1期10-12,共3页

目的　在大肠杆菌中表达丙型肝炎病毒核心蛋白人源抗独特型单链抗体。方法　采用噬菌体表面展示技术 ,将丙型肝炎病毒 (HCV)核心蛋白单克隆抗体固相包被于Nunc板。从人源噬菌体单链可变区抗体库中经过 3轮“吸附 洗脱 扩增”的筛选 ,获... 目的　在大肠杆菌中表达丙型肝炎病毒核心蛋白人源抗独特型单链抗体。方法　采用噬菌体表面展示技术 ,将丙型肝炎病毒 (HCV)核心蛋白单克隆抗体固相包被于Nunc板。从人源噬菌体单链可变区抗体库中经过 3轮“吸附 洗脱 扩增”的筛选 ,获得结合活性较强的人源HCV核心蛋白抗独特型 (抗 Id)scFv阳性克隆。从阳性克隆中提取质粒 ,经SfiⅠ/NotⅠ酶切鉴定后 ,亚克隆到pCANTAB5E载体 ,转化大肠杆菌XL1 Blue ,应用异丙基硫代 β D 半乳糖苷 (IPTG)诱导表达可溶性的HCV核心蛋白抗独特型单链可变区抗体。酶联免疫吸附法 (ELISA)证实表达的HCV核心蛋白抗 IdscFv具有与HCV核心蛋白单克隆抗体反应的特异性。对转化的大肠杆菌XL1 Blue上清中表达的HCV核心蛋白抗 IdscFv进行硫酸铵沉淀 ,并进行SDS PAGE电泳。结果　筛选得到的HCV核心蛋白抗 IdscFv片段基因由 774bp组成。SDS PAGE电泳表明 ,大肠杆菌XL1 Blue中表达的可溶性HCV核心蛋白抗 IdscFv分子量约 2 8kD。结论　HCV核心蛋白抗 IdscFv与HCV核心蛋白抗 IdscFv单克隆抗体具有较强的结合活性和特异性。HCV核心蛋白抗 IdscFv的筛选和表达成功 ,为今后HCV核心蛋白抗 IdscFv的研究和应用奠定了基础。 展开更多

关键词 C型肝炎样病毒属 病毒核心蛋白质类 抗独特型单链可变区抗体 基因表达

在线阅读 下载PDF 职称材料

特异性结合革兰氏阴性菌外膜蛋白C的单链抗体核糖体展示文库的构建

6

作者 王潇 王秀敏 +3 位作者 管庆丰 滕达 姚军虎 王建华 《中国饲料》 北大核心 2015年第9期19-22,29,共5页

以纯化的重组大肠杆菌外膜蛋白Omp C免疫BALB/c小鼠,提取骨髓浆细胞总RNA,逆转录获得c DNA,作为模板通过PCR扩增获得重链和轻链可变区序列。由(Gly4Ser)3 linker连接两片段,获得单链抗体可变区片段基因库。重叠延伸PCR添加T7启动子、核... 以纯化的重组大肠杆菌外膜蛋白Omp C免疫BALB/c小鼠,提取骨髓浆细胞总RNA,逆转录获得c DNA,作为模板通过PCR扩增获得重链和轻链可变区序列。由(Gly4Ser)3 linker连接两片段,获得单链抗体可变区片段基因库。重叠延伸PCR添加T7启动子、核糖体结合位点、gⅢtether和两端茎环结构等元件,成功构建对外膜蛋白C具有特异性亲和力的单链抗体可变区的核糖体展示文库,为特异性强、亲和力高的单链抗体可变区筛选提供了技术和材料基础。构建能与革兰氏阴性菌外膜蛋白C特异性结合的鼠源单链抗体核糖体展示文库,是奠定构建饲料革兰氏阴性腐败菌分子预警和靶向抗菌剂的靶向定位区的高亲和力单链抗体可变区片段的重要基础,对建立有害革兰氏阴性菌分子检测方法和靶向抗革兰氏阴性菌菌剂设计方法具有借鉴作用。 展开更多

关键词 外膜蛋白C 单链抗体可变区片段 核糖体展示 文库

在线阅读 下载PDF 职称材料

一种可溶性单抗ScFv片段的表达及鉴定 被引量：1

7

作者 钟小林 高会广 +1 位作者 吉清 黄刚 《第三军医大学学报》 CAS CSCD 北大核心 2003年第8期691-694,共4页

目的　利用E .coliHB2 15 1表达结肠癌单抗MC3的单链可变区片段 (Singlechainvariablefragment,ScFv) ,纯化并鉴定其抗原结合活性 ,为结肠癌体内诊断和治疗性研究提供靶向载体分子。方法　利用呈现ScFv抗体的重组噬菌体感染大肠杆菌HB2 ... 目的　利用E .coliHB2 15 1表达结肠癌单抗MC3的单链可变区片段 (Singlechainvariablefragment,ScFv) ,纯化并鉴定其抗原结合活性 ,为结肠癌体内诊断和治疗性研究提供靶向载体分子。方法　利用呈现ScFv抗体的重组噬菌体感染大肠杆菌HB2 15 1进行可溶性抗体表达 ,经点印迹和Western印迹检测可溶性单抗ScFv的表达水平 ,经ELISA检测可溶性ScFv的抗原结合活性。用双脱氧法对组成ScFvDNA的VH和VLDNA进行序列测定。结果　可溶性MC3ScFv获得了成功表达 ,表达产物主要位于周质腔中 ,其分子量约为 3 2× 10 3。来自所获得的 3个克隆周质提取物均能抑制单抗与高水平表达MC3结合抗原的AGS细胞结合 ,抑制率分别为 41.19%、3 6.89%、3 3 .77%。对ScFv的VH和VLDNA的测序结果表明所获抗体的可变区基因属IgG1亚族 ,κ型。结论　利用大肠杆菌HB2 15 1成功表达了具有抗原结合活性的MC3ScFv ,为拓展该抗体的应用范围奠定了基础。 展开更多

关键词 结肠癌 单克隆抗体 单链可变区片段 噬菌体

在线阅读 下载PDF 职称材料

抗人CD3人/鼠嵌合抗体的表达及特性

8

作者 杨治华 刘向阳 +4 位作者 田海梅 李洁 李以莞 沈德诚 佘鸣 《中国肿瘤生物治疗杂志》 CAS CSCD 1995年第2期114-119,共6页

将从HIT3a基因库分离克隆的功能性抗CD3轻重链可变区基因插入含有人κ轻链γ1重链恒定区基因的哺乳动物表达载体中,构建了抗CD3嵌合抗体基因.用Lipofectin将抗CD3人/鼠嵌合轻重链基因共转染SP2/O细胞表达,获得稳定传代和稳定表达抗CD3... 将从HIT3a基因库分离克隆的功能性抗CD3轻重链可变区基因插入含有人κ轻链γ1重链恒定区基因的哺乳动物表达载体中,构建了抗CD3嵌合抗体基因.用Lipofectin将抗CD3人/鼠嵌合轻重链基因共转染SP2/O细胞表达,获得稳定传代和稳定表达抗CD3嵌合抗体的转染杂交瘤细胞株C-HIT3a.ELISA、免疫荧光和PCR实验证实嵌合抗体与原鼠CD3单抗有相同的特异性和亲和性.体外生物活性的初步分析表明嵌合抗体与鼠CD3单抗对人的PBMC细胞的增殖有相同类型的作用.高剂量抗体抑制人T细胞的增殖,低剂量显示明显的激活增殖作用.当与IL-2联合应用其激活增殖作用增加20倍.细胞毒实验表明嵌合CD3抗体或由该抗体介导的免疫活性细胞(CD3-AK)对多种肿瘤细胞有明显的杀伤活性,较单用IL-2或单用LAK细胞其杀伤活性增加25倍. 展开更多

关键词 嵌合抗体 CD3单抗 抗C 表达载体 抗人CD3 杀伤活性 IL-2 分离克隆 重链可变区 哺乳动物

在线阅读 下载PDF 职称材料

融合蛋白anti-HER2-ScFv-GFP在昆虫细胞中的表达及其靶向结合乳腺癌细胞的功能分析 被引量：3

9

作者 高国辉 王金丹 +5 位作者 黄奇迪 杨纪峰 杨水兵 包兵兵 张羽 胡孝渠 《中国病理生理杂志》 CAS CSCD 北大核心 2011年第5期1034-1040,共7页

目的:利用昆虫细胞-杆状病毒表达系统表达获得携带绿色荧光蛋白(GFP)的抗人表皮生长因子受体2(HER2)的单链抗体可变区片段(ScFv),分析其靶向结合乳腺癌细胞表面受体HER2的功能。方法:构建融合基因anti-HER2-ScFv-GFP,重组获得真核表达... 目的:利用昆虫细胞-杆状病毒表达系统表达获得携带绿色荧光蛋白(GFP)的抗人表皮生长因子受体2(HER2)的单链抗体可变区片段(ScFv),分析其靶向结合乳腺癌细胞表面受体HER2的功能。方法:构建融合基因anti-HER2-ScFv-GFP,重组获得真核表达载体重组子pFAST Bac-to-Bac HT A/anti-HER2-ScFv-GFP,转化DH10Bac,收集重组病毒bacmid,分别转染、感染粉纹夜蛾细胞Tn-5B1-4,SDS-PAGE及Westernblotting分析融合蛋白表达产物。Ni2+-NTA亲和层析法纯化anti-HER2-ScFv-GFP融合蛋白后分别滴入乳腺癌细胞HER2阳性的SKBR3和HER2阴性的MCF7,对比携带绿色荧光的抗HER2单链抗体靶向结合乳腺癌细胞表面HER2受体情况。结果:获得长度约1 539 bp的融合基因anti-HER2-ScFv-GFP,感染重组病毒的Tn-5B1-4细胞膜附近有明显绿色荧光,SDS-PAGE、Western blotting法检测到60 kD的特异性条带。结合实验显示HER2阳性的SKBR3细胞表面有明显绿色荧光,而HER2阴性的MCF7细胞表面荧光易被洗脱。结论:在Tn-5B1-4中成功表达携带绿色荧光的融合蛋白anti-HER2-ScFv-GFP,该携带绿色荧光的抗HER2单链抗体具有靶向结合乳腺癌细胞表面HER2受体的效能。 展开更多

关键词 抗her2单链抗体可变区片段 绿色荧光蛋白 融合基因表达

在线阅读 下载PDF 职称材料

三肽囊素抗独特型ScFv噬菌体展示文库的构建 被引量：1

10

作者 邬向东 谌南辉 +3 位作者 李麟 何后军 袁汉英 王萍 《中国预防兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2008年第6期482-485,共4页

利用在体外构建的三肽囊素抗独特型抗体可变区VH和VL基因,通过重叠延伸反应(SOE),以(Gly4Ser)3为连接肽,将VH和VL基因连接成为VH-Linker-VLScFv,且ScFvDNA与噬菌粒载体pHEN1的连接产物转化于大肠杆菌TG1,经辅助噬菌体M13K07感染后,获得... 利用在体外构建的三肽囊素抗独特型抗体可变区VH和VL基因,通过重叠延伸反应(SOE),以(Gly4Ser)3为连接肽,将VH和VL基因连接成为VH-Linker-VLScFv,且ScFvDNA与噬菌粒载体pHEN1的连接产物转化于大肠杆菌TG1,经辅助噬菌体M13K07感染后,获得重组的鸡源抗三肽囊素抗独特型抗体全套单链噬菌体抗体库,并将该抗体库展示在噬菌体表面,以利用噬菌体展示技术的强大筛选能力筛选出与三肽囊素同功能单链抗体(Bursin-ScFv)。 展开更多

关键词 三肽囊素 抗独特型抗体 可变区重链和轻链基因 单链抗体 噬菌体抗体库

在线阅读 下载PDF 职称材料

鸡源Bursin-ScFv噬菌体展示文库的构建及初步筛选 被引量：1

11

作者 邬向东 曲悦 +2 位作者 谌南辉 王萍 何后军 《畜牧兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2008年第4期488-493,共6页

本研究利用抗三肽囊素(Bursin)单克隆抗体免疫SPF来航鸡,获得产生抗独特型抗体的脾细胞,从中提取总RNA,经反转录合成cDNA第一链。以cDNA第一链为模板,根据来航鸡IgG抗体重链(VH)、轻链(VL)可变区基因FR设计引物,进行PCR扩增。在体外扩... 本研究利用抗三肽囊素(Bursin)单克隆抗体免疫SPF来航鸡,获得产生抗独特型抗体的脾细胞,从中提取总RNA,经反转录合成cDNA第一链。以cDNA第一链为模板,根据来航鸡IgG抗体重链(VH)、轻链(VL)可变区基因FR设计引物,进行PCR扩增。在体外扩增出该抗体的可变区VH和VL基因(大小分别约为370和320 bp)。通过重叠延伸反应(SOE),以(Gly4Ser)3为连接肽,将VH和VL基因连接成为VH-Linker-VLScFv,将ScFv DNA与噬菌粒载体pHEN1的连接产物转化于大肠杆菌TG1,经辅助噬菌体M13K07感染后,获得重组的鸡源抗三肽囊素独特型抗体全套单链噬菌体抗体库。并测得该库容量约为5×105,噬菌体中ScFv基因的插入率为80%,用辅助噬菌体援救后,得到滴度为1011PFU/mL的初级噬菌体抗体库。用抗Bursin单克隆抗体(2F9-4/HU2)进行4轮"吸附-洗脱-扩增"的淘筛,出现特异性富集。经ELISA、动物试验表明所筛选的5个阳性克隆可与抗Bursin单克隆抗体(2F9-4/HU2)特异性结合,并能促进抗体的生产。 展开更多

关键词 三肽囊素 抗独特型抗体 可变区 重链 轻链 单链抗体 单克隆抗体 噬菌体抗体库

在线阅读 下载PDF 职称材料