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人干燥综合征B抗原在巴斯德毕赤酵母菌中的高效分泌表达研究 被引量:5
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作者 杨湘越 兰小鹏 +3 位作者 吴文冰 冯福英 廖剑 朱忠勇 《医学研究生学报》 CAS 2006年第11期976-979,共4页
目的:通过基因克隆在巴斯德毕赤酵母菌中表达人干燥综合征B(SS—B)抗原。方法:PCR扩增SS—B基因,与酵母菌表达载体pPIC9k重组,构建表达质粒pPIC9k—SS—B。用电穿孔法转化酵母菌SMD1168,在MD平板上筛选重组克隆,用G418快速筛选... 目的:通过基因克隆在巴斯德毕赤酵母菌中表达人干燥综合征B(SS—B)抗原。方法:PCR扩增SS—B基因,与酵母菌表达载体pPIC9k重组,构建表达质粒pPIC9k—SS—B。用电穿孔法转化酵母菌SMD1168,在MD平板上筛选重组克隆,用G418快速筛选高拷贝转化子,阳性克隆经甲醇诱导表达后,培养上清用十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS—PAGE)和免疫酶斑点法鉴定。结果:PCR产物约为1200bp,与预期1224bp接近;pPIC9k—SS-B重组阳性克隆测序结果与GenBank核酸数据库报道完全一致,双酶切鉴定正确。表达产物SS-B的相对分子质量约48000,高拷贝毕赤酵母菌转化菌显著高于低拷贝的表达水平,表达量占分泌总蛋白的60%以上,产物浓度为800~900mg/L。免疫酶斑点法证实表达产物具有天然SS—B分子的免疫原性。阴性对照菌未见目的表达条带。结论:SS—B存巴斯德毕赤酵母菌中获得高效分泌表达,为下一步研究打下了基础。 展开更多
关键词 人干燥综合征B抗原 克隆表达 巴斯德毕赤酵母菌
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人sTNFR II-IgG Fc融合蛋白在毕赤酵母菌中的表达及其产物分析 被引量:7
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作者 张义浜 施立楠 +3 位作者 唱韶红 巩新 熊凌霜 吴军 《细胞与分子免疫学杂志》 CAS CSCD 北大核心 2007年第6期515-519,共5页
目的: 在毕赤酵母菌中表达sTNFR Ⅱ-IgG Fc融合蛋白.检测融合蛋白是否形成二聚体,并对其N-糖链进行分析.方法: 从人淋巴细胞中提取总RNA, 经RT-PCR扩增目的基因sTNFRⅡ与IgG Fc, 然后利用重叠延伸PCR得到嵌合体基因sTNFRⅡ-IgG F... 目的: 在毕赤酵母菌中表达sTNFR Ⅱ-IgG Fc融合蛋白.检测融合蛋白是否形成二聚体,并对其N-糖链进行分析.方法: 从人淋巴细胞中提取总RNA, 经RT-PCR扩增目的基因sTNFRⅡ与IgG Fc, 然后利用重叠延伸PCR得到嵌合体基因sTNFRⅡ-IgG Fc, 并将其插入pPIC9载体中.以重组载体转化巴斯德毕赤酵母菌中进行克隆与表达.采用ELISA筛选高表达sTNFRⅡ-IgG Fc融合蛋白的重组毕赤酵母菌株, 对融合蛋白通过还原和非还原SDS-PAGE分析其二聚体结构, 采用L929细胞检测融合蛋白抗TNF-α的生物学活性, 最后利用荧光辅助糖电泳(FACE)分析融合蛋白的N-糖链.结果: 成功地建立了可分泌表达sTNFR Ⅱ-IgG Fc融合蛋白的重组酵母菌株, 摇瓶培养后融合蛋白的表达量为2 mg/L.SDS-PAGE和Western blot表明, 该融合蛋白能自然形成二聚体结构; 可抑制TNF-α对L929细胞的杀伤作用, 其中和5×10^4 U/L TNF-α的EC50为170 μg/L.FACE分析融合蛋白N-糖链的大小为11 ~13个糖残基.结论: 在毕赤酵母菌中成功地表达了sTNFR Ⅱ-IgG Fc融合蛋白, 为在毕赤酵母菌中表达其他的Fc融合蛋白和抗体提供了参考. 展开更多
关键词 人可溶性肿瘤坏死因子受体Ⅱ FC融合蛋白 巴斯德毕赤酵母菌 荧光辅助糖电泳
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蜱抗凝血肽与RGDS肽重组基因在毕赤酵母中的表达及活性分析 被引量:2
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作者 蒋香梅 叶彬 +2 位作者 白垚 武卫华 郑玉强 《中国人兽共患病学报》 CAS CSCD 北大核心 2008年第4期338-342,共5页
目的利用毕赤酵母表达系统进行蜱抗凝血肽-RGDS肽双功能分子重组基因的真核表达研究。方法首先将蜱抗凝血肽-RGDS肽双功能分子的重组基因的表达质粒pPIC9K/TAP经限制性内切酶SalⅠ酶切线性化后,电转化酵母菌株GS115感受态细胞,并经MD平... 目的利用毕赤酵母表达系统进行蜱抗凝血肽-RGDS肽双功能分子重组基因的真核表达研究。方法首先将蜱抗凝血肽-RGDS肽双功能分子的重组基因的表达质粒pPIC9K/TAP经限制性内切酶SalⅠ酶切线性化后,电转化酵母菌株GS115感受态细胞,并经MD平板与MM平板、G418抗性筛选,PCR鉴定,得到重组酵母工程菌GS115/pPIC9K-TAP,经甲醇诱导分泌表达并对表达产物进行初步鉴定。结果蜱抗凝血肽-RGDS肽双功能分子重组基因在毕赤酵母中获得成功表达,表达产物有抗凝血因子活性和抗血小板的作用。结论蜱抗凝血肽-RGDS肽双功能分子重组基因在毕赤酵母中获得分泌性表达,表达产物显示抗凝血因子活性和抗血小板的作用。 展开更多
关键词 抗凝血 巴斯德毕赤酵母菌 表达
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