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含人干细胞白血病基因慢病毒载体转染Cajal样间质细胞的效果研究 被引量：6
1
作者 于建超 王勤章 +5 位作者 王江平 钱彪 李应龙 王新敏 倪钊 李强 《中国全科医学》 CAS CSCD 北大核心 2016年第15期1796-1802,共7页
目的：观察携带增强绿色荧光蛋白（GFP）的含人干细胞白血病（SCL）基因慢病毒载体转染体外培养的豚鼠膀胱 Cajal 样间质细胞（ICC）的效果。方法2014年10月—2015年8月，选取普通级成年健康豚鼠16只。构建含人 SCL 基因的慢病毒载体，... 目的：观察携带增强绿色荧光蛋白（GFP）的含人干细胞白血病（SCL）基因慢病毒载体转染体外培养的豚鼠膀胱 Cajal 样间质细胞（ICC）的效果。方法2014年10月—2015年8月，选取普通级成年健康豚鼠16只。构建含人 SCL 基因的慢病毒载体，并标定病毒滴度；采用随机数字表法选取健康豚鼠4只，采用颈椎脱臼方法将其杀死，体外培养豚鼠膀胱 ICC。设置不同感染复数（MOI）（0.5、1.0、5.0、10.0、50.0、100.0），利用含人 SCL 基因的慢病毒载体转染 ICC，在激光共聚焦显微镜下观察 ICC 生长状态并计算转染效率，确定最佳 MOI。采用随机数字表法将 ICC 分为正常对照组、空白质粒对照组与慢病毒转染组，其中正常对照组加入1％磷酸盐缓冲液（PBS），空白质粒对照组加入空慢病毒，慢病毒转染组按最佳 MOI 加入含人 SCL 基因的慢病毒载体，计算各组转染效率，确定最佳转染时间。采用反转录-聚合酶链式反应（RT-PCR）法检测 SCL mRNA 表达情况。上述实验均独立重复4次。结果经测定，病毒滴度为5＆#215;108 TU/ ml。倒置显微镜下发现一些特征性梭形细胞，其两侧有显著外凸分枝，细胞核较大，其外形规则，有序地实现细胞贴壁，而其他未贴壁细胞则呈现与 ICC 不一样的形态，胞体多为椭圆形，细胞两极无突起，整体形状扁平。激光共聚焦显微镜下可以发现酪氨酸蛋白激酶生长因子受体（c-kit）受体成功表达，证实培养的细胞是膀胱 ICC。观察各组 ICC 生长状态，当 MOI 为0.5、1.0、5.0、10.0时，细胞生长状态较好，无细胞死亡，当 MOI为50.0、100.0时，可见部分细胞死亡，细胞活性降低；MOI 为1.0、5.0、10.0、50.0、100.0时的转染效率高于 MOI为0.5时（P ＜0.05）；MOI 为5.0、10.0、50.0、100.0时的转染效率高于 MOI 为1.0时（P ＜0.05）；MOI 为10.0、50.0、100.0时的转染效率高于 MOI 为5.0时（P ＜0.05）；MOI 为50.0、100.0时的转染效率高于 MOI 为10.0时（P＜0.05）；综合 ICC 生长状态及转染效率，确定含人 SCL 基因慢病毒载体转染 ICC 的最佳 MOI 为10.0。正常对照组、空白质粒对照组 ICC 中无 GFP 表达；慢病毒转染组转染3 d 时 ICC 中 GFP 表达强度高于转染2 d、转染5 d 时，确定含人 SCL 基因慢病毒载体转染 ICC 的最佳转染时间为3 d。慢病毒转染组中扩增产物大小与目的片段大小1036 bp 一致，而正常对照组及空白质粒对照组均未见特异性条带表达，表明 SCL 基因成功导入 ICC。结论利用含人 SCL 基因慢病毒载体能高效转染体外培养的 ICC，并成功介导 SCL 基因在 ICC 中的表达，为下一步研究利用 SCL 基因进行体内转染实验奠定基础。 展开更多
关键词 转染 干细胞白血病基因 慢病毒载体 CAJAL样间质细胞
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干细胞白血病基因药物对糖尿病膀胱病豚鼠膀胱Cajal间质细胞表面c-kit蛋白表达的影响 被引量：1
2
作者 李朋 徐浩 +3 位作者 申茂磊 赵国立 钱彪 王勤章 《医药导报》 CAS 北大核心 2020年第10期1335-1339,共5页
目的研究干细胞白血病(SCL)基因药物对糖尿病膀胱病(DCP)豚鼠受损膀胱Cajal样间质细胞(ICCs)表面c-kit蛋白表达的影响。方法选取60只健康豚鼠单次腹腔注射1%链脲佐菌素(STZ)200 mg·kg-1构建豚鼠糖尿病膀胱病模型。按随机数字表法... 目的研究干细胞白血病(SCL)基因药物对糖尿病膀胱病(DCP)豚鼠受损膀胱Cajal样间质细胞(ICCs)表面c-kit蛋白表达的影响。方法选取60只健康豚鼠单次腹腔注射1%链脲佐菌素(STZ)200 mg·kg-1构建豚鼠糖尿病膀胱病模型。按随机数字表法将27只糖尿病膀胱病豚鼠随机分为3组:实验组、阳性对照组和空白对照组,每组9只。实验组单次尿道灌注SCL基因重组慢病毒药物(滴度2×107 U)0.2 mL,阳性对照组单次尿道灌注空慢病毒液(不含SCL基因)0.2 mL,空白对照组单次尿道灌注磷酸盐缓冲液(PBS)0.2 mL。每组每次各选取3只豚鼠于灌注后第7,14,28天麻醉后取其膀胱,提取培养DCP豚鼠膀胱ICCs,于倒置显微镜下观察其细胞形态,将用绿色荧光抗体标记的ICCs置于激光共聚焦显微镜下检测ICCs细胞荧光强度,采用Western blotting检测ICCs表面c-kit蛋白的表达。结果SCL基因重组慢病毒在14 d时转染效果最佳,激光共聚焦显微镜下观察到实验组ICCs荧光强度和c-kit蛋白表达较其他两组明显增强(P<0.05),与空白对照组比较,阳性对照组ICCs荧光强度和c-kit蛋白表达差异无统计学意义(P>0.05)。结论慢病毒为载体将SCL基因药物转染入DCP膀胱后能使高糖环境下ICCs膜表面c-kit蛋白表达增强,可能有利于DCP膀胱受损的ICCs功能的恢复。 展开更多
关键词 干细胞白血病基因药物 糖尿病膀胱病 CAJAL间质细胞 C-KIT蛋白
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AdMax系统构建腺病毒载体介导SCL基因转染Cajal样间质细胞及其表达 被引量：4
3
作者 周建民 王勤章 +3 位作者 丁国富 屠松 牛世杰 杨发英 《临床与实验病理学杂志》 CAS CSCD 北大核心 2012年第1期33-37,共5页
目的构建含有人干细胞白血病(stem cell leukemia,SCL)基因的重组腺病毒载体,并观察其对豚鼠膀胱Cajal样间质细胞的转染及其介导SCL基因的表达。方法采用PCR方法从含人SCL基因质粒中扩增SCL基因,连接到腺病毒穿梭质粒的多克隆位点上,构... 目的构建含有人干细胞白血病(stem cell leukemia,SCL)基因的重组腺病毒载体,并观察其对豚鼠膀胱Cajal样间质细胞的转染及其介导SCL基因的表达。方法采用PCR方法从含人SCL基因质粒中扩增SCL基因,连接到腺病毒穿梭质粒的多克隆位点上,构建重组穿梭质粒pDC315-EGFP/SCL,在脂质体介导下与腺病毒辅助大质粒pBHGlox(delta)E1,3Cre共转染293细胞,包装产生复制缺陷型重组腺病毒pDC315-SCL经HEK293细胞扩增,纯化后测定病毒滴度。通过观察绿色荧光蛋白的表达评估重组腺病毒对Cajal样间质细胞的转染率,RT-PCR法分析转染Cajal样间质细胞后SCL mRNA的表达。结果 PCR结果和Western blot法检测证实pDC315-SCL重组腺病毒载体构建成功,滴度达到1×1010 PFU/ml,对膀胱Cajal样间质细胞的转染率高达98%,RT-PCR法检测转染Cajal样间质细胞后SCL mRNA有表达。结论成功构建pDC315-SCL重组腺病毒载体对Cajal样间质细胞有很强的转染能力,可介导SCL基因在Cajal样间质细胞的表达。 展开更多
关键词 干细胞白血病基因 腺病毒载体 转染 CAJAL样间质细胞
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SCL基因反义寡核苷酸对K562和CEM细胞系的作用 被引量：1
4
作者 郑正津 胡建达 +2 位作者 黄淑桦 王少元 吕联煌 《中国实验血液学杂志》 CAS CSCD 2002年第5期404-408,共5页
干细胞白血病 (SCL)基因是新发现的与白血病发生有关的癌基因。为进一步探讨SCL反义寡核苷酸对白血病细胞的作用 ,本研究应用SCL基因的反义硫代磷酸寡脱氧核苷酸 (AS PS ODN)分别与K562和CEM白血病细胞系作用 ,观察细胞生长、分化、凋亡... 干细胞白血病 (SCL)基因是新发现的与白血病发生有关的癌基因。为进一步探讨SCL反义寡核苷酸对白血病细胞的作用 ,本研究应用SCL基因的反义硫代磷酸寡脱氧核苷酸 (AS PS ODN)分别与K562和CEM白血病细胞系作用 ,观察细胞生长、分化、凋亡和SCLmRNA变化。结果显示 :(1 )AS PS ODN对K562和CEM细胞的生长有不同程度的抑制作用 ,并呈量效和时效关系 ;(2 )AS PS ODN作用后K562细胞联苯胺染色阳性率明显增加 ;(3)AS PS ODN作用后K562细胞发生凋亡现象 ,但未观察到CEM细胞凋亡 ;(4)AS PS ODN作用后K562细胞和CEM细胞SCLmRNA表达水平减低 ,同时CEM细胞SIL SCLmRNA表达水平也减低。结论 :AS PS ODN能特异性抑制K562和CEM细胞的增殖 ,减低SCLmRNA和SIL SCLmRNA表达水平 ,同时促进红系分化 。 展开更多
关键词 干细胞白血病基因 反义寡核苷酸 K562细胞系 CEM细胞系 SCL 表达水平 基因治疗
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SCL基因重组慢病毒上调高糖环境下Cajal间质细胞中c-kit蛋白表达 被引量：3
5
作者 申茂磊 钱彪 +3 位作者 徐浩 傅家豪 王昱琛 王勤章 《中南大学学报（医学版）》 CAS CSCD 北大核心 2019年第2期117-121,共5页
目的:探讨含人干细胞白血病(stem cell leukemia,SCL)基因重组慢病毒对高糖环境下受损Cajal间质细胞(interstitial cells of Cajal,ICC)中酪氨酸激酶受体(c-kit)蛋白表达的影响。方法:分离ICC,培养24 h贴壁,经倒置显微镜、免疫荧光鉴定... 目的:探讨含人干细胞白血病(stem cell leukemia,SCL)基因重组慢病毒对高糖环境下受损Cajal间质细胞(interstitial cells of Cajal,ICC)中酪氨酸激酶受体(c-kit)蛋白表达的影响。方法:分离ICC,培养24 h贴壁,经倒置显微镜、免疫荧光鉴定后,将ICC细胞分为对照组、高糖组,对照组加入含5 mmol/L葡萄糖的培养基,高糖组加入含20 mmol/L葡萄糖的培养基,培养48 h后;对照组不变,高糖组分成空白组、空慢病毒组和实验组3个亚组,3组分别加入PBS、空慢病毒和含SCL基因重组慢病毒5 mmol/L葡萄糖的培养基,继续培养24和48 h,采用Western印迹法检测两个时段各组中ICC中c-kit蛋白表达情况。结果:24或48 h后,空白组、空慢病毒组中ICC的c-kit蛋白表达水平均明显低于对照组,实验组中ICC中c-kit蛋白的表达水平明显均高于空白组和空慢病毒组,但是仍低于对照组(均P<0.05)。结论:SCL基因重组慢病毒可以上调高糖环境下功能受损ICC中c-kit蛋白表达量。 展开更多
关键词 干细胞白血病基因重组慢病毒 高糖 CAJAL间质细胞 C-KIT蛋白
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观察在体灌注SCL基因重组慢病毒对豚鼠糖尿病膀胱中ICC功能的影响 被引量：6
6
作者 徐浩 钱彪 +4 位作者 杨立 张思源 沈志远 邵润芃 王勤章 《石河子大学学报（自然科学版）》 CAS 北大核心 2018年第4期486-491,共6页
目的探究豚鼠糖尿病膀胱病(DCP)在经尿道灌注干细胞白血病(SCL)基因重组慢病毒后所引发的Cajal样间质细胞(ICC)电位活动的改变。方法购买健康雄性豚鼠90只,按照200 mg/kg单次腹腔注射1%的链脲佐菌素(STZ),正常喂养12周后,筛选出符合DCP... 目的探究豚鼠糖尿病膀胱病(DCP)在经尿道灌注干细胞白血病(SCL)基因重组慢病毒后所引发的Cajal样间质细胞(ICC)电位活动的改变。方法购买健康雄性豚鼠90只,按照200 mg/kg单次腹腔注射1%的链脲佐菌素(STZ),正常喂养12周后,筛选出符合DCP模型标准的的豚鼠并将其随机分为3组:实验组、阳性对照组、空白对照组。实验组经尿道灌注0.2 m L滴度为2×107IU的SCL基因重组慢病毒,阳性对照组经尿道灌注0.2 mL空慢病毒,空白对照组经尿道灌注0.2 mL PBS液。每组在转染后2、7、14、28 d这4个时间节点每次处死3只豚鼠,迅速摘取膀胱,选择胶原酶V消融法分离提取初代ICC并继续培养。72 h后运用膜片钳技术检测ICC自发及ATP诱发电位活动。结果体外通过胶原酶消融法可分离培养DCP豚鼠膀胱中ICC,运用细胞膜片钳技术观察到在无刺激条件下检测不到ICC的内向电流,而在ATP(100μmol/L)条件激发下可检测到ICC的内向电流。实验组2 d时与其他两组内向电流无明显变化,实验组SCL慢病毒转染DCP膀胱7、14、28 d时可检测到ICC内向电流比其他两组高(P<0.05),14 d达到峰值350.0±29.9pA,随后降低。阳性对照组与空白对照组随着DCP膀胱持续受损,内向电流逐步降低(P<0.05)。结论 SCL基因重组慢病毒经尿道灌注可成功转染豚鼠DCP膀胱,使受损的膀胱ICC电流幅度逐步增高,说明SCL基因对DCP膀胱中受损ICC功能有部分改善作用。 展开更多
关键词 干细胞白血病基因 糖尿病膀胱病变 重组慢病毒 CAJAL样间质细胞
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经尿道联合灌注SCL和Cx43基因慢病毒对糖尿病膀胱功能的影响
7
作者 轩留明 马路平 +4 位作者 欧阳松 孙鹏 谭明辉 张永强 王勤章 《安徽医科大学学报》 CAS 北大核心 2022年第10期1546-1551,共6页
目的探究干细胞白血病基因(SCL)重组慢病毒和缝隙连接蛋白基因(Cx43)重组慢病毒联合作用对豚鼠糖尿病膀胱(DCP)功能的影响。方法90只健康豚鼠适应性喂养1周后,按照200 mg/kg一次性腹腔注射链脲佐菌素(STZ),定期每周监测随机血糖,正常饲... 目的探究干细胞白血病基因(SCL)重组慢病毒和缝隙连接蛋白基因(Cx43)重组慢病毒联合作用对豚鼠糖尿病膀胱(DCP)功能的影响。方法90只健康豚鼠适应性喂养1周后,按照200 mg/kg一次性腹腔注射链脲佐菌素(STZ),定期每周监测随机血糖,正常饲养12周后,通过尿流动力学检查筛选出40只符合标准的豚鼠,将其随机分成4组:糖尿病组、SCL组、Cx43组、SCL+Cx43组。糖尿病组经尿道向膀胱内灌注0.2 ml不含基因的空慢病毒,SCL组、Cx43组使用同样方法分别灌注SCL慢病毒和Cx43慢病毒0.2 ml,SCL+Cx43慢病毒组经尿道灌注SCL、Cx43慢病毒各0.2 ml。转染14 d后进行尿流动力学检查,检查后处死豚鼠,并迅速摘取膀胱,进行冰冻膀胱切片及荧光双染。结果与糖尿病组相比,SCL组、Cx43组在尿流动力学检查中差异无统计学意义(P>0.05),SCL+Cx43组尿流动力学检查可见逼尿肌压力、腹压、膀胱压均有改善(P<0.05)。糖尿病组激光共聚焦可见Cajal间质细胞(ICC)的数量减少,梭形结构及细胞突起明显被破坏,出现细胞裂解状态。SCL组、Cx43组可见ICC样细胞的梭形结构和细胞突起有所改善,细胞数量无明显变化。SCL+Cx43组可见ICC样细胞的数量增多,梭形结构及细胞突起有改善,并可形成ICC-二聚体。结论经尿道联合灌注SCL和Cx43基因重组慢病毒可以成功在豚鼠DCP膀胱中转染,可恢复损伤的ICC细胞的数量及结构,并形成ICC二聚体结构,提高糖尿病膀胱逼尿肌压力,改善排尿无力、腹压排尿等特点,为治疗DCP提供了新的方向。 展开更多
关键词 糖尿病膀胱病变 CAJAL样间质细胞 干细胞白血病基因 CX43基因
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