为建立一种基于微滴式数字PCR(droplet digital PCR,dd PCR)的高特异性、高灵敏度,且可绝对定量检测流产衣原体(Chlamydia abortus,C.abortus)的方法,针对流产衣原体ompA基因设计特异性引物和探针,建立并优化ddPCR反应条件,并对该方法...为建立一种基于微滴式数字PCR(droplet digital PCR,dd PCR)的高特异性、高灵敏度,且可绝对定量检测流产衣原体(Chlamydia abortus,C.abortus)的方法,针对流产衣原体ompA基因设计特异性引物和探针,建立并优化ddPCR反应条件,并对该方法的特异性、灵敏度以及重复性进行评估。结果显示,所建立ddPCR方法的最低检测限为1.76 copies/μL,灵敏度高;与贝氏柯克斯体、牛分枝杆菌、动物布鲁氏菌、李氏杆菌、金黄色葡萄球菌、鹦鹉热衣原体均无交叉反应,特异性强;组内和组间重复试验变异系数均小于10%,重复性好。用建立的ddPCR方法检测20份疑似感染临床样品,发现其检出率高于荧光PCR方法。结果表明,本研究建立的ddPCR方法特异性强、灵敏度高、重复性好,为流产衣原体感染的快速诊断和精准防控提供了有效手段,具有广泛的应用前景。展开更多
目的建立基于微滴式数字PCR(droplet digital PCR,ddPCR)技术快速检测重症患者侵袭性念珠菌感染的方法。方法基于微滴式数字PCR平台建立检测体系,设计四种念珠菌(白色念珠菌、光滑念珠菌、近平滑念珠菌和热带滑念珠菌)特异性引物探针;(1...目的建立基于微滴式数字PCR(droplet digital PCR,ddPCR)技术快速检测重症患者侵袭性念珠菌感染的方法。方法基于微滴式数字PCR平台建立检测体系,设计四种念珠菌(白色念珠菌、光滑念珠菌、近平滑念珠菌和热带滑念珠菌)特异性引物探针;(1)对无模板对照(no tmplate contral,NTC)样品进行检测,确定空白限(limit of blank,LOB)范围和阳性判断值;(2)通过对阳性样本进行稀释,每个浓度梯度各进行10次重复提取检测,确定检测限(limit of detection,LOD)范围;(3)重复检测稀释后的样本,确定定量限(limit of quantitation,LOQ)范围;(4)对阳性样品进行梯度稀释,确定线性范围;(5)通过2个高低浓度的阳性样本提取检测,进行12次重复性测试,计算结果浓度对数值的变异系数(CV);(6)通过具有真菌培养结果的临床样本进行检测,评估方法可靠度。结果ddPCR检测念珠菌LOB在0~81 copies/mL之间,阳性判断值为≥3个阳性微滴;LOD为3×10^(2) copies/mL;LOQ为3×10^(2) copies/mL;不同浓度梯度检测线性范围是3×10^(2)~3×10^(7)copies/mL,相关系数为:白色念珠菌R^(2)=0.9995、光滑念珠菌R^(2)=0.9989、近平滑念珠菌R^(2)=0.9994、热带滑念珠菌R^(2)=0.999;结果浓度对数值的CV<5%,满足精密度要求;通过检测建立方法初步验证临床标本,结果与临床培养结果一致。结论ddPCR对重症患者侵袭性念珠菌感染的检测灵敏度高、重复性好,特异性高。展开更多
旨在建立检测鸡传染性喉气管炎病毒(infectious laryngotracheitis virus,ILTV)绝对定量方法。根据已发表的鸡ILTV的TK基因序列,针对其保守区域分别设计1对特异引物和1条探针,建立检测鸡ILTV的微滴式数字PCR(droplet digital PCR,ddPCR...旨在建立检测鸡传染性喉气管炎病毒(infectious laryngotracheitis virus,ILTV)绝对定量方法。根据已发表的鸡ILTV的TK基因序列,针对其保守区域分别设计1对特异引物和1条探针,建立检测鸡ILTV的微滴式数字PCR(droplet digital PCR,ddPCR)方法,并评价其特异性、敏感性和重复性。结果显示,建立方法的最佳引物浓度为20μmol/μL,最佳探针浓度为10μmol/μL,最佳退火温度为56℃。特异性检测结果显示,建立的方法只检出ILTV,没有检出其他病原株。敏感性检测结果显示,采用建立的方法定量检出ILTV重组质粒标准品的最低限为4.6拷贝/μL。对3个连续稀释的pMD18-ILTV重组质粒DNA进行检测,3次重复检测结果的变异系数均小于5%。对83份病鸡喉拭子、肺及脾组织样品进行检测,采用建立的ddPCR检出ILTV阳性样品10份,荧光定量PCR检出ILTV阳性样品9份,ddPCR的阳性检出率(12.05%)高于荧光定量PCR的阳性检出率(10.84%)。结果表明,建立的ddPCR方法定量检测ILTV特异性强、敏感性高、重复性好,为绝对定量检测ILTV提供更好的技术支撑。展开更多
文摘目的建立基于微滴式数字PCR(droplet digital PCR,ddPCR)技术快速检测重症患者侵袭性念珠菌感染的方法。方法基于微滴式数字PCR平台建立检测体系,设计四种念珠菌(白色念珠菌、光滑念珠菌、近平滑念珠菌和热带滑念珠菌)特异性引物探针;(1)对无模板对照(no tmplate contral,NTC)样品进行检测,确定空白限(limit of blank,LOB)范围和阳性判断值;(2)通过对阳性样本进行稀释,每个浓度梯度各进行10次重复提取检测,确定检测限(limit of detection,LOD)范围;(3)重复检测稀释后的样本,确定定量限(limit of quantitation,LOQ)范围;(4)对阳性样品进行梯度稀释,确定线性范围;(5)通过2个高低浓度的阳性样本提取检测,进行12次重复性测试,计算结果浓度对数值的变异系数(CV);(6)通过具有真菌培养结果的临床样本进行检测,评估方法可靠度。结果ddPCR检测念珠菌LOB在0~81 copies/mL之间,阳性判断值为≥3个阳性微滴;LOD为3×10^(2) copies/mL;LOQ为3×10^(2) copies/mL;不同浓度梯度检测线性范围是3×10^(2)~3×10^(7)copies/mL,相关系数为:白色念珠菌R^(2)=0.9995、光滑念珠菌R^(2)=0.9989、近平滑念珠菌R^(2)=0.9994、热带滑念珠菌R^(2)=0.999;结果浓度对数值的CV<5%,满足精密度要求;通过检测建立方法初步验证临床标本,结果与临床培养结果一致。结论ddPCR对重症患者侵袭性念珠菌感染的检测灵敏度高、重复性好,特异性高。
文摘旨在建立检测鸡传染性喉气管炎病毒(infectious laryngotracheitis virus,ILTV)绝对定量方法。根据已发表的鸡ILTV的TK基因序列,针对其保守区域分别设计1对特异引物和1条探针,建立检测鸡ILTV的微滴式数字PCR(droplet digital PCR,ddPCR)方法,并评价其特异性、敏感性和重复性。结果显示,建立方法的最佳引物浓度为20μmol/μL,最佳探针浓度为10μmol/μL,最佳退火温度为56℃。特异性检测结果显示,建立的方法只检出ILTV,没有检出其他病原株。敏感性检测结果显示,采用建立的方法定量检出ILTV重组质粒标准品的最低限为4.6拷贝/μL。对3个连续稀释的pMD18-ILTV重组质粒DNA进行检测,3次重复检测结果的变异系数均小于5%。对83份病鸡喉拭子、肺及脾组织样品进行检测,采用建立的ddPCR检出ILTV阳性样品10份,荧光定量PCR检出ILTV阳性样品9份,ddPCR的阳性检出率(12.05%)高于荧光定量PCR的阳性检出率(10.84%)。结果表明,建立的ddPCR方法定量检测ILTV特异性强、敏感性高、重复性好,为绝对定量检测ILTV提供更好的技术支撑。
