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SmacsiRNA慢病毒载体的构建及其对Smac基因沉默效果的鉴定
被引量：
1
1
作者
李云
郑广瑛
蒋瑜
《中华实验眼科杂志》
CAS
CSCD
北大核心
2016年第3期199-204,共6页
背景研究证实半胱氨酸天冬氨酸蛋白水解酶激活剂（Smac）蛋白是肿瘤细胞的促凋亡蛋白，我们先前的研究表明，Smac蛋白在白内障患者LECs中表达量明显高于正常人，因此推测沉默LECs中Smac的表达可抑制LECs的过度凋亡，但如何成功将Smacsi...
背景研究证实半胱氨酸天冬氨酸蛋白水解酶激活剂（Smac）蛋白是肿瘤细胞的促凋亡蛋白，我们先前的研究表明，Smac蛋白在白内障患者LECs中表达量明显高于正常人，因此推测沉默LECs中Smac的表达可抑制LECs的过度凋亡，但如何成功将SmacsiRNA转染进入LECs是研究的关键。目的构建人SmacsiRNA慢病毒载体并对人LECs进行感染，研究慢病毒载体构建方法及其在人晶状体上皮细胞HLE—B3中的干扰效率，利用RNA干扰（RNAi）技术建立Smac低表达的HLE—B3株。方法根据我们前期的工作设计并合成针对Smac基因序列的siRNA序列，将合成的双链DNA以T4噬菌体DNA连接酶与GV118慢病毒载体相连接，转化DH5α感受态细胞，采用PCR筛选阳性克隆，经测序鉴定正确后，感染293T细胞，收集上清液并标定病毒滴度。用重组慢病毒感染HLE—B3细胞，荧光显微镜下观察转染后的阳性HLE—B3细胞数并计算病毒感染复数（MOI）。将常规培养的HLE—B3细胞分为阴性对照组、空质粒组和GV118-Smac—siRNA1组，阴性对照组为常规培养的细胞，空质粒组细胞仅转染不含慢病毒载体的siRNA质粒，GV118-Smac·siRNA1组细胞转染GV118-Smac—siRNA1质粒，采用实时荧光定量PCR检测各组细胞中SmacmRNA的相对表达量。结果构建的重组载体GV118-Smac—siRNAl转化DH5c感受态细胞后阳性克隆产物大小为340bp，空载的克隆产物为299bp，与预期结果相符，测序结果显示合成的Smac—siRNA1与预期目的序列一致。构建的GV118-Smac—siRNA1病毒滴度为3．0x10。TU／m1。感染HLE．B3细胞后荧光显微镜下可见MOI为100时，细胞毒性低且感染效率高，约为82％。阴性对照组、空载质粒组和GV118-Smac—siRNA1质粒组细胞中SmacmRNA相对表达量分别为（101．290±8．349）％、（92．330±6．320）％和（32．540±4．221）％，3个组间总体比较差异有统计学意义（F=32．871，P〈0．01），其中GV118-Smac—siRNA1质粒组细胞中SmacmRNA相对表达量较阴性对照组明显下降，差异有统计学意义（P=0．000），而空载质粒组细胞中SmacmRNA相对表达量略低于阴性对照组，但组间差异无统计学意义（P=0．535）。结论本研究中成功构建了siRNA慢病毒载体GV118-Smac—siRNA1，其转染HLE—B3效率高，该siRNA载体能够有效地抑制人LECs中Smac基因的表达。
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关键词
线粒体蛋白
凋亡
小干扰RNA
基因
载体
慢病毒载体/基因
基因
转染技术
人
晶状体上皮细胞
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职称材料
题名
SmacsiRNA慢病毒载体的构建及其对Smac基因沉默效果的鉴定
被引量：
1
1
作者
李云
郑广瑛
蒋瑜
机构
郑州大学第一附属医院眼科河南省高等学校临床医学重点学科开放实验室
出处
《中华实验眼科杂志》
CAS
CSCD
北大核心
2016年第3期199-204,共6页
基金
国家自然科学基金项目（81270986）
文摘
背景研究证实半胱氨酸天冬氨酸蛋白水解酶激活剂（Smac）蛋白是肿瘤细胞的促凋亡蛋白，我们先前的研究表明，Smac蛋白在白内障患者LECs中表达量明显高于正常人，因此推测沉默LECs中Smac的表达可抑制LECs的过度凋亡，但如何成功将SmacsiRNA转染进入LECs是研究的关键。目的构建人SmacsiRNA慢病毒载体并对人LECs进行感染，研究慢病毒载体构建方法及其在人晶状体上皮细胞HLE—B3中的干扰效率，利用RNA干扰（RNAi）技术建立Smac低表达的HLE—B3株。方法根据我们前期的工作设计并合成针对Smac基因序列的siRNA序列，将合成的双链DNA以T4噬菌体DNA连接酶与GV118慢病毒载体相连接，转化DH5α感受态细胞，采用PCR筛选阳性克隆，经测序鉴定正确后，感染293T细胞，收集上清液并标定病毒滴度。用重组慢病毒感染HLE—B3细胞，荧光显微镜下观察转染后的阳性HLE—B3细胞数并计算病毒感染复数（MOI）。将常规培养的HLE—B3细胞分为阴性对照组、空质粒组和GV118-Smac—siRNA1组，阴性对照组为常规培养的细胞，空质粒组细胞仅转染不含慢病毒载体的siRNA质粒，GV118-Smac·siRNA1组细胞转染GV118-Smac—siRNA1质粒，采用实时荧光定量PCR检测各组细胞中SmacmRNA的相对表达量。结果构建的重组载体GV118-Smac—siRNAl转化DH5c感受态细胞后阳性克隆产物大小为340bp，空载的克隆产物为299bp，与预期结果相符，测序结果显示合成的Smac—siRNA1与预期目的序列一致。构建的GV118-Smac—siRNA1病毒滴度为3．0x10。TU／m1。感染HLE．B3细胞后荧光显微镜下可见MOI为100时，细胞毒性低且感染效率高，约为82％。阴性对照组、空载质粒组和GV118-Smac—siRNA1质粒组细胞中SmacmRNA相对表达量分别为（101．290±8．349）％、（92．330±6．320）％和（32．540±4．221）％，3个组间总体比较差异有统计学意义（F=32．871，P〈0．01），其中GV118-Smac—siRNA1质粒组细胞中SmacmRNA相对表达量较阴性对照组明显下降，差异有统计学意义（P=0．000），而空载质粒组细胞中SmacmRNA相对表达量略低于阴性对照组，但组间差异无统计学意义（P=0．535）。结论本研究中成功构建了siRNA慢病毒载体GV118-Smac—siRNA1，其转染HLE—B3效率高，该siRNA载体能够有效地抑制人LECs中Smac基因的表达。
关键词
线粒体蛋白
凋亡
小干扰RNA
基因
载体
慢病毒载体/基因
基因
转染技术
人
晶状体上皮细胞
Keywords
Mitochondrial proteins
Apoptosis
RNA, small interfering
Genetic vectors
Lentivirus/genetics
Gene transfer techniques
Humans
Lens epithelial cells
分类号
R363 [医药卫生—病理学]
Q782 [生物学—分子生物学]
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职称材料
题名
作者
出处
发文年
被引量
操作
1
SmacsiRNA慢病毒载体的构建及其对Smac基因沉默效果的鉴定
李云
郑广瑛
蒋瑜
《中华实验眼科杂志》
CAS
CSCD
北大核心
2016
1
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