人野生型和A53T突变型α-突触核蛋白慢病毒表达载体的构建及在PC12细胞中的转染 被引量：4

1

作者 兰丹梅 邬剑军 +3 位作者 苏雅茹 陈嬿 蒋雨平 王坚 《神经解剖学杂志》 CAS CSCD 北大核心 2009年第3期289-294,共6页

为构建长期稳定表达人野生型和A53T突变型α-突触核蛋白的PC12细胞株,我们首先制备了慢病毒表达载体,经测序鉴定正确后转染PC12细胞,然后通过细胞的免疫荧光染色检测α-synuclein-V5融合蛋白,PCR法扩增转基因PC12细胞的SNCA片段后进行... 为构建长期稳定表达人野生型和A53T突变型α-突触核蛋白的PC12细胞株,我们首先制备了慢病毒表达载体,经测序鉴定正确后转染PC12细胞,然后通过细胞的免疫荧光染色检测α-synuclein-V5融合蛋白,PCR法扩增转基因PC12细胞的SNCA片段后进行测序检测突变基因,以及Western blot法检测PC12细胞α-synuclein的表达,从而鉴定转基因细胞能否稳定表达目的基因。结果显示:经测序,pLenti6/V5-SNCA-WT和pLenti6/V5-SNCA-A53T表达质粒构建成功;免疫荧光染色示基因转染后,超过95%的PC12细胞中有α-synuclein-V5融合蛋白表达;转基因细胞的SNCA片段测序结果显示,慢病毒表达载体成功整合入PC12细胞基因组;Western blot法检测结果示转基因PC12细胞能够过表达α-synuclein蛋白。以上结果表明我们已成功构建了人野生型和A53T突变型α-突触核蛋白慢病毒表达载体,并且成功建立了稳定的过表达人野生型和A53T突变型α-突触核蛋白的PC12细胞株,这为进一步研究α-突触核蛋白的生理功能及其在Parkinson病发病机制中的作用奠定了基础。 展开更多

关键词 Α-突触核蛋白 慢病毒表达载体 PC12细胞 PARKINSON病 转基因细胞 突变基因

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BIRC5 shRNA慢病毒表达载体的构建与鉴定 被引量：2

2

作者 饶国洲 李昂 +3 位作者 朱永进 石建峰 苟建重 张引成 《细胞与分子免疫学杂志》 CAS CSCD 北大核心 2011年第7期767-769,共3页

目的:应用RNA干扰技术,以人BIRC5基因为靶基因,设计合成3对短发夹结构的互补DNA序列和一对阴性对照序列,构建慢病毒干扰载体并鉴定。方法:将设计合成的单链引物退火成双链oligo序列,连接入经AgeI和EcoR I双酶切线性化的pMAGic慢病毒质... 目的:应用RNA干扰技术,以人BIRC5基因为靶基因,设计合成3对短发夹结构的互补DNA序列和一对阴性对照序列,构建慢病毒干扰载体并鉴定。方法:将设计合成的单链引物退火成双链oligo序列,连接入经AgeI和EcoR I双酶切线性化的pMAGic慢病毒质粒载体中,经转化DH5α感受态细胞并筛选出阳性克隆,采用PCR扩增和DNA测序鉴定阳性克隆。结果:PCR扩增产物经凝胶电泳阳性克隆得到335 bp条带,阴性克隆得到298 bp条带,DNA测序结果证实其含设计合成序列。结论:4对BIRC5 shRNA重组慢病毒表达载体构建成功,为研究靶向BIRC5 siRNA对肿瘤细胞增殖抑制与诱导凋亡作用及基因治疗研究奠定了实验基础。 展开更多

关键词 RNA干扰 BIRC5 慢病毒表达载体

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人CCL20基因特异性shRNA重组慢病毒表达载体的构建及测序 被引量：2

3

作者 董征学 彭代智 +7 位作者 刘敬 周新 田易 李芳 严泉 林恒 王勇 周光前 《第三军医大学学报》 CAS CSCD 北大核心 2006年第10期1007-1009,共3页

目的利用RNA干扰技术,以人CCL20基因为靶基因,设计CCL20基因特异性的小干扰RNA(siRNA),构建其短发夹RNA(shRNA)重组慢病毒表达载体,并进行测序鉴定。方法设计并合成人CCL20基因特异性的DNA寡核苷酸,连接到经SpeⅠ和SalⅠ双酶切线性化的p... 目的利用RNA干扰技术,以人CCL20基因为靶基因,设计CCL20基因特异性的小干扰RNA(siRNA),构建其短发夹RNA(shRNA)重组慢病毒表达载体,并进行测序鉴定。方法设计并合成人CCL20基因特异性的DNA寡核苷酸,连接到经SpeⅠ和SalⅠ双酶切线性化的pHSER dsRNA GFP SIN质粒上,转化大肠杆菌DH5α感受态细胞,筛选阳性菌落、扩增后提取质粒,进行DNA测序鉴定。结果将合成的两对人CCL20基因特异性DNA寡核苷酸序列退火后,分别克隆到线性化的pHSER dsRNA GFP SIN载体质粒上。在氨苄青霉素培养基条件下,筛选出相应的阳性菌落,经DNA测序鉴定确实为所需序列。结论构建成功了2对人CCL20基因特异性shRNA重组慢病毒表达载体,可进一步用于干扰CCL20基因的mRNA转录,从而为制备CCL20基因表达抑制型的人角朊干细胞奠定基础。 展开更多

关键词 RNA干扰 慢病毒表达载体 CCL20基因

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大鼠pLenti6.3-Olig1-RFP慢病毒表达载体的构建与包装 被引量：1

4

作者 席进 陈月娟 +3 位作者 张楠 张敬星 胡建国 吕合作 《华中科技大学学报（医学版）》 CAS CSCD 北大核心 2015年第2期176-179,共4页

目的构建大鼠少突胶质细胞转录因子1(Olig1)的慢病毒表达载体,并进行鉴定和包装。方法采用聚合酶链反应(PCR),分别以大鼠pEGFP-N3-Olig1表达质粒和pDsRed-monomer-N1为模板,扩增获得大鼠Olig1片段和红色荧光蛋白(RFP)片段。将两者进行PC... 目的构建大鼠少突胶质细胞转录因子1(Olig1)的慢病毒表达载体,并进行鉴定和包装。方法采用聚合酶链反应(PCR),分别以大鼠pEGFP-N3-Olig1表达质粒和pDsRed-monomer-N1为模板,扩增获得大鼠Olig1片段和红色荧光蛋白(RFP)片段。将两者进行PCR拼接获得Olig1-RFP片段,并与pLenti6.3-MCS-DEST载体连接,构建获得pLenti6.3-Olig1-RFP慢病毒表达载体,并进行酶切鉴定、测序。然后,将其与包装质粒混合后共转染HEK293T细胞进行包装获得慢病毒颗粒。结果通过酶切鉴定、测序,证明pLenti6.3-Olig1-RFP慢病毒表达载体构建成功,且能够被高效地包装为病毒颗粒。结论成功建立大鼠pLenti6.3-Olig1-RFP慢病毒表达系统,为进一步研究Olig1的生物学作用提供了实验基础。 展开更多

关键词 少突胶质细胞转录因子1 慢病毒表达载体 包装 聚合酶链反应 大鼠

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猪MEF2C基因慢病毒表达载体构建及C2C12细胞转染条件的优化 被引量：2

5

作者 朱弘焱 杨卉新 +1 位作者 田玉民 苏玉虹 《现代畜牧兽医》 2014年第3期1-4,共4页

MEF2C基因能够控制肌细胞分化过程中的基因转录,特别在骨骼肌、心肌和平滑肌中介导细胞的分化。本研究将猪MEF2C基因化学合成后经Bam HI和Asc I双酶切后克隆到慢病毒表达载体pLenti6.3_MCS_IRES2-EGFP中,获得的重组质粒用限制性内切酶... MEF2C基因能够控制肌细胞分化过程中的基因转录,特别在骨骼肌、心肌和平滑肌中介导细胞的分化。本研究将猪MEF2C基因化学合成后经Bam HI和Asc I双酶切后克隆到慢病毒表达载体pLenti6.3_MCS_IRES2-EGFP中,获得的重组质粒用限制性内切酶酶切分析和测序鉴定;利用慢病毒阴性对照侵染靶细胞C2C12来确定最佳MOI值以及靶细胞最适抗生素Blasticidin剂量。结果显示猪MEF2C基因成功克隆到慢病毒表达载体中;该重组质粒侵染靶细胞C2C12的最佳MOI值为300;靶细胞抗生素的筛选剂量为4μg/mL,维持剂量为3μg/mL上述试验为建立MEF2C稳定过表达细胞系提供了前期工作基础。 展开更多

关键词 猪 MEF2C基因 慢病毒表达载体 C2C12细胞

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基于Cre-LoxP系统的新型慢病毒表达载体pLOX-CMV-E/P的构建与鉴定

6

作者 高文勇 夏景波 +4 位作者 陈卓莹 吴彩红 王健欢 龙颖妍 齐绪峰 《暨南大学学报（自然科学与医学版）》 CAS CSCD 北大核心 2015年第2期160-167,共8页

目的:基于Cre-Lox P系统构建携带EGFP及Puromycin抗性基因,并带有巨细胞病毒(CMV)及翻译延伸因子1α(EF1α)双启动子的新型慢病毒表达载体,为基因治疗及基因功能研究提供有效的慢病毒载体系统.方法:以已经插入Lox P序列的p LOX-TERT-ire... 目的:基于Cre-Lox P系统构建携带EGFP及Puromycin抗性基因,并带有巨细胞病毒(CMV)及翻译延伸因子1α(EF1α)双启动子的新型慢病毒表达载体,为基因治疗及基因功能研究提供有效的慢病毒载体系统.方法:以已经插入Lox P序列的p LOX-TERT-ires TK慢病毒载体为模板,用Spe I与Kpn I进行双酶切,去除TERT-ires TK片段,然后与人工设计合成的多克隆位点片段连接,构建p LOX-MCS表达载体.同时,以p B513载体为模板扩增EF1α-EGFP-Puro表达框(带有Bam HI及Kpn I酶切位点),然后与经过Bam HI及Kpn I双酶切的p LOX-MCS载体连接,进而构建p LOX-CMV-EF1α-EGFP-Puro(简称p LOX-CMV-E/P)载体.将p LOX-CMV-E/P载体与慢病毒包装载体p CMVR8.74及p MD2.G共转染293T细胞,包装病毒进行报告基因的功能分析.结果:菌落聚合酶链式反应(PCR)、酶切鉴定及测序结果均与预期结果一致,绿色荧光蛋白及抗药性基因均有较好的活性与功能.结论:成功构建了p LOX-MCS及p LOX-CMV-E/P慢病毒表达载体,为基因治疗及基因功能研究提供有效的慢病毒表达系统. 展开更多

关键词 慢病毒表达载体 CRE-LOXP 系统 绿色荧光蛋白基因 嘌呤霉素抗性基因

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miRNA慢病毒表达载体的构建及其在原代培养的大鼠胚胎大脑皮层神经细胞中的稳定表达

7

作者 刘伊宁 李晓苗 +8 位作者 来雯婷 吉别克.瓦提别克 美丽吾尔提.达吾列提汗 沙亚哈提.别尔克哈之 李卉 李颖 刘玲 王海峰 李惠武 《神经解剖学杂志》 CAS CSCD 北大核心 2016年第6期769-773,共5页

目的:构建miRNA的慢病毒表达载体,使其在原代培养的大鼠胚胎大脑皮层神经细胞中稳定表达。方法:将该干扰片段构建入慢病毒载体(pL KD-Ubc-eG FP-U6-shRNA)的U6启动子下游,该载体可以实现在干扰小片段RNA的同时表达绿色荧光蛋白EGFP基因... 目的:构建miRNA的慢病毒表达载体,使其在原代培养的大鼠胚胎大脑皮层神经细胞中稳定表达。方法:将该干扰片段构建入慢病毒载体(pL KD-Ubc-eG FP-U6-shRNA)的U6启动子下游,该载体可以实现在干扰小片段RNA的同时表达绿色荧光蛋白EGFP基因,便于观察载体工作状态。通过脂质体转染法转染原代培养的大鼠胚胎大脑皮层神经细胞,观察转染的原代培养的大鼠胚胎大脑皮层神经细胞的形态及表达情况。结果:针对筛选的miRNA构建的慢病毒载体,经过DNA测序结果和琼脂糖凝胶电泳鉴定成功构建了筛选的miRNA的慢病毒表达载体,重组质粒转染原代培养的大鼠胚胎大脑皮层神经细胞,经24 h后在荧光倒置显微镜下可以观察到部分细胞带有绿色荧光,筛选的miRNA构建的慢病毒载体在原代培养的大鼠胚胎大脑皮层神经细胞中稳定表达。结论:筛选的miRNA的慢病毒表达载体构建成功,并稳定的转染到原代培养的大鼠胚胎大脑皮层神经细胞中,为miRNA对神经细胞存活功能的研究提供了平台。 展开更多

关键词 大脑皮层神经细胞 慢病毒表达载体 MIRNA NOIG-17 EGFP 大鼠

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绵羊IGF1基因慢病毒表达载体的构建及其促肌细胞生长作用研究 被引量：5

8

作者 安静 张雪梅 +1 位作者 刘晨曦 刘明军 《西北农林科技大学学报（自然科学版）》 CSCD 北大核心 2014年第4期15-21,共7页

【目的】克隆绵羊IGF1基因CDS区，构建绵羊IGF1基因慢病毒表达载体，分析IGF1基因在绵羊成肌细胞增殖过程中的作用。【方法】提取绵羊肝组织总RNA，通过RT-PCR方法获得IGF1全长CDS序列，经测序鉴定后与慢病毒载体pLEX-mcs连接，构建pLEX... 【目的】克隆绵羊IGF1基因CDS区，构建绵羊IGF1基因慢病毒表达载体，分析IGF1基因在绵羊成肌细胞增殖过程中的作用。【方法】提取绵羊肝组织总RNA，通过RT-PCR方法获得IGF1全长CDS序列，经测序鉴定后与慢病毒载体pLEX-mcs连接，构建pLEX-IGF-1慢病毒重组表达质粒，并在293T细胞中进行病毒包装和生产。分离培养绵羊原代成肌细胞，并用重组慢病毒使其感染，建立稳定转染pLEX-IGF-1的绵羊成肌细胞系。通过绘制细胞生长曲线，分析过表达IGF1对绵羊成肌细胞生长的影响；采用流式细胞仪检测细胞周期变化。【结果】克隆获得长518 bp的IGF1 CDS区序列。成功构建了pLEX-IGF-1载体，其可在绵羊细胞系中进行稳定表达。通过Western blotting检测显示，IGF1在293T细胞以及绵羊原代成肌细胞中获得表达，细胞生长曲线显示，稳定表达IGF1的成肌细胞比对照细胞生长速度显著加快（第1天差异显著（P＜0.05），第2～6天差异极显著（P＜0.01））；细胞周期测定结果显示，稳定表达IGF1的成肌细胞比对照细胞较早进入S期，且在S期的细胞数目比对照细胞多29.35%。【结论】绵羊IGF1能够有效促进绵羊成肌细胞的生长。 展开更多

关键词 绵羊IGF1基因 慢病毒表达载体 细胞生长曲线

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MiR-218慢病毒表达载体的构建及鉴定 被引量：1

9

作者 石晓磊 胡凤蓉 +1 位作者 胡思隽 王为忠 《科学技术与工程》 2011年第13期2888-2892,共5页

构建人m ir-218-2,pre-m iRNA慢病毒表达载体,为研究m iR-218在人体的功能及作用机制打下基础。以人hsa-m ir-218-2前体序列,设计部分互补的正反向引物,进行引物退火,形成引物二聚体。PCR扩增引物二聚体,酶切后插入到线性化pGCSIL-GFP... 构建人m ir-218-2,pre-m iRNA慢病毒表达载体,为研究m iR-218在人体的功能及作用机制打下基础。以人hsa-m ir-218-2前体序列,设计部分互补的正反向引物,进行引物退火,形成引物二聚体。PCR扩增引物二聚体,酶切后插入到线性化pGCSIL-GFP慢病毒表达载体中,对重组质粒进行双酶切鉴定,并进行慢病毒的包装与滴度检测。用构建好的慢病毒表达载体感染人胃癌细胞MKN-28,qPCR检测细胞内m iR-218表达。结果显示,重组质粒经双酶切分析及转化菌液测序,插入序列正确,慢病毒表达载体感染人胃癌细胞后qPCR检测显示能显著增高m iR-218的表达。说明本实验成功构建了hsa-m ir-218-2慢病毒表达载体,感染人胃癌细胞后能有效提高m iR-218的表达。为进一步研究m iR-218在人体的功能及作用机制建立了实验基础。 展开更多

关键词 MICRORNA MIR-218 慢病毒表达载体

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IRF5基因慢病毒表达载体的构建及其在巨噬细胞RAW264.7中的表达

10

作者 麦莉 韦建瑞 华兴 《吉林大学学报（医学版）》 CAS CSCD 北大核心 2016年第3期452-456,共5页

目的:构建干扰素凋节因子5(IRF5)慢病毒表达载体LV11-cmv-neo-IRF5并转染巨噬细胞RAW264.7,观察IRF5巨噬细胞RAW264.7中的表达。方法:采用基因重组技术,将PCR技术钓取的目的基因IRF5片段克隆至线性化慢病毒表达载体LV11中,重组载体经PC... 目的:构建干扰素凋节因子5(IRF5)慢病毒表达载体LV11-cmv-neo-IRF5并转染巨噬细胞RAW264.7,观察IRF5巨噬细胞RAW264.7中的表达。方法:采用基因重组技术,将PCR技术钓取的目的基因IRF5片段克隆至线性化慢病毒表达载体LV11中,重组载体经PCR、双酶切和测序鉴定构建成功后,采用脂质体转染技术将表达质粒和包装质粒共转染293FT细胞,获得携带IRF5基因的重组慢病毒;收集病毒上清液感染小鼠巨噬细胞RAW264.7,用G418将非浸染的细胞致死,获得纯净的浸染细胞,即RAW264.7-IRF5细胞(实验组),并将RAW264.7-NC细胞作为对照(对照组)。分别采用RT-qPCR和Western blotting法检测2组细胞中IRF5mRNA和蛋白的表达水平。结果:重组慢病毒质粒LV11-cmv-neo-IRF5经PCR和酶切法鉴定构建成功;病毒上清液感染RAW264.7细胞并经G418筛选获得阳性细胞;RT-qPCR法检测,与对照组比较,实验组细胞中IRF5mRNA表达水平升高(P<0.001);Western blotting法检测,实验组细胞中IRF5蛋白的表达水平明显高于对照组。结论:成功构建携带IRF5基因的慢病毒表达载体LV11-cmv-neo-IRF5,IRF5基因在巨噬细胞RAW264.7中稳定表达。 展开更多

关键词 干扰素调节因子5 慢病毒表达载体 动脉粥样硬化 巨噬细胞

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免疫检查点TIGIT慢病毒表达载体的构建和稳定表达TIGIT细胞系的建立 被引量：1

11

作者 穆业腾 郭冲 +5 位作者 胡楠楠 杨馥旭 薛晗 范宇鑫 郭峰霖 关新刚 《吉林大学学报（医学版）》 CAS CSCD 北大核心 2022年第5期1341-1347,共7页

目的:构建T细胞免疫球蛋白和免疫受体酪氨酸抑制基序结构域-绿色荧光蛋白(TIGITGFP)慢病毒表达载体,建立稳定表达TIGIT-GFP的细胞系,探讨TIGIT-GFP融合蛋白在稳定表达细胞系中的表达情况。方法:将TIGIT质粒和慢病毒载体pLenti-GFP分别... 目的:构建T细胞免疫球蛋白和免疫受体酪氨酸抑制基序结构域-绿色荧光蛋白(TIGITGFP)慢病毒表达载体,建立稳定表达TIGIT-GFP的细胞系,探讨TIGIT-GFP融合蛋白在稳定表达细胞系中的表达情况。方法:将TIGIT质粒和慢病毒载体pLenti-GFP分别采用限制性内切酶EcoRⅠ和NotⅠ双酶切,凝胶回收后连接构建重组质粒pLenti-TIGIT-GFP。将测序正确的重组质粒转染人胚胎肾HEK293T细胞作为实验组,转染TIGIT质粒的HEK293T细胞作为对照组,转染48 h后荧光显微镜下观察细胞膜上GFP表达情况。将实验组细胞继续培养,采用嘌呤霉素筛选2周后,挑取单克隆扩大培养,荧光显微镜观察细胞膜上GFP表达情况,Western blotting法检测在转染的人胚胎肾HEK293T细胞中TIGIT-GFP蛋白表达情况。结果:酶切鉴定,TIGIT基因成功插入pLenti-GFP表达载体,DNA测序未检测到突变发生。实验组细胞膜上检测到GFP表达。Western blotting法检测,实验组细胞裂解液中检测到TIGIT-GFP特异性条带。结论:成功构建pLenti-TIGIT-GFP慢病毒表达载体,建立稳定表达TIGIT-GFP融合蛋白的细胞系,TIGIT-GFP融合蛋白主要在稳定细胞系的细胞膜上表达。 展开更多

关键词 T细胞免疫球蛋白和免疫受体酪氨酸抑制基序结构域 绿色荧光蛋白 慢病毒表达载体 稳定转染 单克隆细胞

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PRDM5过表达慢病毒载体的构建及稳定转染Neuro-2a细胞的建立

12

作者 吴钊淳 李友 +2 位作者 何嘉文 廖科棋 李胜男 《吉林大学学报(医学版)》 北大核心 2025年第1期1-8,共8页

目的:构建PR锌指区域蛋白(PRDM)5基因的过表达慢病毒载体,建立稳定转染的小鼠神经瘤母细胞Neuro-2a,为探讨PRDM5在缺血性脑卒中(IS)发病机制中的作用奠定基础。方方法法:在NCBI上搜索PRDM5的序列并设计引物,PCR法扩增获取PRDM5基因序列... 目的:构建PR锌指区域蛋白(PRDM)5基因的过表达慢病毒载体,建立稳定转染的小鼠神经瘤母细胞Neuro-2a,为探讨PRDM5在缺血性脑卒中(IS)发病机制中的作用奠定基础。方方法法:在NCBI上搜索PRDM5的序列并设计引物,PCR法扩增获取PRDM5基因序列,将其与Bam HⅠ和AgeⅠ限制性内切酶双酶切后的慢病毒载体GV492进行连接,构建GV492-PRDM5过表达重组质粒,采用PCR法筛选并鉴定出的与目的基因片段长度相近的阳性克隆送生工生物工程(上海)股份有限公司测序。将测序正确的GV492-control质粒和GV492-PRDM5过表达重组质粒分别转染至人胚胎肾细胞HEK293T中,转染48 h后离心收集慢病毒,分别为GV492-control慢病毒和GV492-PRDM5过表达慢病毒,采用慢病毒滴度测定法检测上述2种慢病毒滴度。将Neuro-2a细胞分为GV492-control组和GV492-PRDM5组,分别使用GV492-control慢病毒和GV492-PRDM5过表达慢病毒感染Neuro-2a细胞,慢病毒感染复数(MOI)为100,感染72 h后使用嘌呤霉素(10 mg·L^(-1))对成功感染GV492-control慢病毒和GV492-PRDM5过表达慢病毒的Neuro-2a细胞进行筛选,通过荧光显微镜观察GV492-control组和GV492-PRDM5组Neuro-2a细胞的生长状态及绿色荧光蛋白的表达情况。采用实时荧光定量PCR(RT-qPCR)法检测2组Neuro-2a细胞中PRDM5 mRNA表达水平;Western blotting法检测2组Neuro-2a细胞中PRDM5蛋白表达水平。结果:PCR法,GV492-PRDM5重组质粒阳性转化子的长度约为684 bp,GV492-PRDM5过表达重组质粒基因序列与设计合成的PRDM5过表达序列一致;GV492-control慢病毒和GV492-PRDM5过表达慢病毒的滴度均为2.5×108 TU·mL^(-1)。荧光显微镜,GV492-control组和GV492-PRDM5组Neuro-2a细胞的生长状态均良好,且能观察到绿色荧光蛋白的表达。RT-qPCR法,与GV492-control组比较,GV492-PRDM5组Neuro-2a细胞中PRDM5 mRNA表达水平明显升高(P<0.01)。Western blotting法,GV492-control组和GV492-PRDM5组Neuro-2a细胞在相对分子质量为75000附近出现特异性条带;与GV492-control组比较,GV492-PRDM5组Neuro-2a细胞中PRDM5蛋白表达水平升高(P<0.01)。结论:成功构建PRDM5过表达慢病毒载体,建立了稳定转染的GV492-PRDM5-Neuro-2a细胞。 展开更多

关键词 PR锌指区域蛋白 过表达慢病毒载体 稳定表达 Neuro-2a细胞

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胞质分裂作用因子4过表达慢病毒载体的构建和稳定转染Neuro-2a细胞的建立

13

作者 李胜男 何嘉文 +1 位作者 廖科棋 李友 《吉林大学学报（医学版）》 CAS CSCD 北大核心 2024年第5期1322-1329,共8页

目的:构建胞质分裂作用因子4(DOCK4)过表达慢病毒载体,建立DOCK4稳定过表达的Neuro-2a细胞。方法:在美国国家生物信息中心(NCBI)查找DOCK4的序列并设计合成引物,采用聚合酶链式反应(PCR)法扩增获取DOCK4基因序列,通过Bam HⅠ和AgeⅠ限... 目的:构建胞质分裂作用因子4(DOCK4)过表达慢病毒载体,建立DOCK4稳定过表达的Neuro-2a细胞。方法:在美国国家生物信息中心(NCBI)查找DOCK4的序列并设计合成引物,采用聚合酶链式反应(PCR)法扩增获取DOCK4基因序列,通过Bam HⅠ和AgeⅠ限制性内切酶酶切后,将其与酶切后的慢病毒载体GV492进行连接,构建GV492-DOCK4过表达重组质粒,PCR法鉴定筛选出与目的基因片段长度大小相近的阳性克隆。将GV492-对照质粒和GV492-DOCK4过表达重组质粒分别转染至HEK293T细胞中,转染48 h后收集慢病毒进行包装并测定病毒滴度。将Neuro-2a细胞分为GV492-对照组和GV492-DOCK4组,分别采用GV492-对照组慢病毒和GV492-DOCK4过表达慢病毒感染Neuro-2a细胞,慢病毒感染复数(MOI)为100,感染72 h后采用嘌呤霉素(10 mg·L^(-1))筛选出成功感染GV492-对照组慢病毒和GV492-DOCK4过表达慢病毒的Neuro-2a细胞,荧光显微镜观察各组Neuro-2a细胞生长状态及绿色荧光蛋白表达情况;采用实时荧光定量PCR(RT-qPCR)法和Western blotting法检测各组Neuro-2a细胞中DOCK4 mRNA和DOCK4蛋白表达水平。结果:PCR检测,GV492-DOCK4过表达重组质粒的基因片段长度约为691 bp,测序结果显示GV492-DOCK4过表达重组质粒基因序列与设计合成的DOCK4过表达序列一致;GV492-对照组和GV492-DOCK4过表达组慢病毒的滴度分别为2.5×10^(8) TU·mL^(-1)和2.5×10^(8) TU·mL^(-1);荧光显微镜观察,各组Neuro-2a细胞生长状态良好且存在绿色荧光蛋白表达;RT-qPCR法检测,与GV492-对照组比较,GV492-DOCK4组Neuro-2a细胞中DOCK4 mRNA表达水平明显升高(P<0.01);Western blotting法检测,各组细胞在相对分子质量225000附近出现特异性条带,与GV492-对照组比较,GV492-DOCK4组Neuro-2a细胞中DOCK4蛋白表达水平明显升高(P<0.01)。结论:本研究成功构建DOCK4过表达慢病毒载体,建立了稳定过表达DOCK4的Neuro-2a细胞。 展开更多

关键词 胞质分裂作用因子4 过表达慢病毒载体 Neuro-2a细胞 稳定转染 过表达慢病毒

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Gαs慢病毒载体的构建、鉴定与表达 被引量：2

14

作者 王凯 赵悦 +3 位作者 朱青 张丹 马瑾璐 韩苏夏 《细胞与分子免疫学杂志》 CAS CSCD 北大核心 2012年第1期43-45,共3页

目的:构建Gαs慢病毒表达载体并检测其表达性能,以便应用过表达技术进一步研究Gαs功能。方法:设计针对人Gαs DNA序列的带酶切位点引物,PCR扩增获得双链DNA后,与酶切后的FUW载体片段进行连接、转化,酶切及DNA测序鉴定重组克隆。提取阳... 目的:构建Gαs慢病毒表达载体并检测其表达性能,以便应用过表达技术进一步研究Gαs功能。方法:设计针对人Gαs DNA序列的带酶切位点引物,PCR扩增获得双链DNA后,与酶切后的FUW载体片段进行连接、转化,酶切及DNA测序鉴定重组克隆。提取阳性克隆质粒,转染293T细胞。用293T细胞制备慢病毒颗粒,感染293T细胞后收集细胞全蛋白,用QPCR、Western blot检测慢病毒系统过表达效果。结果:证实人Gαs正确插入慢病毒载体,人Gαs慢病毒过表达质粒及相应病毒颗粒能有效过表达Gαs。结论:人Gαs慢病毒表达系统的成功建立,为应用过表达技术研究人Gαs慢病毒功能打下了基础。 展开更多

关键词 Gαs 慢病毒表达载体

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SurvivinshRNA-APC双基因共表达慢病毒载体对HT-29结肠癌细胞裸鼠皮下移植瘤生长情况的影响 被引量：10

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作者 袁禧先 温超 +4 位作者 曹雅 杜井峰 程开 朱艳丽 段厚羽 《医学研究生学报》 CAS 北大核心 2017年第6期584-590,共7页

目的在转录后水平进行干预的RNA干扰技术在多基因治疗中的应用越来越广泛。文中旨在构建人HT-29结肠癌细胞裸鼠皮下移植瘤模型,通过联合RNAi和外源性补充的方式研究Survivin shRNA-APC双基因共表达慢病毒载体对结肠癌裸鼠移植瘤生长情... 目的在转录后水平进行干预的RNA干扰技术在多基因治疗中的应用越来越广泛。文中旨在构建人HT-29结肠癌细胞裸鼠皮下移植瘤模型,通过联合RNAi和外源性补充的方式研究Survivin shRNA-APC双基因共表达慢病毒载体对结肠癌裸鼠移植瘤生长情况的影响。方法选取35只裸鼠随机数字表法分为5组,即Survivin shRNA-APC双基因组、Survivin shRNA组、APC组、空载组和空白组,每组7只;将已经构建好的处于对数生长期的双基因共表达Survivin shRNA-APC、Survivin shRNA及APC稳转株,空载稳转株,HT-29结肠癌细胞(均为2×106/mL)分别注射至5组裸鼠左前腋下成瘤,构建人HT-29结肠癌细胞裸鼠皮下移植瘤模型;通过测量瘤体体积、重量,检测移植瘤生长抑制率,Real time PCR检测移植瘤组织survivin mRNA的表达,免疫组化检测Survivin蛋白的表达,TUNEL检测凋亡情况。结果与空白组比较,APC组、Survivin shRNA组、双基因组移植瘤平均体积、平均重量均减少(P<0.05);与空载组比较,APC组、Survivin shRNA组、双基因组平均体积、平均移植瘤重量亦减少(P<0.05),而体积抑制率、瘤重抑制率均增加(P<0.05);与双基因组比较,APC组、Survivin shRNA组移植瘤平均体积、平均重量均增加(P<0.05)。与空白组和空载组相比,APC组、Survivin shRNA组、Survivin shRNA-APC双基因组移植瘤组织Survivin mRNA和蛋白表达相对含量明显降低(P<0.05);与Survivin shRNA组、APC组相比,双基因组移植瘤组织Survivin mRNA和蛋白表达相对含量亦明显降低(P<0.05)。与空白组裸鼠移植瘤组织结肠癌细胞凋亡指数[(9.89±0.31)%]比较,APC组、Survivin shRNA组、双基因组[(31.19±1.79)%、(33.64±2.03)%、(56.72±3.17)%]明显升高(P<0.05),而APC组、Survivin shRNA组、双基因组亦较空载组[(10.06±0.43)%]明显升高(P<0.05);与Survivin shRNA组、APC组相比,Survivin shRNA-APC双基因组移植瘤组织癌细胞凋亡指数明显升高(P<0.05)。结论 Survivin shRNA-APC双基因共表达慢病毒载体能够使Survivin基因的表达水平降低,促进结肠癌细胞的凋亡,抑制移植瘤的生长,且优于单个基因的影响。 展开更多

关键词 皮下移植瘤 双基因共表达慢病毒载体 Survivin shRNA APC HT-29

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Vasohibin-2慢病毒过表达载体的构建及相关增殖功能研究 被引量：1

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作者 孙杰 涂敏 +2 位作者 卫积书 高文涛 苗毅 《南京医科大学学报（自然科学版）》 CAS CSCD 北大核心 2013年第6期732-737,共6页

目的:构建Vasohibin-2(VASH2)慢病毒过表达载体,获得稳定表达的肝癌细胞株HepG2,并观察其对HepG2增殖的影响。方法:通过逆转录、PCR技术从细胞总RNA中获得VASH2目的基因,引入NheⅠ和PstⅠ酶切位点,连接到pTA2 vector中,经NheⅠ和PstⅠ... 目的:构建Vasohibin-2(VASH2)慢病毒过表达载体,获得稳定表达的肝癌细胞株HepG2,并观察其对HepG2增殖的影响。方法:通过逆转录、PCR技术从细胞总RNA中获得VASH2目的基因,引入NheⅠ和PstⅠ酶切位点,连接到pTA2 vector中,经NheⅠ和PstⅠ双酶切后再连接到Lv-CMV-EGFP vector中,并对重组后的质粒进行双酶切和测序分析;VASH2过表达载体、pVSV-G及delta8.91 3个质粒共转染293T细胞,获得慢病毒感染肝癌细胞株HepG2,经流式细胞仪分选阳性细胞;提取细胞总RNA和总蛋白,利用real-time PCR和Western blot鉴定稳转细胞株中VASH2的表达,用MTT法和细胞周期法检测各组HepG2的增殖能力。结果:成功构建VASH2慢病毒过表达载体,感染肝癌细胞株HepG2后能够稳定高表达VASH2;稳定高表达VASH2的HepG2增殖能力明显增强(P<0.05)。结论:成功构建了VASH2慢病毒过表达载体,并发现VASH2可以促进HepG2的增殖能力,这为进一步研究VASH2在肝癌中的功能及作用机制奠定了基础。 展开更多

关键词 Vasohibin-2 慢病毒过表达载体 细胞增殖

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STUB1基因RNA干扰慢病毒载体的构建与鉴定 被引量：3

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作者 赵虹 张惊宇 +2 位作者 徐万海 杨子超 赵庆杰 《浙江大学学报（医学版）》 CAS CSCD 北大核心 2010年第6期623-627,共5页

目的:构建人STUB1基因RNA干扰(RNA interference,RNAi)慢病毒表达载体并进行鉴定。方法:针对筛选确定的人STUB1基因RNAi有效靶点序列,合成靶序列的Oligo DNA,退火形成双链DNA,与经AgeI和EcoRI酶切后的pMagic 4.0载体连接,产生短发卡RNA... 目的:构建人STUB1基因RNA干扰(RNA interference,RNAi)慢病毒表达载体并进行鉴定。方法:针对筛选确定的人STUB1基因RNAi有效靶点序列,合成靶序列的Oligo DNA,退火形成双链DNA,与经AgeI和EcoRI酶切后的pMagic 4.0载体连接,产生短发卡RNA慢病毒载体。PCR筛选阳性克隆,测序鉴定,并包装成慢病毒颗粒。结果:PCR鉴定与DNA测序证实,合成的含STUB1 shRNA慢病毒载体寡核苷酸链插入正确。STUB1 shRNA慢病毒载体在293T细胞中成功包装成慢病毒颗粒。结论:成功构建人STUB1基因RNAi慢病毒载体以及包装成功慢病毒颗粒,为研究STUB1在胶质瘤发生发展过程中相关信号通路的作用,提供了稳定感染细胞的载体。 展开更多

关键词 基因 RNA干扰 慢病毒载体 构建与鉴定 RNA interference LENTIVIRAL vector 慢病毒颗粒 慢病毒表达载体 构建人 包装 RNAi 胶质瘤发生 寡核苷酸链 shRNA DNA测序 载体连接 阳性克隆 信号通路 筛选确定 合成

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TRADD慢病毒载体构建及其对增生性瘢痕成纤维细胞增殖的影响 被引量：1

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作者 袁月 康秀峰 +3 位作者 牟东 薛世祥 代剑华 彭贵勇 《第三军医大学学报》 CAS CSCD 北大核心 2012年第9期848-851,共4页

目的构建抗食管支架术后再狭窄携人TRADD基因慢病毒表达载体,并检测其对增生性瘢痕成纤维细胞增殖的影响。方法以购买的人TRADD基因为模板,采用PCR法扩增目的基因片段,PCR产物经回收纯化后与线性化的慢病毒表达载体pLVX-EGFP-3FLAG-Pur... 目的构建抗食管支架术后再狭窄携人TRADD基因慢病毒表达载体,并检测其对增生性瘢痕成纤维细胞增殖的影响。方法以购买的人TRADD基因为模板,采用PCR法扩增目的基因片段,PCR产物经回收纯化后与线性化的慢病毒表达载体pLVX-EGFP-3FLAG-Puro重组。重组质粒转化DH5α感受态细胞。菌落PCR鉴定转化子,阳性克隆测序无误后,质粒共转染293FT细胞制备慢病毒。Real-time定量PCR法检测病毒滴度。Western blot检测TRADD-GFP-FLAG融合蛋白的表达。MTT法检测TRADD基因慢病毒对增生性瘢痕成纤维细胞增殖的影响。结果菌落PCR扩增产物经凝胶电泳,阳性克隆得到1 200 bp片段,基因测序显示重组质粒中TRADD序列与GenBank中序列一致。包装产生的慢病毒转染293 FT细胞48 h后,荧光显微镜下可见大量绿色荧光,病毒滴度为3.22×108IU/ml,Western blot检测到融合蛋白TRADD-GFP-FLAG在293FT细胞中获得有效表达,MTT法证实该融合蛋白具有生物活性,能有效抑制瘢痕成纤维细胞增殖。结论成功构建并包装了pLVX-TRADD-EGFP-3FLAG-Puro慢病毒表达载体,其可明显抑制增生性瘢痕成纤维细胞的增殖。 展开更多

关键词 TRADD 慢病毒表达载体 食管再狭窄 基因治疗

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Peroxiredoxin 2基因慢病毒载体的构建及对结直肠癌SW480细胞增殖的影响

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作者 冯继红 傅仲学 +4 位作者 文坤明 张寿儒 卢伟东 王昊 吴星烨 《中国免疫学杂志》 CAS CSCD 北大核心 2014年第8期1078-1082,共5页

目的:构建Peroxiredoxin 2(Prdx2)基因慢病毒表达载体,建立能够稳定高表达Prdx2的结直肠癌SW480细胞株,研究Prdx2的高表达对SW480细胞生长增殖的影响。方法:利用PCR扩增Prdx2编码区片段,克隆插入载体Ubi-MCS-EGFP-IRES-Puromycin(GV218)... 目的:构建Peroxiredoxin 2(Prdx2)基因慢病毒表达载体,建立能够稳定高表达Prdx2的结直肠癌SW480细胞株,研究Prdx2的高表达对SW480细胞生长增殖的影响。方法:利用PCR扩增Prdx2编码区片段,克隆插入载体Ubi-MCS-EGFP-IRES-Puromycin(GV218)中,构建Ubi-Prdx2-EGFP-Puromycin(LV-Prdx2)慢病毒表达载体,包装产生慢病毒颗粒,鉴定后将其转染SW480细胞,荧光显微镜观察细胞绿色荧光蛋白表达;应用实时荧光定量逆转录聚合酶链反应(qRT-PCR)和Western blot方法检测SW480细胞中Prdx2的mRNA和蛋白水平表达情况;MTT法检测细胞生长情况;平板克隆形成实验检测细胞克隆形成能力。结果:构建的重组慢病毒表达载体Ubi-Prdx2-EGFP-Puromycin(LV-Prdx2)经鉴定正确;慢病毒转染SW480细胞后,细胞中Prdx2在mRNA和蛋白水平高表达。MTT法及平板克隆形成实验结果显示Prdx2高表达的SW480细胞增殖能力显著增强(P<0.05)。结论:成功构建Prdx2基因慢病毒表达载体Ubi-Prdx2-EGFP-Puromycin,筛选出稳定高表达Prdx2的SW480细胞株;高表达的Prdx2分子可显著促进结直肠癌SW480细胞增殖。 展开更多

关键词 结直肠癌 SW480 过氧化还原蛋白酶2 慢病毒表达载体

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miR-186过表达慢病毒载体的构建及鉴定 被引量：3

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作者 李胜男 王梦旭 +3 位作者 胡伟东 陈少凤 陈杏兰 李友 《吉林大学学报（医学版）》 CAS CSCD 北大核心 2019年第5期997-1002,I0001,共7页

目的:构建miR-186过表达慢病毒载体并包装慢病毒,探讨miR-186在人胚胎肾细胞(HEK)293T细胞系中的感染效率和表达水平。方法:以Hsa-miR-186前体序列为模板,设计并合成引物,PCR法扩增pre-miR-186基因序列,并将其克隆到携带EGFP/Puromycin... 目的:构建miR-186过表达慢病毒载体并包装慢病毒,探讨miR-186在人胚胎肾细胞(HEK)293T细胞系中的感染效率和表达水平。方法:以Hsa-miR-186前体序列为模板,设计并合成引物,PCR法扩增pre-miR-186基因序列,并将其克隆到携带EGFP/Puromycin的慢病毒载体FV040中,经EcoRⅠ和AgeⅠ酶切及测序鉴定后获得重组慢病毒载体。利用Lipofectamine2000将重组慢病毒质粒FV040Vector和FV040miR-186分别与辅助质粒通过共转染至HEK293T细胞中,48h后收集慢病毒,以FV040Vector慢病毒作为对照组,FV040miR-186作为实验组,分别感染HEK293T细胞。感染48h后,观察HEK293T细胞中绿色荧光的分布情况,并采用实时荧光定量PCR法检测miR-186的表达水平。结果:测序分析,miR-186过表达慢病毒与GenBank上公布的miR-186序列完全一致。与对照组(0.838 7±0.145 6)比较,实验组HEK293T细胞中miR-186表达水平(12.640 0±0.788 4)明显升高(t=14.72,P<0.01),约为对照组的15.07倍。结论:成功构建miR-186过表达慢病毒载体并包装出慢病毒,miR-186慢病毒成功感染HEK293T细胞,miR-186表达水平在HEK293T细胞中明显升高。 展开更多

关键词 miR-186 慢病毒 HEK293T细胞 过表达慢病毒载体 绿色荧光蛋白

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