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题名新一代基因编码5-羟色胺荧光探针优化及应用
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作者
徐慕凡
张坤
王静怡
高欣柯
程傲冰
张鹏
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机构
上海交通大学基础医学院药理学与化学生物学系
广东省广州市第一人民医院麻醉科
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出处
《上海交通大学学报(医学版)》
北大核心
2025年第5期529-537,共9页
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基金
国家自然科学基金(82102184)
上海市高水平地方高校建设项目(PT21011)
+3 种基金
2023年上海“科技创新行动计划”自然科学基金项目(23ZR1436800)
国家中医药管理局高水平中医药学科建设项目(ZYYZDXK-2023070)
阿尔茨海默病协会研究基金(AARF-19-619387)
上海市高水平地方高校建设项目2024年“中西医结合研究平台”建设项目(ZXY24006)。
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文摘
目的·优化基于细菌周质结合蛋白(periplasmic binding proteins,PBPs)设计的基因编码5-羟色胺(5-hydroxytryptamine,5-HT)荧光探针iSeroSnFR,以提高其在体内外5-HT检测中的荧光反应和时空分辨率,从而为相关研究提供更为精确的工具。方法·采用Gibson重组技术,将原始探针iSeroSnFR(以下称为iSeroSnFR1.0)中的循环重排超折叠绿色荧光蛋白(circularly permuted superfolder green fluorescence protein,cpsfGFP)替换为源自乙酰胆碱荧光探针iAChSnFR的cpsfGFP基因序列,构建新型基因编码的5-HT探针iSeroSnFR1.2。在HEK293细胞中过表达这2种探针,并利用压力给药系统瞬时加入外源性5-HT,比较其荧光反应动态范围和动力学特性。此外,为模拟生理环境,利用Sindbis病毒将探针表达于体外培养的原代小鼠皮层神经元,通过电刺激诱导神经元释放内源性5-HT,以进一步评估2种探针在检测内源性5-HT方面的性能。结果·在HEK293细胞中,iSeroSnFR1.2对外源性5-HT的荧光响应(ΔF/F_(0))是iSeroSnFR1.0的1.5倍。与iSeroSnFR1.0(上升时间44.9 ms和衰减时间常数1730.4 ms)相比,iSeroSnFR1.2的上升时间(36.3 ms)和衰减时间常数(1003.6 ms)分别缩短了19.1%和42.0%。在原代小鼠皮层神经元中,iSeroSnFR1.2对电刺激诱导的内源性5-HT释放的荧光反应为iSeroSnFR1.0的2.7倍,上升时间和下降时间分别缩短了44.0%和26.7%。此外,iSeroSnFR1.2还表现出更高的基底荧光强度,有利于在高背景环境中进行成像。结论·优化后的iSeroSnFR1.2显著提高了对5-HT检测的荧光响应和时间分辨率,为体内外5-HT动态检测研究提供了更为有力的工具,有望促进神经科学、精神医学等领域对5-HT在各种生理和病理过程中作用机制的深入理解。
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关键词
基因编码探针
5-羟色胺
循环重排超折叠绿色荧光蛋白
细菌周质结合蛋白
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Keywords
genetically encoded sensor
5-hydroxytryptamine(5-HT)
circularly permuted superfolder GFP
periplasmic binding protein
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分类号
R915
[医药卫生—微生物与生化药学]
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