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水牛miR-302s真核表达载体的构建及生物信息学分析
1
作者
乔树叶
黄时海
+4 位作者
邓彦飞
邓海莹
罗婵
石德顺
李湘萍
《中国畜牧兽医》
CAS
北大核心
2019年第9期2497-2506,共10页
试验旨在克隆并构建水牛miR-302s慢病毒真核表达载体(bbu-miR-302s),对其进行生物信息学分析,并尝试将该载体应用于水牛体细胞重编程中。以水牛基因组DNA为模板扩增得到bbu-miR-302s前体序列,测序正确后将其连入pLVX-IRES-ZsGreen1构建...
试验旨在克隆并构建水牛miR-302s慢病毒真核表达载体(bbu-miR-302s),对其进行生物信息学分析,并尝试将该载体应用于水牛体细胞重编程中。以水牛基因组DNA为模板扩增得到bbu-miR-302s前体序列,测序正确后将其连入pLVX-IRES-ZsGreen1构建重组慢病毒真核表达载体。重组的慢病毒真核表达载体经过酶切鉴定正确后,采用脂质体转染方法包装慢病毒颗粒,通过感染HEK-293T细胞及猪和水牛体细胞,检测重组慢病毒载体的有效性。bbu-miR-302s有效感染水牛胎儿成纤维细胞(BFF)后,经诱导培养,检测能否产生水牛诱导多能干细胞(iPSC)。采用CoGeMiR数据库查询法和SnapGene Viewer软件进行miR-302s家族在基因组中的定位分析;利用ClustalX 1.83软件分析miR-302s序列保守性;利用TargetScan和miRWalk软件预测bbu-miR-302s主要的靶基因,并运用DAVID程序对靶基因进行信号通路富集。测序结果显示,扩增获得的序列是水牛miR-302s家族,包装的重组慢病毒滴度为7.2×10 6 TU/mL,并可以有效感染3个物种的体细胞。bbu-miR-302s病毒感染BFF后,细胞经历形态变化并发生聚集形成克隆样,碱性磷酸酶检测阳性,但多能基因及表面抗原检测结果均为阴性,说明单因子miR-302s不足以完全重编程BFF为水牛iPSC,但促进了重编程进程。CoGeMiR数据库检索发现,miR-302s家族主要位于LARP 7基因的内含子区;SnapGene Viewer软件进一步分析发现,bbu-miR-302s位于水牛7号染色体LARP 7基因的内含子区。序列同源性分析表明,miR-302s家族成员间及miR-302s簇成员在不同物种间均高度保守。水牛miR-302s主要靶基因共255个,这些靶基因主要集中在33个信号通路中,其中PGK信号通路与胰高血糖素信号转导及调控干细胞信号通路最为显著。本研究结果为后续开展miR-302s簇在体细胞重编程中的作用奠定基础。
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关键词
bbu-miR-302s
慢病毒真核载体
生物信息学分析
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职称材料
题名
水牛miR-302s真核表达载体的构建及生物信息学分析
1
作者
乔树叶
黄时海
邓彦飞
邓海莹
罗婵
石德顺
李湘萍
机构
广西大学
广西大学生命科学技术学院
广西大学动物科学技术学院
出处
《中国畜牧兽医》
CAS
北大核心
2019年第9期2497-2506,共10页
基金
国家自然科学基金(31560632)
广西自然科学基金(2016GXNSFDA380030)
文摘
试验旨在克隆并构建水牛miR-302s慢病毒真核表达载体(bbu-miR-302s),对其进行生物信息学分析,并尝试将该载体应用于水牛体细胞重编程中。以水牛基因组DNA为模板扩增得到bbu-miR-302s前体序列,测序正确后将其连入pLVX-IRES-ZsGreen1构建重组慢病毒真核表达载体。重组的慢病毒真核表达载体经过酶切鉴定正确后,采用脂质体转染方法包装慢病毒颗粒,通过感染HEK-293T细胞及猪和水牛体细胞,检测重组慢病毒载体的有效性。bbu-miR-302s有效感染水牛胎儿成纤维细胞(BFF)后,经诱导培养,检测能否产生水牛诱导多能干细胞(iPSC)。采用CoGeMiR数据库查询法和SnapGene Viewer软件进行miR-302s家族在基因组中的定位分析;利用ClustalX 1.83软件分析miR-302s序列保守性;利用TargetScan和miRWalk软件预测bbu-miR-302s主要的靶基因,并运用DAVID程序对靶基因进行信号通路富集。测序结果显示,扩增获得的序列是水牛miR-302s家族,包装的重组慢病毒滴度为7.2×10 6 TU/mL,并可以有效感染3个物种的体细胞。bbu-miR-302s病毒感染BFF后,细胞经历形态变化并发生聚集形成克隆样,碱性磷酸酶检测阳性,但多能基因及表面抗原检测结果均为阴性,说明单因子miR-302s不足以完全重编程BFF为水牛iPSC,但促进了重编程进程。CoGeMiR数据库检索发现,miR-302s家族主要位于LARP 7基因的内含子区;SnapGene Viewer软件进一步分析发现,bbu-miR-302s位于水牛7号染色体LARP 7基因的内含子区。序列同源性分析表明,miR-302s家族成员间及miR-302s簇成员在不同物种间均高度保守。水牛miR-302s主要靶基因共255个,这些靶基因主要集中在33个信号通路中,其中PGK信号通路与胰高血糖素信号转导及调控干细胞信号通路最为显著。本研究结果为后续开展miR-302s簇在体细胞重编程中的作用奠定基础。
关键词
bbu-miR-302s
慢病毒真核载体
生物信息学分析
Keywords
bbu-miR-302s
lentivirus eukaryotic vector
bioinformatics analysis
分类号
Q78 [生物学—分子生物学]
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职称材料
题名
作者
出处
发文年
被引量
操作
1
水牛miR-302s真核表达载体的构建及生物信息学分析
乔树叶
黄时海
邓彦飞
邓海莹
罗婵
石德顺
李湘萍
《中国畜牧兽医》
CAS
北大核心
2019
0
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