志贺菌中成簇的规律间隔短回文重复序列与毒力基因和耐药基因的关系 被引量：3

1

作者 王颖芳 王鹏飞 +3 位作者 詹煜慧 张晓萌 段广才 郗园林 《西安交通大学学报（医学版）》 CAS CSCD 北大核心 2019年第1期71-75,共5页

目的探索志贺菌中成簇的规律间隔短回文重复序列(clustered regularly interspaced short palindromic repeats,CRISPR)与毒力基因和耐药基因的关系。方法从GenBank数据库中获得志贺菌的基因组、毒力基因和耐药基因的序列,通过多序列比... 目的探索志贺菌中成簇的规律间隔短回文重复序列(clustered regularly interspaced short palindromic repeats,CRISPR)与毒力基因和耐药基因的关系。方法从GenBank数据库中获得志贺菌的基因组、毒力基因和耐药基因的序列,通过多序列比对等方法获得志贺菌中CRISPR1、CRISPR2和CRISPR-Q1的分布情况、重复序列和间隔序列信息,通过BLAST方法获得毒力基因和耐药基因在志贺菌中的分布情况,SPSS 21.0软件分析CRISPR与毒力基因和耐药基因的关系。结果志贺菌中的CRISPR1和CRISPR2在不同菌株中的间隔序列差别较大,CRISPRQ1分布更为广泛(超过99%)。毒力基因在志贺菌中分布比较广泛(均超过56%),耐药基因中的blaOXA-1、camr、Sul2、tetB分布也比较广(超过50%)。CRISPR1/CRISPR2与是否携带9种毒力基因、4种耐药基因有关(P<0.05),CRISPR-Q1与是否携带3种毒力基因、4种耐药基因有关(P<0.05)。CRISPR1/CRISPR2和CRISPR-Q1均与志贺菌中存在的毒力基因和耐药基因的个数间有统计学关联(P<0.05)。CRISPR1/CRISPR2与CRISPR-Q1的间隔序列数目之间存在统计学关联(χ2=61.6,P<0.001)。结论志贺菌中不同CRISPR的分布差异比较大,存在的间隔序列数目不等;志贺菌CRISPR与部分毒力基因和耐药基因之间存在负相关;CRISPR1/CRISPR2与CRISPR-Q1的间隔序列数目存在正相关。 展开更多

关键词 志贺菌 成簇的规律间隔短回文重复序列 毒力基因 耐药基因

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基于成簇的规则间隔短回文重复序列的严重急性呼吸综合征冠状病毒2检测的最新进展

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作者 周雯 杨开广 +2 位作者 张丽华 梁振 张玉奎 《色谱》 CAS CSCD 北大核心 2022年第9期773-781,共9页

严重急性呼吸综合征冠状病毒2(SARS-CoV-2)导致的新冠肺炎(COVID-19)迅速蔓延全球,给全球公共卫生系统带来了挑战。由于逆转录-定量聚合酶链反应(RT-qPCR)和抗原测试的普遍适用性和灵敏度较差,并且具有不同突变的SARS-CoV-2变体持续的出... 严重急性呼吸综合征冠状病毒2(SARS-CoV-2)导致的新冠肺炎(COVID-19)迅速蔓延全球,给全球公共卫生系统带来了挑战。由于逆转录-定量聚合酶链反应(RT-qPCR)和抗原测试的普遍适用性和灵敏度较差,并且具有不同突变的SARS-CoV-2变体持续的出现,给疫情防控带来了更大的挑战,因此,高灵敏度、无需设备并且能够区分SARS-CoV-2变体的诊断方法亟须发展。基于成簇的规则间隔短回文重复序列(CRISPR)的诊断对设备要求低,具有可编程性、灵敏性和易用性,已经发展出多种核酸检测工具用于传染病的诊断,其在临床上具有巨大的应用潜力。文章聚焦于近期发表的基于CRISPR实现SARS-CoV-2检测和变体区分的最新技术,总结其特点并对其发展进行了展望。 展开更多

关键词 严重急性呼吸综合征冠状病毒2(SARS-CoV-2) 等温核酸扩增 成簇的规则间隔短回文重复序列(CRISPR) SARS-CoV-2变体

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空肠弯曲菌中规律成簇间隔短回文重复序列(CRISPR)的检测与结构分析 被引量：2

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作者 吴瑜凡 申进玲 +4 位作者 崔思宇 郭旸 吴福平 王翔 邵景东 《食品科学》 EI CAS CSCD 北大核心 2018年第24期139-144,共6页

规律成簇间隔短回文重复序列(clustered regularly interspaced short palindromic repeats,CRISPR)是近年在原核生物中发现的针对噬菌体等外源遗传物质的干扰而进化出的获得性和可遗传性生物免疫系统。因其序列的高度多态性及携带遗传... 规律成簇间隔短回文重复序列(clustered regularly interspaced short palindromic repeats,CRISPR)是近年在原核生物中发现的针对噬菌体等外源遗传物质的干扰而进化出的获得性和可遗传性生物免疫系统。因其序列的高度多态性及携带遗传信息的可追溯性,成为分子分型方法的理想位点。本研究对江苏地区分离的86株空肠弯曲菌基因组进行CRISPR结构的检测和分析。结果表明:36%的菌株基因组含有CRISPR结构,32株含有确定CRISPR结构的菌株均只含有1个CRISPR结构,CRISPR序列长度范围为92～366 bp;重复序列与数据库中出现频率最高的重复序列一致;识别到的间隔序列共111条,共分为17种类型,有10种类型的间隔序列与CRISPR DB数据库中公布的一致,有7种间隔序列为新报道的间隔序列,共55条,占总间隔序列的49.5%。通过同源性比对发现,间隔序列除与来自同属同种的质粒或噬菌体具有同源性外,有些还与其他致病菌的质粒或噬菌体具有同源性,这种现象说明空肠弯曲菌与其他致病菌可能存在基因的水平转移等信息交流方式。另外,通过CRISPR结构间隔序列的多样性,可以将38株空肠弯曲菌野生菌株分为5种不同的谱型。研究结果为空肠弯曲菌利用CRISPR结构进行分型和溯源提供数据基础。 展开更多

关键词 空肠弯曲菌 成簇的规律间隔短回文重复序列(CRISPR) 重复序列 间隔序列 同源性

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食源性致病菌耐药性与成簇的规律间隔短回文重复序列系统关联性研究进展 被引量：1

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作者 金姗姗 王义哲 赵喜红 《食品安全质量检测学报》 CAS 2020年第24期9301-9307,共7页

近年来,随着对抗生素的滥用,食源性致病菌的耐药性问题日趋严重。目前除了从管理上规范抗生素的使用,对规律间隔短回文重复序列系统(clusterd regularly interspaced short palindromic repeats,CRISPR)与耐药性相关研究也在持续进行。C... 近年来,随着对抗生素的滥用,食源性致病菌的耐药性问题日趋严重。目前除了从管理上规范抗生素的使用,对规律间隔短回文重复序列系统(clusterd regularly interspaced short palindromic repeats,CRISPR)与耐药性相关研究也在持续进行。CRISPR-Cas作为一种天然免疫机制,因为其独特的免疫作用机理,目前常被用以基因编辑、耐药性等方面研究。本文对CRISPR-Cas系统进行简要介绍,从其结构、原理以及目前的研究趋势对不同菌株间CRISPR系统与耐药性、毒力因素进行相关总结,为防治食源性致病菌引起的食品安全问题提供新思路。 展开更多

关键词 成簇的规律间隔短回文重复序列系统 耐药性 毒力因素 食源性致病菌 食品安全

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基于重组酶聚合酶扩增-CRISPR/Cas12a的沙门氏菌可视化检测方法的建立

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作者 黄建飞 陈晶 +3 位作者 张倩 肖承荣 吴燕蕙 赖心田 《食品安全质量检测学报》 2025年第8期122-130,共9页

目的建立基于重组酶聚合酶扩增-CRISPR/Cas12a的沙门氏菌可视化检测方法。方法本研究将重组酶聚合酶扩增(recombinase polymerase amplification,RPA)技术与成簇规律间隔短回文重复序列及其相关蛋白12a(clustered regularly interspaced... 目的建立基于重组酶聚合酶扩增-CRISPR/Cas12a的沙门氏菌可视化检测方法。方法本研究将重组酶聚合酶扩增(recombinase polymerase amplification,RPA)技术与成簇规律间隔短回文重复序列及其相关蛋白12a(clustered regularly interspaced short palindromic repeats/associated protein 12a,CRISPR/Cas12a)系统相结合,以沙门氏菌invA作为目标基因,设计并合成RPA引物和CRISPR引导RNA(CRISPR-derived RNA,crRNA),通过荧光法和试纸条两种方法读取结果。对优化的RPA-CRISPR/Cas12检测体系进行特异性和灵敏度实验,并应用于食品样本检测。结果本研究成功研制纳米金核酸试纸条,建立的RPA-CRISPR/Cas12a体系可在1.5 h内特异性完成沙门氏菌的检测,灵敏度为80 CFU/mL。利用此方法对21个食品样本进行检测,荧光法、试纸条法与国家标准法检测结果完全一致,沙门氏菌检出率为4.8%。结论本研究建立的沙门氏菌RPA-CRISPR/Cas12a可视化检测方法具有高特异性和灵敏度,在沙门氏菌的现场快速检测方面具有应用价值。 展开更多

关键词 沙门氏菌 成簇规律间隔短回文重复序列及其相关蛋白12a 试纸条 重组酶聚合酶扩增 可视化检测

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基于CRISPR-Cas系统的病原体核酸检测方法的研究进展

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作者 臧佳 董泽丰 +2 位作者 雅雪蓉 孙万平 沈强 《临床检验杂志》 2025年第3期197-203,共7页

病原体的快速、准确诊断对感染性疾病的有效控制和治疗至关重要,基于核酸的检测方法因具有高灵敏度、高特异性被广泛应用于实验室检测和临床诊断。目前,定量聚合酶链式反应(qPCR)已成为核酸诊断的金标准,然而,该方法对仪器设备和操作者... 病原体的快速、准确诊断对感染性疾病的有效控制和治疗至关重要,基于核酸的检测方法因具有高灵敏度、高特异性被广泛应用于实验室检测和临床诊断。目前,定量聚合酶链式反应(qPCR)已成为核酸诊断的金标准,然而,该方法对仪器设备和操作者技能要求较高并且容易发生气溶胶污染,不适用于病原体的即时检测。成簇规律间隔短回文重复序列(CRISPR)及CRISPR相关蛋白(Cas)系统(简称为CRISPR-Cas)克服了其他核酸检测方法的局限性,为病原体核酸的即时检测提供了新工具。该文从CRISPR-Cas系统的组成及作用机制、基于不同类别Cas蛋白的检测方法以及检测方法的发展趋势3个方面对基于CRISPR-Cas系统的病原体核酸检测方法进行总结,旨在为进一步提升上述方法的可操作性以及开发更多新的检测方法提供思路。 展开更多

关键词 感染性疾病 核酸检测 成簇规律间隔短回文重复序列及CRISPR相关蛋白系统 检测方法

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沙门氏菌CRISPR序列的结构功能与应用研究进展 被引量：2

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作者 沈学怀 张丹俊 +3 位作者 潘孝成 赵瑞宏 戴银 胡晓苗 《现代农业科技》 2017年第20期236-237,245,共3页

规律成簇的间隔短回文重复序列(CRISPR)是一类存在于古细菌和细菌基因组内的特殊结构,研究发现沙门菌中存在2个CRISPR位点,该结构不仅参与沙门氏菌对质粒和噬菌体等外源DNA的获得性免疫,同时其序列结构的高度可变性,可作目标基因用以沙... 规律成簇的间隔短回文重复序列(CRISPR)是一类存在于古细菌和细菌基因组内的特殊结构,研究发现沙门菌中存在2个CRISPR位点,该结构不仅参与沙门氏菌对质粒和噬菌体等外源DNA的获得性免疫,同时其序列结构的高度可变性,可作目标基因用以沙门氏菌的基因分型和进化研究。本文综述了沙门氏菌基因组中CRISPR位点的基本结构、作用机制和功能及其在沙门氏菌基因分型和进化研究中的应用进展。 展开更多

关键词 沙门氏菌 规律成簇的间隔的短回文重复序列 功能 分型 进化

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基于CRISPR检测系统的PER信号放大方法探究

8

作者 王晓军 张怡青 +4 位作者 谭娅 王继创 程蕾 王旭东 王云龙 《河南医学研究》 2025年第5期773-778,共6页

目的采用成簇规律间隔短回文重复序列相关蛋白Cas13a(CRISPR-Cas13a)联合级联引物交换反应(PER),建立一种基于CRISPR-Cas13a系统的检测信号放大并直接检测新型冠状病毒的方法,即CRISPR/PER。方法筛选新型冠状病毒模板链及针对模板链设计... 目的采用成簇规律间隔短回文重复序列相关蛋白Cas13a(CRISPR-Cas13a)联合级联引物交换反应(PER),建立一种基于CRISPR-Cas13a系统的检测信号放大并直接检测新型冠状病毒的方法,即CRISPR/PER。方法筛选新型冠状病毒模板链及针对模板链设计2条特异性CRISPR相关RNA(crRNA),利用Cas13a蛋白的切割活性,对CRISPR反应体系进行条件优化;对PER的配对发卡结构及引物进行筛选,利用筛选后的配对进行PER体系优化并设计特异性探针P2探针和P3探针,利用碱基互补配对使信号探针P3与扩增的发卡结构H27结合,形成反应液,制备胶体金试纸条,并评价CRISPR/PER方法的灵敏度与特异度。结果RNA的最佳配对crRNA为crRNA-1;500 nmol·L^(-1)Cas13a蛋白加入1μL、4 g·L^(-1)的crRNA加入0.5μL、5 U Ribonuclease Inhibitor加入1μL为CRISPR反应体系的最适加入量;H27发卡结构与P27引物的配对效果最好;最适条件为37℃,反应40 min;各组最适加入量分别为4 U Bst DNA聚合酶加入1μL、5μmol·L^(-1)H27发卡结构加入10μL、100 mmol·L^(-1)MgSO_(4)加入1μL、dNTP加入2μL时扩增效率最好。CRISPR/PER方法可在1.5 h左右完成检测,检测新型冠状病毒模板链的最低检测限为100μg·L^(-1);特异性实验表明与3种对照病毒均无交叉反应。结论CRISPR/PER检测方法在新型冠状病毒检测上具有方便快捷,特异性强等优点,可作为核酸检测新方法探究的参考。 展开更多

关键词 成簇规律间隔短回文重复序列 引物交换反应 核酸检测 新型冠状病毒 扩增

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利用CRISPRi技术构建乙醛酸生物合成Corynebacterium glutamicum工程菌 被引量：1

9

作者 梁咏思 沈凯佳 +2 位作者 范许云 韩武洋 李天明 《食品科学》 EI CAS CSCD 北大核心 2021年第2期170-176,共7页

以谷氨酸棒状杆菌(Corynebacterium glutamicum ATCC 13032)为出发菌株,敲除其支流代谢关键酶乳酸脱氢酶合成基因lldh,建立规律间隔成簇短回文重复序列干扰(clustered regularly interspaced short palindromic repeats interference,CR... 以谷氨酸棒状杆菌(Corynebacterium glutamicum ATCC 13032)为出发菌株,敲除其支流代谢关键酶乳酸脱氢酶合成基因lldh,建立规律间隔成簇短回文重复序列干扰(clustered regularly interspaced short palindromic repeats interference,CRISPRi)调控体系,并利用该体系下调支流代谢中的关键酶异柠檬酸脱氢酶合成基因icd和苹果酸合成酶合成基因ms的表达强度,同时过表达异柠檬酸裂合酶合成基因icl,强化乙醛酸合成的通路。通过48 h连续监测工程菌和野生菌生长状况,并检测发酵终产物。结果显示:工程菌生长几乎不受影响,发酵液中乙醛酸质量浓度达到5 mg/mL,实现了乙醛酸的积累,为谷氨酸棒状杆菌工业生产乙醛研究提供一定的参考。 展开更多

关键词 谷氨酸棒状杆菌 乙醛酸 规律间隔成簇短回文重复序列干扰 工程菌

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代谢工程优化大肠杆菌高效合成L-苯丙氨酸 被引量：5

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作者 门佳轩 熊博 +3 位作者 郝亚男 李旋 刘益宁 谢希贤 《食品科学》 EI CAS CSCD 北大核心 2021年第2期114-120,共7页

为获得1株稳定高产的L-苯丙氨酸工程菌株,利用规律间隔成簇短回文重复序列/Cas9技术,在大肠杆菌W3110中引入已解除反馈抑制的分支酸变位酶/预苯酸脱水酶PheA,随后利用不同强度的启动子对莽草酸途径中各反应酶进行调控,并通过摇瓶发酵确... 为获得1株稳定高产的L-苯丙氨酸工程菌株,利用规律间隔成簇短回文重复序列/Cas9技术,在大肠杆菌W3110中引入已解除反馈抑制的分支酸变位酶/预苯酸脱水酶PheA,随后利用不同强度的启动子对莽草酸途径中各反应酶进行调控,并通过摇瓶发酵确定了莽草酸途径各步反应酶的最适表达强度,最后通过增加前体物磷酸烯醇式丙酮酸供应,获得了1株性能最佳的L-苯丙氨酸工程菌株PHE12。利用该菌株进行摇瓶发酵24 h,L-苯丙氨酸产量达20.5 g/L。利用发酵罐分批补料发酵48 h后,L-苯丙氨酸产量达81.8 g/L,与目前文献报道的最高产量相比产量提高了12.2%,生产强度和糖酸转化率(葡萄糖计)分别为1.7 g/(L·h)和0.24 g/g,工业前景良好。 展开更多

关键词 L-苯丙氨酸 大肠杆菌 规律间隔成簇短回文重复序列/Cas9 发酵生产

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应用于食品检测领域的分子即时检测技术研究进展 被引量：4

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作者 王薇 付群 +4 位作者 郑艳敏 王波 刘岩 刘佳 孙万平 《食品安全质量检测学报》 CAS 2024年第1期48-56,共9页

食品安全问题关系人类民生。为有效预防和控制食品安全风险,减少食品安全经济损失,迫切需要开发出针对食源性病原体、食物掺假、转基因作物的高特异性、高敏感性、快速的核酸检测技术。即时检测(point-of-care testing,POCT)作为一种新... 食品安全问题关系人类民生。为有效预防和控制食品安全风险,减少食品安全经济损失,迫切需要开发出针对食源性病原体、食物掺假、转基因作物的高特异性、高敏感性、快速的核酸检测技术。即时检测(point-of-care testing,POCT)作为一种新兴的快速检测手段,由于其检测速度快、操作简单、现场检查等特点,在食品检测领域应用广泛。本文首先介绍了POCT技术的发展历史,而后根据食品安全事件的特点,从食源性致病菌、食物掺假、转基因作物3个方向分析了食品检测的主要对象,阐述了分子POCT技术在食品检测领域的应用现状,最后对应用于食品检测领域的分子POCT技术存在的问题和解决办法进行了分析总结,对食品检测分子POCT技术的发展方向进行了展望。本文有助于进一步了解分子POCT技术在食品检测中的应用,并为分子POCT技术在食品快速检测中的研究和应用提供参考。 展开更多

关键词 食品检测 分子即时检测 食品安全 等温扩增技术 成簇规律间隔短回文重复序列及其相关系统检测技术

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重组酶介导的等温扩增结合CRISPR/Cas12a检测志贺氏菌和克罗诺杆菌

12

作者 张欣悦 杨钰娟 +4 位作者 孔祥翔 杨捷琳 钮冰 陈沁 刘志勇 《食品安全质量检测学报》 CAS 2024年第11期35-44,共10页

目的应用重组酶介导的等温扩增技术(recombinase-aided amplification,RAA)结合成簇规则的间隔短回文重复序列(clustered regularly interspaced short palindromic repeats,CRISPR),建立志贺氏菌和克罗诺杆菌的快速检测方法。方法通过... 目的应用重组酶介导的等温扩增技术(recombinase-aided amplification,RAA)结合成簇规则的间隔短回文重复序列(clustered regularly interspaced short palindromic repeats,CRISPR),建立志贺氏菌和克罗诺杆菌的快速检测方法。方法通过筛选志贺氏菌和克罗诺杆菌特异性基因,设计特异扩增引物、CRISPR脱氧核糖核酸(CRISPR deoxyribonucleic acid,crDNA)和探针,将靶标进行RAA扩增后,建立CRISPR检测方法。对方法的灵敏度、特异性和应用性进行评价,并与国标检测方法进行对比。结果本研究对志贺氏菌和克罗诺杆菌纯菌液DNA最低检出限分别为4.9×10^(3) CFU/mL、4.4×10^(4) CFU/mL,基因组DNA最低检出限为6.8×10^(‒3) ng/μL、5.7×10^(‒3 )ng/μL,特异性好,与其他病原菌无交叉反应。同时,该方法成功检测出加标猪肉样品和人工污染奶粉中的志贺氏菌和克罗诺杆菌,比国家标准检出限更低。结论本研究建立的RAA-CRISPR方法可有效应用于志贺氏菌和克罗诺杆菌的检测,这为快速筛查食品中是否污染这两种病原菌提供重要价值。 展开更多

关键词 志贺氏菌 克罗诺杆菌 重组酶介导的等温扩增 成簇规则的间隔短回文重复序列

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基于重组酶介导等温扩增-CRISPR/Cas12a的青鱼物种快速鉴定研究 被引量：1

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作者 于耀鲜 邢冉冉 +5 位作者 邓婷婷 王琳 卢思远 王宏勋 王丽梅 陈颖 《食品安全质量检测学报》 CAS 2024年第4期40-48,共9页

目的 建立一种快速、特异、灵敏地鉴定青鱼物种的方法。方法 以青鱼线粒体16SrRNA基因的保守序列设计特异性crRNA,并根据crRNA设计重组酶介导等温扩增(recombinase-mediatedisothermal amplification,RAA)引物;建立青鱼的RAA-CRISPR/Cas... 目的 建立一种快速、特异、灵敏地鉴定青鱼物种的方法。方法 以青鱼线粒体16SrRNA基因的保守序列设计特异性crRNA,并根据crRNA设计重组酶介导等温扩增(recombinase-mediatedisothermal amplification,RAA)引物;建立青鱼的RAA-CRISPR/Cas12a快速鉴定方法,并对该方法的检测时间进行优化;同时,评估该方法的特异性和灵敏度,并对青鱼及其近缘物种的市售样品进行检测。结果 该方法仅需25 min完成检测;对青鱼物种的鉴定表现出显著的特异性,并对其近缘物种如草鱼、赤眼鳟、鳡鱼、倒刺鲃的检测结果均呈阴性;方法灵敏度为1.0×10-3ng/μL(以基因组DNA计);与DNA条形码技术相比,该方法在市售样品的检测结果上表现一致。结论 建立了青鱼物种的RAA-CRISPR/Cas12a现场快速检测方法,该方法具备快速、特异、灵敏的特点,为水产市场或野外环境中快速检测青鱼物种提供了技术手段。 展开更多

关键词 青鱼 重组酶介导等温扩增 簇状规则间隔短链重复序列 物种鉴定

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CRISPR-Cas系统在食源性致病菌检测中的研究进展 被引量：1

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作者 郭浩宇 王瑞曦 +5 位作者 秦琳琳 王邵天 于淏芃 赵枳熒 尹丹阳 马龙 《食品安全质量检测学报》 CAS 2024年第8期154-163,共10页

食源性致病菌的快速检测对预防食源性疾病的爆发具有重要意义。成簇规律间隔短回文重复序列(clustered regularly interspaced short palindromicrepeats,CRISPR)及CRISPR相关蛋白(CRISPR-associated protein,Cas)构成的CRISPR-Cas系统... 食源性致病菌的快速检测对预防食源性疾病的爆发具有重要意义。成簇规律间隔短回文重复序列(clustered regularly interspaced short palindromicrepeats,CRISPR)及CRISPR相关蛋白(CRISPR-associated protein,Cas)构成的CRISPR-Cas系统已被广泛的应用于核酸检测,并在对食源性致病菌的检测中展现出快速、灵敏度高、特异性强等优势。本文介绍了CRISPR-Cas系统的原理、机制,总结了CRISPR-Cas系统与不同扩增方法和信号输出模式相结合在食源性致病菌检测中的应用,并讨论了这些检测方法存在的一些问题和挑战,最后对该技术的未来发展前景进行展望,旨在为食源性致病菌的快速检测提供新思路。 展开更多

关键词 成簇规律间隔短回文重复序列相关蛋白 食源性致病菌 核酸检测

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鱼类产品中嗜水气单胞菌重组酶聚合酶扩增结合CRISPR/Cas12a快速检测及耐药性分析

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作者 高子惠 曲心平 +7 位作者 凌莉 于海洋 张蕾 胡蝶 吴笛 何雨霏 郑秋月 曹际娟 《食品安全质量检测学报》 CAS 2024年第11期90-97,共8页

目的建立重组酶聚合酶扩增(recombinase polymerase amplification,RPA)结合簇状规则间隔短链重复序列及其相关蛋白(clustered regularly interspaced short palindromic repeats-associated protein,CRISPR-Cas)新方法,检测鱼类产品中... 目的建立重组酶聚合酶扩增(recombinase polymerase amplification,RPA)结合簇状规则间隔短链重复序列及其相关蛋白(clustered regularly interspaced short palindromic repeats-associated protein,CRISPR-Cas)新方法,检测鱼类产品中嗜水气单胞菌,并分析其耐药性。方法采用基于最新的CRISPR基因编辑技术建立RPA结合CRISPR/Cas12a新方法,快速检测嗜水气单胞菌,同时采用环介导等温扩增(loop-mediated isothermal amplification,LAMP)方法比对两种方法的检出率。筛查嗜水气单胞菌分离株的耐药性,采用纸片扩散法测定耐药表型,采用荧光染料(SYBR green,SYBG)实时荧光定量聚合酶链式反应(real-time fluorescence quantitative polymerase chain reaction,qPCR)测定耐药基因,分析耐药表型与耐药基因结果的一致性。结果在74例鱼类样品中,基于RPA-CRISPR/Cas12a和LAMP同时检测出6例嗜水气单胞菌。分析耐药性测试结果发现,分离株对5大类10种抗生素的耐药情况差异较大,耐药表型与耐药基因结果一致性较高。结论所建立的RPA-CRISPR/Cas12a方法适用于嗜水气单胞菌快速检测。而细菌耐药性的产生机制比较复杂,耐药表型的产生在一定程度上受耐药基因调控。研究结果为水产品中嗜水气单胞菌快速检测和耐药性筛查提供新思路和方法。 展开更多

关键词 嗜水气单胞菌 重组酶聚合酶扩增 簇状规则间隔短链重复序列及其相关蛋白 环介导等温扩增 实时荧光定量聚合酶链式反应 耐药表型 耐药基因

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基于CRISPR对大肠埃希菌O157∶H7的检测 被引量：5

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作者 梁文娟 张荣光 +6 位作者 段广才 王颖芳 洪丽娟 张冰 王鹏飞 郗园林 杨海燕 《西安交通大学学报（医学版）》 CAS CSCD 北大核心 2016年第5期748-753,共6页

目的基于成簇的规律间隔短回文重复序列（CRISPR）,建立对大肠埃希菌O157∶H7的新型检测方法。方法应用PCR扩增实验室保存的443株肠道细菌（310株非O157∶H7大肠埃希菌、35株大肠埃希菌O157∶H7、89株志贺菌和9株沙门菌）的CRISPR1和CRI... 目的基于成簇的规律间隔短回文重复序列（CRISPR）,建立对大肠埃希菌O157∶H7的新型检测方法。方法应用PCR扩增实验室保存的443株肠道细菌（310株非O157∶H7大肠埃希菌、35株大肠埃希菌O157∶H7、89株志贺菌和9株沙门菌）的CRISPR1和CRISPR2,并将PCR产物测序;提取CRISPR database数据库中（标准法）100株肠道细菌（47株非O157∶H7大肠埃希菌、5株大肠埃希菌O157∶H7、9株志贺菌和39株沙门菌）的CRISPR1和CRISPR2序列。使用CRISPR Finder在线软件分析PCR产物测序序列和CRISPR database数据库的CRISPR序列。Clustal X软件进行间隔序列比对。比较标准法和PCR扩增CRISPR两种方法检测大肠埃希菌O157∶H7的一致性。结果共分析543株肠道细菌,其中75.6%的非O157∶H7大肠埃希菌、75.5%志贺菌、91.7%沙门菌和95%O157∶H7大肠埃希菌含有CRISPR1,其间隔序列数目为3～26、2～9、2～32、3。57.1%的非O157∶H7大肠埃希菌、77.6%志贺菌、85.4%沙门菌和100%O157∶H7大肠埃希菌含有CRISPR2,其间隔序列数目为1～20、1～6、2～27、1或4个。95%的O157∶H7大肠埃希菌的CRISPR1和90%CRISPR2分别含有3条独特间隔序列（S1-1,S1-2,S1-3）和1条独特间隔序列（S2-1）。间隔序列比对结果显示,S1-1＋S1-2＋S1-3和S2-1检测O157∶H7大肠埃希菌的特异性分别是100%和99.6%。标准法检测和PCR扩增CRISPR1和CRISPR2检测大肠埃希菌O157∶H7的一致性分别达99.6%和99.3%。基于CRISPR检测大肠埃希菌O157∶H7在模拟样品中的应用,结果显示在原样品大肠埃希菌O157∶H7浓度约2.3CFU/mL时,经12h增菌后即能检测出来。大肠埃希菌O157∶H7聚类分析显示,40株O157∶H7大肠埃希菌可分为3类。结论基于CRISPR的大肠埃希菌O157∶H7的检测方法,可以作为监测大肠埃希菌O157∶H7感染和高毒株大肠埃希菌O157∶H7有价值的流行病学工具。 展开更多

关键词 大肠埃希菌O157∶H7 成簇的规律间隔短回文重复序列(CRISPR) 聚合酶链反应 检测

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常见食源性致病菌CRISPR系统结构与功能研究进展 被引量：2

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作者 刘伟奇 王旭 +2 位作者 刘海泉 潘迎捷 赵勇 《食品科学》 EI CAS CSCD 北大核心 2017年第1期276-281,共6页

近年发现细菌和古细菌中广泛存在规律成簇间隔的短回文重复序列(clustered regularly interspaced short palindromic repeats,CRISPR)系统,该系统能够有效地防御噬菌体等外源基因元件的入侵,限制基因的水平转移。而在食源性致病菌中CRI... 近年发现细菌和古细菌中广泛存在规律成簇间隔的短回文重复序列(clustered regularly interspaced short palindromic repeats,CRISPR)系统,该系统能够有效地防御噬菌体等外源基因元件的入侵,限制基因的水平转移。而在食源性致病菌中CRISPR系统除了免疫防御功能以外,还可能具有调节细菌毒力等的其他功能。并且食源性致病菌的CRISPR系统呈现出的多样性在不同菌株之间存在差异,这种差异为食源性致病菌的遗传进化、分子分型提供了更为可靠的依据。因此,近年来针对食源性致病菌中CRISPR系统结构与功能的研究逐渐成为热点。为了进一步探究CRISPR系统在食源性致病菌中的作用机制与应用前景,本文综述了几种常见的食源性致病菌CRISPR系统的基本结构及相关功能的研究进展。 展开更多

关键词 食源性致病菌 规律成簇间隔的短回文重复序列 结构 功能

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基于RPA-CRISPR-Cas12a和聚噻吩显色技术快速检测转基因植物外源基因CP4-EPSPS 被引量：5

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作者 刘华 曾海娟 +3 位作者 唐雪明 徐丹红 雒嘉伟 王金斌 《食品安全质量检测学报》 CAS 北大核心 2022年第23期7758-7764,共7页

目的开发基于重组酶恒温扩增(recombinase polymerase amplification,RPA)结合簇状规则间隔短链重复序列及相关蛋白(clustered regularly interspaced short palindromic repeats-associated 12a protein,CRISPR-Cas12a)和聚噻吩显色技... 目的开发基于重组酶恒温扩增(recombinase polymerase amplification,RPA)结合簇状规则间隔短链重复序列及相关蛋白(clustered regularly interspaced short palindromic repeats-associated 12a protein,CRISPR-Cas12a)和聚噻吩显色技术快速检测转基因植物外源基因CP4-EPSPS的方法。方法利用Cas12a附属切割机制进行精准识别RPA产物中的靶标,结合阳离子水溶性共轭聚噻吩(cationic water-soluble conjugated polythiophene,PMNT)与体系中单链DNA(single stranded DNA,ssDNA)的颜色变化检测转基因产品中耐除草剂草甘膦CP4-EPSPS抗性基因。结果167 bp的RPA引物进行扩增时,扩增体系为20μL时条带最清晰;ssDNA的碱基数为15,Cas12a酶的浓度为0.28 U为最优组合。进行RPA-CRISPR-Cas12a反应后,加入PMNT溶液,裸眼观察是溶液从红色变为黄色,紫外下照射下则颜色为橘红色变为橙黄色,检出限为45拷贝。结论构建了一种基于PMNT颜色变化进行转基因产品的CRISPR-Cas12a的检测方法,30 min内完成整个检测过程,仅需要恒温加热可实现快速灵敏、可视化的检测。 展开更多

关键词 重组酶恒温扩增 簇状规则间隔短链重复序列 阳离子水溶性共轭聚噻吩 现场速测 转基因产品

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基于RT-RAPID和CRISPR-Cas12a的诺如病毒GⅡ.6亚型核酸检测方法的建立

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作者 冉红志 樊成 +4 位作者 王雪飞 刘静 康婕 钱卫东 王婷 《动物医学进展》 北大核心 2023年第9期44-50,共7页

为建立一种特异性强、灵敏度高且简单方便的诺如病毒GⅡ.6核酸快速检测方法,下载诺如病毒GⅡ.6基因组序列,用Mega7.0对基因组进行比对分析获得高度保守序列;基于保守序列设计诺如病毒GⅡ.6的反转录重组酶和聚合酶等温检测(RT-RAPID)技... 为建立一种特异性强、灵敏度高且简单方便的诺如病毒GⅡ.6核酸快速检测方法,下载诺如病毒GⅡ.6基因组序列,用Mega7.0对基因组进行比对分析获得高度保守序列;基于保守序列设计诺如病毒GⅡ.6的反转录重组酶和聚合酶等温检测(RT-RAPID)技术扩增引物、荧光探针、crRNA和报告分子;优化RT-RAPID的反应引物、反应温度和反应时间及Cas12a检测用的crRNA,并分析RT-RAPID-Cas12a方法的特异性和灵敏度。基于RT-RAPID荧光法和RT-RAPID-Cas12a荧光法的诺如病毒GⅡ.6亚型核酸快速检测方法能在1 h内完成检测并得出结果,灵敏度分别为10 copies/μL和0.5 copies/μL,且两个方法均与诺如病毒GⅡ.17型、鼻病毒、偏肺病毒和博卡病毒无交叉反应。2个检测方法与RT-qPCR阳性样本一致率均为90%,阴性样本一致率均为100%。论文建立的基于RT-RAPID和Cas12a的诺如病毒GⅡ.6核酸快速检测方法均可高效快速地检测出诺如病毒GⅡ.6,具有灵敏度高、特异性强、操作便捷且快速等特点。 展开更多

关键词 诺如病毒GⅡ.6亚型 反转录重组酶聚合酶扩增 规律间隔成簇短回文重复序列的/相关蛋白12a 核酸检测

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沙门菌CRISPR的结构与功能研究进展 被引量：5

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作者 蔡银强 李求春 +3 位作者 陶静 蒋道军 潘志明 焦新安 《动物医学进展》 北大核心 2015年第2期97-100,共4页

近年发现沙门菌中恒定地存在两个CRISPR位点,沙门菌利用它们不仅能抵御外源质粒和噬菌体的入侵,还能介导自身短期的表型变化及长期亚类的进化。同时由于其结构的多样性,使之广泛应用于沙门菌分型和进化的研究。论文简要综述了沙门菌CRI... 近年发现沙门菌中恒定地存在两个CRISPR位点,沙门菌利用它们不仅能抵御外源质粒和噬菌体的入侵,还能介导自身短期的表型变化及长期亚类的进化。同时由于其结构的多样性,使之广泛应用于沙门菌分型和进化的研究。论文简要综述了沙门菌CRISPR系统的基本结构、作用机制和功能及其在沙门菌分型和进化应用方面的研究进展。 展开更多

关键词 沙门菌 规律成簇间隔的短回文重复序列 功能 分型

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