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SOX17过表达慢病毒载体和稳定转染细胞系的构建
1
作者
黄少婷
李友
+3 位作者
吴钊淳
何嘉文
廖科棋
李胜男
《吉林大学学报（医学版）》
CAS
CSCD
北大核心
2023年第6期1424-1430,共7页
目的:构建性别决定区Y盒17 (SOX17)过表达慢病毒载体,使用SOX17过表达慢病毒感染PC12细胞并建立稳定过表达SOX17的细胞系。方法:在NCBI数据库中查找、设计并合成SOX17过表达序列,将其与经Bam HⅠ和AgeⅠ双酶切的慢病毒GV492载体连接,构...
目的:构建性别决定区Y盒17 (SOX17)过表达慢病毒载体,使用SOX17过表达慢病毒感染PC12细胞并建立稳定过表达SOX17的细胞系。方法:在NCBI数据库中查找、设计并合成SOX17过表达序列,将其与经Bam HⅠ和AgeⅠ双酶切的慢病毒GV492载体连接,构建GV492-SOX17过表达重组质粒。琼脂糖凝胶电泳鉴定PCR产物,筛选携带GV492-SOX17过表达重组质粒的阳性菌,克隆后测序。将GV492空载质粒和GV492-SOX17过表达重组质粒分别转染至人胚肾HEK 293T细胞中,转染48 h后收集GV492对照慢病毒和GV492-SOX17过表达慢病毒进行包装并测定病毒滴度。将PC12细胞分为空白组、GV492对照组和GV492-SOX17组,空白组不作处理,GV492对照组和GV492-SOX17组分别采用相应慢病毒感染细胞(感染复数=100),10 mg·L^(-1)嘌呤霉素筛选成功感染慢病毒的PC12细胞,荧光显微镜观察各组PC12细胞生长状态及绿色荧光表达情况。采用实时荧光定量PCR (RT-qPCR)法检测各组PC12细胞中SOX17 mRNA表达水平,Western blotting法检测各组PC12细胞中SOX17蛋白表达水平。结果:GV492-SOX17过表达重组质粒的基因片段长度约为744 bp,GV492-SOX17过表达重组质粒基因序列与设计合成的SOX17过表达序列一致。GV492对照慢病毒和GV492-SOX17过表达慢病毒滴度均为2.5×108TU·mL^(-1)。各组PC12细胞生长状态良好且有绿色荧光表达。RT-qPCR法检测,与空白组和GV492对照组比较,GV492-SOX17组PC12细胞中SOX17 mRNA表达水平明显升高(P<0.01)。Western blotting法检测,各组细胞在相对分子质量44 000处出现特异性条带,提示PC12细胞中SOX17蛋白表达成功;与空白组和GV492对照组比较,GV492-SOX17组PC12细胞中SOX17蛋白表达水平升高(P<0.05)。结论:成功构建了GV492-SOX17慢病毒表达载体,建立了稳定过表达GV492-SOX17的PC12细胞系。
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关键词
性别决定区y盒17
慢病毒载体
PC12细胞
实时荧光定量PCR
感染复数
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职称材料
题名
SOX17过表达慢病毒载体和稳定转染细胞系的构建
1
作者
黄少婷
李友
吴钊淳
何嘉文
廖科棋
李胜男
机构
广东医科大学广东省衰老相关心脑疾病重点实验室
广东医科大学附属医院神经病学研究所
出处
《吉林大学学报（医学版）》
CAS
CSCD
北大核心
2023年第6期1424-1430,共7页
基金
国家自然科学基金项目(81571157)
广东省卫生厅医学科研基金项目(A2022139)
+1 种基金
广东省湛江市科技局科技攻关计划项目(2021B01370)
广东医科大学青年培育基金项目(GDMUQ2021006)。
文摘
目的:构建性别决定区Y盒17 (SOX17)过表达慢病毒载体,使用SOX17过表达慢病毒感染PC12细胞并建立稳定过表达SOX17的细胞系。方法:在NCBI数据库中查找、设计并合成SOX17过表达序列,将其与经Bam HⅠ和AgeⅠ双酶切的慢病毒GV492载体连接,构建GV492-SOX17过表达重组质粒。琼脂糖凝胶电泳鉴定PCR产物,筛选携带GV492-SOX17过表达重组质粒的阳性菌,克隆后测序。将GV492空载质粒和GV492-SOX17过表达重组质粒分别转染至人胚肾HEK 293T细胞中,转染48 h后收集GV492对照慢病毒和GV492-SOX17过表达慢病毒进行包装并测定病毒滴度。将PC12细胞分为空白组、GV492对照组和GV492-SOX17组,空白组不作处理,GV492对照组和GV492-SOX17组分别采用相应慢病毒感染细胞(感染复数=100),10 mg·L^(-1)嘌呤霉素筛选成功感染慢病毒的PC12细胞,荧光显微镜观察各组PC12细胞生长状态及绿色荧光表达情况。采用实时荧光定量PCR (RT-qPCR)法检测各组PC12细胞中SOX17 mRNA表达水平,Western blotting法检测各组PC12细胞中SOX17蛋白表达水平。结果:GV492-SOX17过表达重组质粒的基因片段长度约为744 bp,GV492-SOX17过表达重组质粒基因序列与设计合成的SOX17过表达序列一致。GV492对照慢病毒和GV492-SOX17过表达慢病毒滴度均为2.5×108TU·mL^(-1)。各组PC12细胞生长状态良好且有绿色荧光表达。RT-qPCR法检测,与空白组和GV492对照组比较,GV492-SOX17组PC12细胞中SOX17 mRNA表达水平明显升高(P<0.01)。Western blotting法检测,各组细胞在相对分子质量44 000处出现特异性条带,提示PC12细胞中SOX17蛋白表达成功;与空白组和GV492对照组比较,GV492-SOX17组PC12细胞中SOX17蛋白表达水平升高(P<0.05)。结论:成功构建了GV492-SOX17慢病毒表达载体,建立了稳定过表达GV492-SOX17的PC12细胞系。
关键词
性别决定区y盒17
慢病毒载体
PC12细胞
实时荧光定量PCR
感染复数
Keywords
Sex-determined region
y
box
17
Lentiviral vector
PC12 cells
Real-time fluorescence quantitative PCR
Multiplicit
y
of infection
分类号
Q254 [生物学—细胞生物学]
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职称材料
题名
作者
出处
发文年
被引量
操作
1
SOX17过表达慢病毒载体和稳定转染细胞系的构建
黄少婷
李友
吴钊淳
何嘉文
廖科棋
李胜男
《吉林大学学报（医学版）》
CAS
CSCD
北大核心
2023
0
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