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人SNCG基因shRNA慢病毒载体质粒的构建及鉴定
被引量：
3
1
作者
李文怡
范余娟
+2 位作者
徐红
范江涛
孙丹
《山东医药》
CAS
北大核心
2016年第26期13-16,共4页
目的构建人SNCG基因短发夹干扰RNA(shRNA)慢病毒载体质粒,并观察用其转染后人子宫内膜癌HEC-1-A和Ishikawa细胞SNCG mRNA和蛋白的表达变化。方法设计3种SNCG基因特异性shRNA序列SNCGKD1、SNCG-KD2、SNCG-KD3,用脂质体Lipofectamine 2000...
目的构建人SNCG基因短发夹干扰RNA(shRNA)慢病毒载体质粒,并观察用其转染后人子宫内膜癌HEC-1-A和Ishikawa细胞SNCG mRNA和蛋白的表达变化。方法设计3种SNCG基因特异性shRNA序列SNCGKD1、SNCG-KD2、SNCG-KD3,用脂质体Lipofectamine 2000在293T细胞构建成慢病毒载体质粒。用SNCG-KD1、SNCG-KD2、SNCG-KD3慢病毒载体质粒转染人子宫内膜癌HEC-1-A和Ishikawa细胞,用实时荧光定量PCR法检测SNCG mRNA,用Western blot法检测SNCG蛋白。结果利用AgeⅠ和EcoRⅠ双酶切连接转化后的3组阳性转化子,1%琼脂糖凝胶电泳,特异条带与预计结果相符。Chromas Lite比对分析基因测序结果,鉴定结果与Gen Bank数据库一致,表明合成的3对SNCG shRNA序列SNCG-KD1、SNCG-KD2、SNCG-KD3插入正确。HEC-1-A和Ishikawa细胞转染SNCG-KD1、SNCG-KD2、SNCG-KD3慢病毒载体质粒后SNCG mRNA和蛋白的表达均显著降低(P均<0.05)。结论成功构建了3种SNCG shRNA慢病毒载体质粒,用其转染HEC-1-A和Ishikawa细胞后可有效沉默SNCG基因表达。
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关键词
SNCG基因
短发夹干扰RNA
慢病毒载体质粒
子宫内膜癌
基因沉默
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职称材料
稳定干扰Drp1基因的慢病毒载体质粒及神经母细胞瘤细胞株构建
被引量：
1
2
作者
周梦琪
柴原
+3 位作者
冯琬迪
马浩洁
盖聪
孙红梅
《山东医药》
CAS
2019年第24期1-4,共4页
目的构建稳定干扰Drp1基因的慢病毒载体质粒及神经母细胞瘤细胞株,为进一步探讨Drp1基因在帕金森病(PD)发病过程中的作用提供细胞模型。方法于GenBank中检索人Drp1基因的核苷酸序列,设计并筛选最佳动力学参数的干扰序列及阴性对照序列;...
目的构建稳定干扰Drp1基因的慢病毒载体质粒及神经母细胞瘤细胞株,为进一步探讨Drp1基因在帕金森病(PD)发病过程中的作用提供细胞模型。方法于GenBank中检索人Drp1基因的核苷酸序列,设计并筛选最佳动力学参数的干扰序列及阴性对照序列;根据靶序列分别设计并合成干扰RNA(siRNA)的单链DNA寡核苷酸(DNAoligo),与退火缓冲液反应后形成带黏性末端的双链DNAoligo片段。分别用AgeⅠ与EcoRⅠ双酶切双链DNAoligo片段和GV248慢病毒骨架质粒后,加入T4DNA连接酶连接,得到重组慢病毒载体质粒Drp1-RNAi和阴性对照质粒。将重组慢病毒载体质粒Drp1-RNAi加入到大肠杆菌TOP10感受态细胞中反应后,分别提取质粒DNA并进行DNA测序。将重组慢病毒载体质粒Drp1-RNAi和阴性对照质粒转染至293T细胞中,培养48h后收集上清液,离心后过滤得到Drp1-RNAi重组慢病毒和阴性对照慢病毒。将人神经母细胞瘤细胞株SH-SY5Y分为Drp1-RNAi重组慢病毒组(D组,用Drp1-RNAi重组慢病毒感染)、阴性对照组(N组,用阴性对照慢病毒感染)、正常对照组(C组,正常培养),采用实时荧光定量PCR法检测各组细胞Drp1mRNA,采用Westernblotting法检测各组细胞Drp1蛋白。结果重组慢病毒载体质粒Drp1-RNAi的DNA序列与设计的干扰序列完全一致。D组Drp1mRNA和蛋白的相对表达量为0.47±0.12和0.40±0.04,N组Drp1mRNA和蛋白的相对表达量为1.12±0.33和0.67±0.05,C组Drp1mRNA和蛋白的相对表达量为1.02±0.23和0.72±0.02;D组Drp1mRNA和蛋白的相对表达量与N组、C组相比,P均<0.05;N组Drp1mRNA和蛋白的相对表达量与C组相比,P均>0.05。结论成功构建了稳定干扰Drp1基因的慢病毒载体质粒,并建立、筛选出了稳定干扰Drp1基因的神经母细胞瘤细胞株,进一步探讨Drp1基因在PD发病过程中的作用提供细胞模型。
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关键词
Drp1基因
RNA干扰
慢病毒载体质粒
神经母细胞瘤细胞株
帕金森病
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职称材料
神经束蛋白155高表达少突胶质细胞模型的构建
被引量：
1
3
作者
胡斌
王成举
+1 位作者
陈鹏慧
张雨平
《山东医药》
CAS
2019年第18期28-31,共4页
目的构建神经束蛋白155(neurofascin155,NF155)高表达的少突胶质细胞模型。方法 RT-PCR法提取NF155 cDNA,经T-A克隆及双酶切将其与pUM-T simple重组,构建NF155慢病毒载体质粒,NheⅠ、AgeⅠ双酶切后,片段大小及基因测序均显示NF155慢病...
目的构建神经束蛋白155(neurofascin155,NF155)高表达的少突胶质细胞模型。方法 RT-PCR法提取NF155 cDNA,经T-A克隆及双酶切将其与pUM-T simple重组,构建NF155慢病毒载体质粒,NheⅠ、AgeⅠ双酶切后,片段大小及基因测序均显示NF155慢病毒载体质粒构建成功。取对数生长期少突胶质细胞分为空白对照组、阴性慢病毒感染组、NF155慢病毒感染组,空白对照组不做任何处理,阴性慢病毒感染组予10 μL空载体慢病毒+100 μL培养基,NF155慢病毒感染组予10 μL慢病毒载体质粒+100 μL培养基。培养12 h采用荧光定量PCR法检测NF155 mRNA,采用Western blotting法检测NF155蛋白。结果 NF155慢病毒感染组、空白对照组、阴性慢病毒感染组NF155 mRNA相对表达量分别为3.25±0.11、1.00±0.06、1.08±0.01,与空白对照组、阴性慢病毒感染组比较,NF155慢病毒感染组NF155 mRNA相对表达量升高( P 均<0.05)。NF155慢病毒感染组、空白对照组、阴性慢病毒感染组NF155 蛋白相对表达量分别为1.57±0.08、0.51±0.12、0.50±0.06,与空白对照组、阴性慢病毒感染组比较,NF155慢病毒感染组NF155蛋白相对表达量升高( P 均<0.05)。结论 成功构建NF155高表达的少突胶质细胞瞬转细胞模型。
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关键词
神经束蛋白155
慢病毒载体质粒
神经束蛋白155
慢病毒载体质粒
少突胶质细胞
脑白质损伤
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职称材料
题名
人SNCG基因shRNA慢病毒载体质粒的构建及鉴定
被引量：
3
1
作者
李文怡
范余娟
徐红
范江涛
孙丹
机构
广西医科大学第一附属医院
出处
《山东医药》
CAS
北大核心
2016年第26期13-16,共4页
基金
国家自然科学基金资助项目(81460396)
文摘
目的构建人SNCG基因短发夹干扰RNA(shRNA)慢病毒载体质粒,并观察用其转染后人子宫内膜癌HEC-1-A和Ishikawa细胞SNCG mRNA和蛋白的表达变化。方法设计3种SNCG基因特异性shRNA序列SNCGKD1、SNCG-KD2、SNCG-KD3,用脂质体Lipofectamine 2000在293T细胞构建成慢病毒载体质粒。用SNCG-KD1、SNCG-KD2、SNCG-KD3慢病毒载体质粒转染人子宫内膜癌HEC-1-A和Ishikawa细胞,用实时荧光定量PCR法检测SNCG mRNA,用Western blot法检测SNCG蛋白。结果利用AgeⅠ和EcoRⅠ双酶切连接转化后的3组阳性转化子,1%琼脂糖凝胶电泳,特异条带与预计结果相符。Chromas Lite比对分析基因测序结果,鉴定结果与Gen Bank数据库一致,表明合成的3对SNCG shRNA序列SNCG-KD1、SNCG-KD2、SNCG-KD3插入正确。HEC-1-A和Ishikawa细胞转染SNCG-KD1、SNCG-KD2、SNCG-KD3慢病毒载体质粒后SNCG mRNA和蛋白的表达均显著降低(P均<0.05)。结论成功构建了3种SNCG shRNA慢病毒载体质粒,用其转染HEC-1-A和Ishikawa细胞后可有效沉默SNCG基因表达。
关键词
SNCG基因
短发夹干扰RNA
慢病毒载体质粒
子宫内膜癌
基因沉默
Keywords
SNCG gene
short hairpin RNA
lentivirus vector plasmid
endometrial carcinoma
gene silencing
分类号
R737.33 [医药卫生—肿瘤]
Q782 [生物学—分子生物学]
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职称材料
题名
稳定干扰Drp1基因的慢病毒载体质粒及神经母细胞瘤细胞株构建
被引量：
1
2
作者
周梦琪
柴原
冯琬迪
马浩洁
盖聪
孙红梅
机构
北京中医药大学中医学院
出处
《山东医药》
CAS
2019年第24期1-4,共4页
基金
国家自然科学基金资助项目(81573773
81774110)
文摘
目的构建稳定干扰Drp1基因的慢病毒载体质粒及神经母细胞瘤细胞株,为进一步探讨Drp1基因在帕金森病(PD)发病过程中的作用提供细胞模型。方法于GenBank中检索人Drp1基因的核苷酸序列,设计并筛选最佳动力学参数的干扰序列及阴性对照序列;根据靶序列分别设计并合成干扰RNA(siRNA)的单链DNA寡核苷酸(DNAoligo),与退火缓冲液反应后形成带黏性末端的双链DNAoligo片段。分别用AgeⅠ与EcoRⅠ双酶切双链DNAoligo片段和GV248慢病毒骨架质粒后,加入T4DNA连接酶连接,得到重组慢病毒载体质粒Drp1-RNAi和阴性对照质粒。将重组慢病毒载体质粒Drp1-RNAi加入到大肠杆菌TOP10感受态细胞中反应后,分别提取质粒DNA并进行DNA测序。将重组慢病毒载体质粒Drp1-RNAi和阴性对照质粒转染至293T细胞中,培养48h后收集上清液,离心后过滤得到Drp1-RNAi重组慢病毒和阴性对照慢病毒。将人神经母细胞瘤细胞株SH-SY5Y分为Drp1-RNAi重组慢病毒组(D组,用Drp1-RNAi重组慢病毒感染)、阴性对照组(N组,用阴性对照慢病毒感染)、正常对照组(C组,正常培养),采用实时荧光定量PCR法检测各组细胞Drp1mRNA,采用Westernblotting法检测各组细胞Drp1蛋白。结果重组慢病毒载体质粒Drp1-RNAi的DNA序列与设计的干扰序列完全一致。D组Drp1mRNA和蛋白的相对表达量为0.47±0.12和0.40±0.04,N组Drp1mRNA和蛋白的相对表达量为1.12±0.33和0.67±0.05,C组Drp1mRNA和蛋白的相对表达量为1.02±0.23和0.72±0.02;D组Drp1mRNA和蛋白的相对表达量与N组、C组相比,P均<0.05;N组Drp1mRNA和蛋白的相对表达量与C组相比,P均>0.05。结论成功构建了稳定干扰Drp1基因的慢病毒载体质粒,并建立、筛选出了稳定干扰Drp1基因的神经母细胞瘤细胞株,进一步探讨Drp1基因在PD发病过程中的作用提供细胞模型。
关键词
Drp1基因
RNA干扰
慢病毒载体质粒
神经母细胞瘤细胞株
帕金森病
Keywords
Drp1 gene
RNA interference
lentiviral vector plasmid
neuroblastoma cell line
Parkinson's disease
分类号
R745 [医药卫生—神经病学与精神病学]
在线阅读
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职称材料
题名
神经束蛋白155高表达少突胶质细胞模型的构建
被引量：
1
3
作者
胡斌
王成举
陈鹏慧
张雨平
机构
陆军军医大学第二附属医院
陆军军医大学基础医学院
出处
《山东医药》
CAS
2019年第18期28-31,共4页
基金
国家自然科学基金面上项目(81671496)
文摘
目的构建神经束蛋白155(neurofascin155,NF155)高表达的少突胶质细胞模型。方法 RT-PCR法提取NF155 cDNA,经T-A克隆及双酶切将其与pUM-T simple重组,构建NF155慢病毒载体质粒,NheⅠ、AgeⅠ双酶切后,片段大小及基因测序均显示NF155慢病毒载体质粒构建成功。取对数生长期少突胶质细胞分为空白对照组、阴性慢病毒感染组、NF155慢病毒感染组,空白对照组不做任何处理,阴性慢病毒感染组予10 μL空载体慢病毒+100 μL培养基,NF155慢病毒感染组予10 μL慢病毒载体质粒+100 μL培养基。培养12 h采用荧光定量PCR法检测NF155 mRNA,采用Western blotting法检测NF155蛋白。结果 NF155慢病毒感染组、空白对照组、阴性慢病毒感染组NF155 mRNA相对表达量分别为3.25±0.11、1.00±0.06、1.08±0.01,与空白对照组、阴性慢病毒感染组比较,NF155慢病毒感染组NF155 mRNA相对表达量升高( P 均<0.05)。NF155慢病毒感染组、空白对照组、阴性慢病毒感染组NF155 蛋白相对表达量分别为1.57±0.08、0.51±0.12、0.50±0.06,与空白对照组、阴性慢病毒感染组比较,NF155慢病毒感染组NF155蛋白相对表达量升高( P 均<0.05)。结论 成功构建NF155高表达的少突胶质细胞瞬转细胞模型。
关键词
神经束蛋白155
慢病毒载体质粒
神经束蛋白155
慢病毒载体质粒
少突胶质细胞
脑白质损伤
Keywords
neurofascin155
lentiviral vector
neurofascin155 lentiviral vector plasmid
oligodendrocytes
white matter injury
分类号
R394 [医药卫生—医学遗传学]
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职称材料
题名
作者
出处
发文年
被引量
操作
1
人SNCG基因shRNA慢病毒载体质粒的构建及鉴定
李文怡
范余娟
徐红
范江涛
孙丹
《山东医药》
CAS
北大核心
2016
3
在线阅读
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职称材料
2
稳定干扰Drp1基因的慢病毒载体质粒及神经母细胞瘤细胞株构建
周梦琪
柴原
冯琬迪
马浩洁
盖聪
孙红梅
《山东医药》
CAS
2019
1
在线阅读
下载PDF
职称材料
3
神经束蛋白155高表达少突胶质细胞模型的构建
胡斌
王成举
陈鹏慧
张雨平
《山东医药》
CAS
2019
1
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职称材料
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